专利名称：通过蛋白质图谱检测肾病的方法
技术领域：
本发明涉及改进的检测早期肾病和/或疾病的肾病并发症，尤其是糖尿病的肾病并发症的方法。
背景技术：
尿中出现过多的蛋白如白蛋白，表明患有肾病。糖尿病肾病就是这样一种疾病。
本申请人发现蛋白包括白蛋白，在正常情况下是以天然蛋白和片段的混合物形式分泌的，所述片段是在肾通过过程中特异产生的(Osicka T.M等，Nephrology，2199-212(1996))。在肾通过过程中，蛋白被包括肾小管细胞的后肾小球(基膜)严重降解。肾小管细胞中的溶酶体负责降解在肾通过中分泌的蛋白。
图1所示为滤过的完整白蛋白进入肾小管细胞以及白蛋白降解成可分泌白蛋白片段的进程。降解产物分泌进入肾小管腔。在正常个体中，尿中大部分是白蛋白片段。
当溶酶体活性降低，或指导底物进入溶酶体的胞内加工减缓时，更多高分子量和基本上是全长的白蛋白就会出现在尿中。这反映了肾组织中细胞加工失衡。
本申请人发现，当蛋白，包括主要的血浆蛋白如白蛋白和免疫球蛋白，被肾过滤时，分泌前它们便被肾细胞所降解(参看PCT公布的申请WO00/37944)。滤过蛋白有可能被肾小管细胞吸收。肾小管细胞位于肾滤过之外，和初级滤液直接接触。当蛋白被肾小管细胞内化后，它们被导向到溶酶体，在溶酶体中，它们被部分降解为不同大小的片段，然后回吐到外面细胞中。这些回吐的片段，其中至少60种不同的片段可由任何一种特定类型的蛋白产生，然后被分泌到尿中。
本申请人发现，肾病中蛋白质片段化被抑制。这意味着，在患有肾病的患者中，滤过蛋白基本以全长形式分泌。分泌蛋白从片段化转变成片段化被抑制是开发新药和诊断分析的基础。例如，随糖尿病并发症发作出现的初始变化是和分泌白蛋白片段化图谱中的变化相关的。这会导致明显的微量白蛋白尿，意味着糖尿病性肾变向前发展了。这很可能是因为抑制了糖尿病患者肾小管细胞中的溶酶体活性所致。因此，可以配制一些药物用来激活糖尿病人肾病并发症发生部位中溶酶体的活性。这些药物也可用于其它的影响溶酶体活性的肾病，或在非肾组织中溶酶体的活性被关闭的情况下，也用于没有肾病并发症的糖尿病。这些药物包括抗增生药物如抗癌药物。
然而，等到检测到白蛋白过剩时，肾病已经向前发展了，很可能到了不可逆的时期，这时治疗已没什么效果了。因此，本领域一直需要提供一种检测方法，它比现在已知的放射性免疫测定法更灵敏，它可以尽早检测到这种疾病，因此，就可以在这种疾病发生的早期用一种方案去防止或治疗这样的疾病。
然而，以前曾试图把尿蛋白图谱用于临床诊断目的，它的有效性令人十分失望，部分是因为这些技术不能重复，灵敏度不高以及不能迅速检测。因此，一直以来就有必要对这些方法进行改进，而这些改进的方法可以在肾病和/或肾病并发症，尤其是糖尿病的肾病并发症早期进行检测。
发明概述在一个实施方案中，本发明提供了一些改进检测早期的肾病以及肾病并发症，尤其是糖尿病的肾病并发症的方法。片段图可以根据特定片段的大小，序列以及多肽链上酶剪接位点来确定，所述特定片段衍生自完整的滤过蛋白。片段图是发生病变的肾的特征。因此，疾病包括肾病早期迹象的检测方法，确定病人对疾病的倾向的方法，防止疾病发作的方法以及尽可能在疾病发生的最早期治疗疾病的方法都是本发明的一些目的。
这种方法包括从受试者中取尿，并分离所有的片段。在一个特定的实施方案中，首先用HPLC(一维或两维或三维电泳和/或层析)进行分离，然后通过质谱测定片段的大小，并利用氨基酸测序确定肽序列和酶切发生的位点。
尽管不限于任何特定的疾病，根据本发明方法，寻求诊断的疾病包括肾病，尿崩症(diabetes insipidus)，I型糖尿病，II型糖尿病，肾病(肾小球肾炎，细菌和病毒性肾小球肾炎，甲型球蛋白肾病，和过敏性紫斑症，膜增生性肾小球肾炎，膜性肾病，休格连氏干燥症，肾病综合症(微小变化疾病，局部性肾丝球硬化症(focal glomerulosclerosis)和相关紊乱)，急性肾功能衰竭，急性肾小管间质性肾炎，肾炎，肾盂肾炎，泌尿生殖系统炎性疾病，子痫前症，肾移植排斥反应，麻风，反流性肾病，肾结石)，遗传性肾病(髓质囊性病，髓质海绵肾疾，多囊肾(常染色体显性遗传性多囊肾，常染色体隐性遗传性多囊肾，结节性硬化)，脊髓血管瘤症，家族性薄肾小球基膜疾病，胶原蛋白III肾小球病，纤维连接蛋白肾小球病，阿颇特症候群，法布瑞氏症，甲髌综合征，先天性泌尿异常)，浆细胞恶病质症(monoclonalgammopathies)(多发性骨髓瘤，淀粉样蛋白病及相关紊乱)，发热病(家族性地中海热，HIV感染AIDS)，炎性疾病(全身性血管炎(结节性多动脉炎，韦格纳肉牙肿病，多动脉炎，坏死性和新月体性肾小球肾炎)，多发性肌炎-皮肌炎，胰腺炎，类风湿关节炎，全身性红斑狼疮，痛风)，血液病(镰状细胞贫血病，血栓性血小板低下性紫斑症，溶血性尿毒性症候群，急性皮质坏死，肾血栓栓塞)，创伤和外科手术(大面积损伤，烧伤，腹部和血管手术，麻醉的诱导)，药物(青霉胺，类固醇类)以及滥用药物，恶性疾病(上皮(肺，胸)，腺癌(肾)，黑素瘤，淋巴网状组织，多发性骨髓瘤)，循环系统疾病(心肌梗塞，心脏衰竭，外周血管疾病，高血压，冠心病，心血管非动脉硬化疾病，心血管动脉硬化疾病)，皮肤病(牛皮藓，全身性硬皮病)，呼吸道疾病(COPD，阻塞性睡眠息症，高海拔hypoia)和内分泌疾病(肢端巨大症，糖尿病，尿崩症)。特异的蛋白尿，尤其是白蛋白尿(微量白蛋白尿和巨量白蛋白尿(macroalbuminuria))是这些疾病的标记。
在第二个实施方案中，本发明提供了检测非肾病的改进方法。在肾通过过程中，滤过蛋白被降解，出于这点考虑，本发明描述的方法也能用来检测蛋白片段，这些片段衍生自非肾病产生的蛋白。非肾病，如癌症，产生高水平的蛋白进入循环。这些滤过蛋白的尿分析目前检测不到这些蛋白的完整形式。因此，如下所述的用来检测和分析肾通过过程中降解产生的片段的方法能够检测疾病的严重性。
两种实施方案均使用了非抗体技术，用一种三维方式从尿样品中分离所需的蛋白和它的片段，分离片段，并确定蛋白及其片段的序列。这个实验在一段时间内被重复。片段图谱随时间的变化表明特定疾病的早期。通过序列分析确定的片段大小的变化，能表明受试者容易患哪种类型的肾病。
从本发明下面的描述、附于此的参照图和权利要求书中将充分理解本发明的这些和别的目的。
附图简述图1所示的是滤过的完整白蛋白进入肾小管细胞及白蛋白降解成分泌的白蛋白片段的过程。
图2(2a和2b)所示的是用大小排阻层析得到的有代表性的(3H)HAS的图谱，其中(a)是尿中的(3H)HAS，(b)是血浆中的(3H)HAS，它们均收集自正常的健康志愿者。尿中含有大部分片段化的白蛋白。而血浆中则含有大部分的完整白蛋白。
图3所示的是用大小排阻层析从尿中得到的片段化白蛋白峰，但没有完整白蛋白峰，尿收集自正常的健康志愿者。
图4所示的是用大小排阻层析从尿中得到的完整白蛋白和片段化白蛋白峰，尿收集自糖尿病患者。
图5所示的是单独白蛋白的HPLC图谱。
图6所示的是正常的健康志愿者血浆的HPLC图谱，图中所示的是白蛋白峰。
图7所示的是正常的健康志愿者尿中的HPLC图谱，图中所示的是片段化白蛋白峰，但没有完整白蛋白峰。
图8所示的是白蛋白尿正常的糖尿病患者尿样中的HPLC图谱，图中所示的是白蛋白降解产物，以及在保留时间大约为39-44分钟时的一个小的修饰的白蛋白峰。
图9所示的是白蛋白尿正常的糖尿病患者尿样中的HPLC图谱，图中所示的是肾功能衰竭的信号，而且在保留时间大约为39-44分钟时出现了一个特征性的尖形白蛋白峰。
图10所示的是白蛋白尿正常的糖尿病患者尿样中的HPLC图谱，图中所示的是肾功能衰竭的信号，而且在保留时间大约为39-44分钟时出现了一个特征性的尖形修饰白蛋白峰。
图11所示的是巨量白蛋白尿糖尿病患者尿样中的HPLC图谱，图中所示的是高水平的正常白蛋白，以及在保留时间大约为39-44分钟时出现了一个特征性的尖峰。
图12所示为病人的纵向研究结果，患者的修饰蛋白在糖尿病性肾病发作之前被检测，纵向结果表明，患者易患糖尿病性肾病以及由于依赖常规的RIA方法造成了治疗的延迟。
图13所示为病人的纵向研究结果，患者的修饰蛋白在糖尿病性肾病发作之前被检测，纵向结果表明，患者易患糖尿病性肾病以及由于依赖常规的RIA方法造成了治疗的延迟。
图14所示为病人的纵向研究结果，患者的修饰蛋白在糖尿病性肾病发作之前被检测，纵向结果表明，患者易患糖尿病性肾病以及由于依赖常规的RIA方法造成了治疗的延迟。
图15所示为HPLC层析谱，它可以作为实施例4中修饰白蛋白的纯度标准。
图16是一示意图，表示完整的滤过蛋白可以被正常功能的肾和病变的肾降解的方式。
图17所示为胰蛋白酶消化的白蛋白样品的HPLC图谱，白蛋白样品已经一个截留分子量为30000的膜过滤。滤液在2-30分钟产生许多洗脱峰。
图18所示为一个对照的正常受试者的HPLC图谱，图中显示洗脱时间在10-30分钟时，出现了许多片段。而具巨量白蛋白尿(1457微克/分钟)的糖尿病患者的HPLC图谱在10-30分钟时却表现出显著不同的片段图。
图19所示为患有肾病的受试者的HPLC图谱。和图18比较，滤过蛋白的断裂过程被抑制了。片段的数目减少了而片段的大小却增加了。
发明详述本申请人发现，当蛋白，包括主要的血浆蛋白如白蛋白和免疫球蛋白，被肾过滤时，分泌前它们便被肾细胞所降解。滤过蛋白有可能被肾小管细胞吸收。肾小管细胞位于肾滤过之外，和初级滤液直接接触，当蛋白被肾小管细胞内化后，它们被导向到溶酶体，在溶酶体中，它们被部分降解为不同大小的片段，然后回吐到外面细胞中。这些回吐的片段，其中有至少60种不同的片段可由任何一种特定类型的蛋白产生，然后被分泌到尿中。
本申请人发现，肾病中蛋白质片段化被抑制。这意味着，在患有肾病的患者中，滤过蛋白基本以全长形式分泌。分泌蛋白从片段化转变成片段化抑制是开发新药和诊断分析的基础。例如，糖尿病并发症发作出现的初始变化是和分泌白蛋白片段化图谱中的变化相关的。这会导致明显的微量白蛋白尿，意味着糖尿病性肾变向前发展了。这可能是因为抑制了糖尿病患者肾小管细胞中的溶酶体活性所致。
因此，可以配制一些药物用来激活肾病并发症发生部位中溶酶体的活性。这些药物也可用于其它的影响溶酶体活性的肾病，或在非肾组织中溶酶体的活性被关闭的情况下，没有肾病并发症的糖尿病。这些药物包括抗增生药物如抗癌药物，或中和βTGF的抗体。
本申请人发现了一种独特的检验方法，它可以通过检测受试者的尿液来检测特异蛋白的片段阵列。对蛋白片段阵列进行检测以及改变蛋白片段阵列可以预知肾病的倾向。
蛋白片段阵列的原理如图16所示。完整的蛋白由一系列区域代表，这些区域表示蛋白上的特定氨基酸序列。所有蛋白都有这样的特异的一级结构。来自血浆的这样一种蛋白如白蛋白或免疫球蛋白过滤时，会以完整形式被过滤。然而，在这种蛋白过滤后，它可以被肾细胞如早期近端肾小管细胞吸收，而且会被溶酶体中的酶降解成许多片段(图16)。这些片段分泌到尿液中。对于正常功能的肾脏，随着源自许多单个滤过蛋白的小片段的产生以及最终被分泌，片段化过程被最大化。图17所示的是白蛋白被胰蛋白酶消化的片段化图谱。在对照的正常志愿者的尿中也能见到一种相似的图谱(图18)。就每种蛋白产生的片段数以及肽剪切的属性(即蛋白剪切的部位)而言，片段化图谱是特异的。单个片段的大小和序列特征是和这种蛋白作用的溶酶体酶的特异性和活性的特征。
蛋白酶如V-8，胰蛋白酶和Lys-C都能用来产生纯化蛋白的肽图谱。也可用别的蛋白酶，优选的是那些能引起有限蛋白水解(“酶剪切”)的蛋白酶，其中，只有1个或有限数目的靶蛋白肽键被蛋白酶剪切。这些蛋白酶可以来自任何一类蛋白水解酶，如丝氨酸蛋白酶(胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶，弹性蛋白酶，激肽释放酶和枯草杆菌蛋白酶家族)，半胱氨酸蛋白酶(植物蛋白酶如木瓜蛋白酶，阴离子蛋白酶(actinidin)或菠萝蛋白酶，一些组织蛋白酶，胞质钙蛋白酶，和寄生蛋白酶(如来自锥虫，血吸虫)，天冬氨酸蛋白酶(胃蛋白酶家族成员如胃蛋白酶，凝乳酶，一些组织蛋白酶D和肾素，某些真菌蛋白酶(青霉天冬酰蛋白酶，rhizopuspepsin，endothiapepsin)，和病毒蛋白酶，如逆转录病毒蛋白酶(retropepsin)；和金属蛋白酶(包括嗜热菌蛋白酶，脑啡肽酶，丙氨酰氨肽酶和虾红素)。
在肾病中，滤过蛋白的片段化过程被抑制了。片段的数目下降了而片段的大小增大(图19)。这是因为溶酶体中酶剪切位点减少所致。因此，就大小和氨基酸序列而言，对于任何特定的滤过蛋白，如白蛋白或免疫球蛋白，病变肾中的片段图谱和从正常肾中获得的片段图谱显著不同。片段化的抑制程度取决于疾病的严重程度。如图A所证明的那样，随着疾病的发展，片段化的程度将会变得更小。
美国专利No.5,246,835公开了一种通过检测人尿中的白蛋白片段来诊断肾病的方法。’835专利公开了蛋白片段来自血浆并通过肾脏过滤，没有被改变，而且最终被分泌。’835专利中优选检测尿液片段的方法包括利用和常规白蛋白抗体的亲和结合。和本发明方法比较，’835专利方法中增加了对糖尿病白蛋白片段的检测。在本发明中，当蛋白片段数下降时，可以诊断到糖尿病性肾病。本发明中检查白蛋白片段，并不必用白蛋白抗体来检测。
和’835专利比较，本发明中的一个实施方案是从病人中取尿样，用HPLC(一维或二相或三维电泳和/或层析)分离所有的片段，然后通过质谱确定片段的大小，并利用氨基酸测序确定肽序列和肽发生剪切的部位。
蛋白片段可以通过本领域熟知的许多方法进行检测和分离，这些方法包括，但不限于色谱、电泳和沉淀或这些方法的组合，下列文献描述了这些方法，Karger BL，Hancock WS(编辑)，生物大分子的高分辨分离和分析(High Resolution separation and analysis of biologicalMacromolecules)，第一部分，酶学方法基础(Fundamentals in Methods inEnzymology)，第270卷，1996，Academic Press，SanDiego，Califonia，USA；Karger BL，Hancock WS(编辑)，生物大分子的高分辨分离和分析(High Resolution separation and analysis of biologicalMacromolecules)，第二部分，酶学方法的应用(Applications in Methods inEnzymology)，第271卷，1996，Academic Press，SanDiego，Califonia，USA；或Harding SE，Rowe，AJ.，Horton JC(编辑)，生物化学和多聚体科学的分析超速离心(Analytical ultracentrifugation in Biochemistry andpolymer science)，1992，Royal Soc Chemistry，Cambridge，UK，这些文献以其全文在此引作参考。
电泳方法包括，但不限于移动界面电泳，区带电泳和等电聚焦。
色谱方法包括，但不限于分配层析，吸附层析，纸层析，薄层层析，气液色谱，凝胶层析，离子交换层析，亲和层析，和疏水作用层析。优选的方法是大小排阻凝胶层析(sizing gel chromatography)和疏水作用层析。更优选的方法是使用HPLC柱的疏水作用层析。
优选HPLC来产生片段化图谱。HPLC的片段化图谱的特征在于有一系列代表众多片段物种的峰。
用来检测修饰的白蛋白或未修饰的白蛋白的HPLC柱可以是一种疏水性柱，如Zorbax 300SB-CB(4.6mm×150mm)。可用一个50μL的样品环。在HPLC中，适合检测白蛋白及其降解产物的洗脱溶剂包括标准的洗脱溶剂，如乙腈溶剂。在水/1％三氟乙酸(TFA)缓冲液后再用60％乙腈/0.09％TFA的缓冲液是优选使用的。梯度为0-100％的60％乙腈/0.09％TFA缓冲液是适合的。
适合HPLC的疏水性柱的条件如下溶剂A水，1％三氟乙酸溶剂B 60％乙腈，0.09％TFA溶剂A2 99.96＞00.0049.58分钟压力9.014M帕斯卡(～1100psi)溶剂B2 0.04＞100.049.58分钟压力7.154M帕斯卡HPLC中使用的波长大约是214nm。
对于白蛋白，修饰的白蛋白可以在39-44分钟(图5)间洗脱。白蛋白片段可以洗脱得更早，主要少于20分钟。
定义“片段化蛋白或白蛋白片段”包括肾通过过程中，经过化学，酶学或物理降解后的肾小球后降解产物。这些成分的大小减少和/或疏水性改变。
这里使用的“完整白蛋白，修饰的白蛋白或白蛋白的修饰形式”意思是指和天然白蛋白具相似大小和结构特征的化合物，其中氨基酸序列和天然白蛋白基本相同。它优选指的是滤过的完整蛋白。在高压液相色谱(HPLC)中，它和天然白蛋白的洗脱位点相同或接近(图5)。然而，它们的结构可以通过生化手段和/或物理手段进行修饰，生化手段既可以是小酶介导的修饰也可以在其基本结构上添加东西，物理手段主要是改变它的三维结构，使得它能逃脱常规使用的抗白蛋白抗体的检测。生化修饰可以通过酶如内源或外源性肽酶来进行。白蛋白的3D结构可以通过一些方法改变。配基可以和白蛋白结合，或白蛋白可以是这些配基的任何组合。用本发明方法检测到的修饰白蛋白在目前常规的放射免疫测定法中用抗体检测不到，而且没有片段化。
常规的抗白蛋白抗体可以从任何免疫化学药品供应商处购买。例如，单克隆抗体目录号A6684(克隆号HSA-11)，和A2672(克隆号HSA-9)，以及液体全血清，冻干的分级物，液体IgG部分，和存在腹水中的单克隆抗体都能从Sigma，St.Louis，MO获得，它们可以在1994年Sigma公司的用作研究和诊断试剂的生化和有机化合物目录(Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagentscatalog)第1151-1152页的免疫化学药品部分找到。
这里使用的完整/修饰的白蛋白包括基本上是全长的白蛋白，片段化白蛋白，化学修饰或物理修饰的白蛋白。这里使用的完整/修饰的白蛋白意思表示，它的分子量小于，等于，或大于全长白蛋白，而且在分离介质，如层析，优选的是HPLC，最优选的是疏水性HPLC中，它的洗脱位点和天然白蛋白的相同或接近。这里使用的片段化白蛋白指的是用常规抗白蛋白抗体检测不到的白蛋白片段，它在早期肾病和/或疾病的肾病并发症的诊断中可以检测到。检测到完整/修饰的白蛋白表明易患肾病。
这里使用的“完整蛋白，修饰蛋白或蛋白的修饰形式”包括基本上是全长的蛋白，它们用常规的放射性免疫测定检测不到。这些蛋白包括，但不限于白蛋白，球蛋白(α-球蛋白(α1-球蛋白，α2-球蛋白)，β-球蛋白，γ-球蛋白)，优球蛋白，假球蛋白I和II，血纤蛋白原，α1酸性糖蛋白(血清类粘蛋白)，α1糖蛋白，α1脂蛋白，血浆铜蓝蛋白，α219S糖蛋白，β1转铁蛋白，β1脂蛋白，免疫球蛋白A，E，G和M，辣根过氧化物酶，乳酸脱氢酶，葡糖氧化酶，肌球蛋白，溶菌酶，蛋白激素，生长激素，胰岛素或甲状旁腺激素。
这里使用的“肾病”包括肾的任何功能失常。可以根据尿中完整或修饰白蛋白的存在来鉴定肾病。优选地，检测尿中修饰蛋白存在，或在一段时间内尿中修饰蛋白的增加来诊断早期肾病。
这里使用的“低溶酶体活性”是和正常个体中，正常水平的溶酶体活性和/或运输蛋白到溶酶体的溶酶体组织比较而言的。低溶酶体活性不足以将蛋白均片段化，以至于完整蛋白以比正常低水平高的数量分泌。
这里使用的“溶酶体激活化合物”指的是有利于溶酶体再激活的化合物。这个化合物直接或间接地与溶酶体作用，导致溶酶体功能的激活。这些化合物可以选自，但不局限于，抗癌化合物，抗增生化合物，对乙酰氨基酚，维生素A(视黄酸)或视黄醇的衍生物，或中和βTGF的化合物，包括抗体。
“巨量蛋白尿”指的是一种状态，其中，个体排出的尿中所含的白蛋白用常规放射性免疫测定(RIA)检测多于200μg/min。
“微量蛋白尿”指的是一种状态，其中，个体排出的尿中所含的白蛋白用常规放射性免疫测定(RIA)检测至少20μg/min。RIA能检测少于15.6ng/mL的量，而且能够检测正常受试者尿中的白蛋白，正常受试者具有少于6μg/min的清除率。然而，如果白蛋白分泌超过20μg/min，肾病的治疗就会受到限制，而从这点来说，全面恢复便很困难。
这里使用的“微量白蛋白尿”是一种状态，这时，在尿中用常规RIA检测的白蛋白以至少20μg/min的速率分泌。
这里交替使用的“天然的”和“未修饰的”描述的是一种在生物体自然存在的，没有被肾小球滤过加工所修饰的蛋白，优选的生物体是人。
这里使用的“正常的个体”是没患病的个体，其中这种病是以尿中发现完整蛋白为指征的。这种病优选的是肾病。
“正常水平的溶酶体活性”是正常个体中没有病变的肾的溶酶体活性水平。
这里使用的“白蛋白尿正常”意思是指一种状态，其中白蛋白分泌到尿中，而RIA检测不到，或以少于20μg/min(用RIA测量)的速率分泌。
这里使用的“疾病倾向”意思是指根据修饰蛋白如修饰的白蛋白的存在与分泌速率来判断，个体可产生某种疾病。
这里使用的“蛋白尿”是指尿中存在蛋白，通常是以白蛋白的形式，白蛋白是一种可溶于水的蛋白，加热可凝聚。和它相关的，“特异性蛋白尿”指的是尿中存在特异性蛋白。
这里使用的“放射性免疫测定法”指的是利用放射性标记的特异抗体或抗原检测和测量物质的方法。
这里使用的“溶酶体再激活”优选包括溶酶体活性激活，以便和溶酶体失活状态相比，蛋白，尤其是白蛋白降解增加。
这里使用的“恢复”意思是指被恢复的成分全部或部分恢复功能，和原先的功能相比，恢复的功能有所改进。
这里使用的“完整蛋白和完整修饰蛋白之和”是指生物样品中存在的完整蛋白和完整修饰蛋白的总和。
这里使用的“总蛋白”指的是以天然的，未修饰的，修饰的或片段化形式分泌到尿中的特定滤过蛋白。它包括采用目前可获得的检测蛋白的常规放射性免疫测定法或其他方法检测不到的蛋白质。优选的蛋白是白蛋白。
检测方法可以利用Hamper DJ等人的方法(Hampel DJ等，J.Am.Soc.Nephrol，12(5)1026-35(2001)创造和检查尿蛋白图谱，Hampel DJ等人开发了一种灵敏的高通量的技术，即表面增强的激光解析/电离(SELDI)ProteinChip阵列飞行时间-质谱。Hampel等人测试了这种技术用于尿蛋白图谱的实用性，也例举了它在接受放射性对比介质的病人中的用处。以ioxilan或高渗盐溶夜静脉给药之前和之后作为对照，在大鼠上作了SELDI在测试尿蛋白图谱上的精确性，灵敏度和重复性评估试验。对大鼠给药ioxilan会导致不同分子量蛋白质丰度的变化。然后，获得正在进行心导管插入术病人的尿样品。对于病人而言，在心导管插入术过程中，即便是在不复杂的放射性对照介质注入的情况下，也会出现对蛋白组成的干扰，但6-12小时后又回到基线值。具有某个确定分子质量的蛋白质在丰度上会发生变化。对于那些肾功能受损的病人而言，那些变化在6-12小时内是不可逆的。这些蛋白中的一个成员被鉴定成β2-微球蛋白可以作为这种原则的证据。即便对于没有肾病并发症的病人而言，分子量范围宽的蛋白质可能出现，也可能不出现在尿中。
尿蛋白图谱也可利用商业上买到的ProteinChipSystem(Ciphergen Biosystem，Fremont，CA，USA)来创造和检查，它利用SELDI(表面增强的激光解析/电离)技术直接从生物样品中快速地在飞摩水平上对蛋白进行分离，检测和分析。每个铝芯片含有8个单独的，化学处理的点用于样品应用，这套装置可以便于对多个样品同时进行分析。一种显色的疏水性包被将样品滞留在这些点上，同时可以对芯片类型进行快速鉴定。通常，用在ProteinChipArray上的若干微升样品可以产生足量、用ProteinChipReader进行分析的蛋白。
对于更稀释的样品，ProteinChipBioprocessor能用来处理多达500μL的样品。蛋白样品的质量确定方法是样品结晶，电离，让样品在真空管中飞行，检测电离化蛋白。将非特异性结合的蛋白和别的污染物从ProteinChipArray上冲洗后，一种化学能量吸附分子(EAM)溶液加上去，然后干燥，在这个过程中，微小晶体在芯片上形成。这些晶体含有EAM和目的蛋白。把ProteinChipArray插入ProteinChipReader，一束激光聚焦在样品上，这样会引起埋置于EAM晶体的蛋白解除吸附和电离。释放的离子在加速电场作用下，“飞”过真空管，到达离子检测仪。最终，离子化的蛋白被检测到，根据飞行时间(TOF)可以确定蛋白的准确质量。
如右图所示，可以用芯片上的蛋白酶如V-8，胰蛋白酶和Lys-C来消化结合在ProteinChipArray上的纯化蛋白，从而获得它们的肽图谱。为了鉴定这些片段，可以将产生的片段的分子量和肽数据库中的进行比较。整个过程耗时少于1个小时。
此外，12块蛋白芯片阵列肩并肩地排列创造一种96孔的平板足迹试验。利用蛋白芯片阵列技术的典型试验需要在工作台上工作1-3小时，然后用ProteinChipReader对样品进行自动分析。因此，整个过程可能要耗时1个下午。
其他方法根据本发明，将要治疗的疾病包括，但不限于肾病(肾小球肾炎，细菌和病毒性肾小球肾炎，甲型球蛋白肾病，和过敏性紫斑症，膜增生性肾小球肾炎，膜性肾病，休格连氏干燥症，糖尿病性肾病，肾病综合症(微小变化疾病，局部性肾丝球硬化症和相关紊乱)，急性肾功能衰竭，急性肾小管间质性肾炎，肾盂肾炎，泌尿生殖系统炎性疾病，子痫前症，肾移植排斥反应，麻风，反流性肾脏病，肾结石)，遗传性肾病(髓质囊性病，髓质海绵肾疾，多囊肾(常染色体显性遗传性多囊肾，常染色体隐性遗传性多囊肾，结节性硬化)，脊髓血管瘤症，家族性薄肾小球基膜病，胶原蛋白III肾小球病，纤维连接蛋白肾小球病，阿颇特症候群，法布瑞氏症，甲髌综合征，先天性泌尿异常)。
本发明的一个方面是提供了一种方法，它可以用来对肾病和/或疾病的肾病并发症的倾向进行确定或对肾病和/或肾病并发症进行早期诊断。这个方法包括确定尿样品中白蛋白含量的变化。这种疾病可以是肾病，尽管没必要局限于肾病。
在本发明的方法中，这里使用的白蛋白只作为在尿中检测的蛋白例子。当用常规的RIA分析病人的白蛋白时，预计年轻人中白蛋白尿正常的病人或正常个体尿中白蛋白在3-10μg/min，而在老年人中则更高一些。然而，如果用HPLC检测，白蛋白尿正常的患者也会在尿中表现出不同水平的白蛋白。本申请人发现这些白蛋白水平有5μg/min的量级。当肾病向前发展时，完整/修饰白蛋白如RIA所确定将会上升到20-200μg/min量级的微量白蛋白尿水平。这将比用HPLC或确定完整白蛋白和修饰白蛋白总数的方法所确定的水平高许多。通过监控完整/修饰白蛋白的增加，可以检测到肾病的早期信号。然而，这些水平的白蛋白通过现在采用的方法如放射性免疫测定所检测不到的，放射性免疫测定法使用目前商业上使用的抗体，其原因可能是抗体检测到了某种表位。如果白蛋白用上述任何方式进行修饰，所述表位因此可以被破坏，从而导致修饰的白蛋白检测不到。
一个糖尿病性肾病的疑似病人并没有表现出肾退化的迹向，很可能直到10-15年后，这是通过目前采用的方法如RIA方法对白蛋白进行检测的情形。当个体进入微量白蛋白尿状态时，至少20μg/min的尿分泌速率才能通过RIA检测到。此外，通过观察修饰白蛋白的分泌，肾的变化及肾病可能的发作都可能检测到。
一个白蛋白尿正常受试者，或白蛋白尿正常的糖尿病患者可能持续有许多年的如由RIA所确定的少于20μg/min的低蛋白分泌速率。尿中出现白蛋白是肾功能可能受损的信号。一旦这种水平发生改变，便可开始治疗。
正常个体中，尿中少量白蛋白是可以检测到的。总的滤过白蛋白主要以片段化白蛋白出现在尿中。正常白蛋白可以在白蛋白尿正常个体上检测到。然而，白蛋白尿正常个体尿中白蛋白的分泌速率可以低至5μg/min。这种水平一般用RIA是可以检测到的。
本发明的修饰蛋白可以通过许多本领域熟知的方法进行检测，这些方法包括，但不限于色谱、电泳和沉淀或这些方法的组合，下列文献描述了这些方法，Karger BL，Hancock WS(编辑)，生物大分子的高分辨分离和分析(High Resolution separation and analysis of biologicalMacromolecules)，第一部分，酶学方法基础(Fundamentals in Methods inEnzymology)，第270卷，1996，Academic Press，SanDiego，Califonia，USA；Karger BL，Hancock WS(编辑)，生物大分子的高分辨分离和分析(High Resolution separation and analysis of biologicalMacromolecules)，第二部分，酶学方法的应用(Applications in Methods inEnzymology)，第271卷，1996，Academic Press，SanDiego，Califonia，USA；或Harding SE，Rowe，AJ.，Horton JC(编辑)，生物化学和多聚体科学的分析超速离心(Analytical ultracentrifugation in Biochemistry andpolymer science)，1992，Royal Soc Chemistry，Cambridge，UK，这些文献的其全文在此引作参考。
电泳方法包括，但不限于移动界面电泳，区带电泳和等电聚焦。
层析方法包括，但不限于分配层析，吸附层析，纸层析，薄层层析，气液层析，凝胶层析，离子交换层析，亲和层析，和疏水作用层析。优选的方法是大小排阻凝胶层析(sizing gel chromatography)和疏水作用层析。更优选的方法是使用HPLC柱的疏水作用层析。
修饰蛋白也可使用特异的白蛋白染料来检测。Pegoraro等人描述了这些方法，美国肾病杂志(American Journal of KidneyDisease)，35(4)739-744(2000年4月)，其公开的内容全文在这里引作参考。修饰的白蛋白以及整个白蛋白可以被这种染料方法检测到，从而提供修饰白蛋白和整个或完整白蛋白的总数。这种检测方法的采用需要或不需要首先从尿中分离出白蛋白。正常情况下，这种染料检测不到分子量少于10,000的片段，但可以检测到修饰的白蛋白。
在这种染料检测方法中，利用了一种染料如Albumin Blue 580。这种染料天然没有荧光，但当它结合到完整白蛋白以及修饰的白蛋白是会发出荧光，但它不能和球蛋白结合。因此，球蛋白不会干扰试验，测量也就可以在未级分的尿中进行。
本申请人发现，在糖尿病患者中，当用常规的RIA分析时，一个白蛋白尿正常的糖尿病患者几乎检测不到修饰或片段化的白蛋白。它们显得很正常。然而，当尿样用HPLC检测时，修饰白蛋白的水平远高于正常个体。这种白蛋白水平差异归因于常规的RIA不能足够地检测所有完整或修饰的白蛋白(总白蛋白)，因此HPLC被优选用来生成片段化图谱。HPLC上的片段化图谱的特征是有一系列峰，它们代表众多物种的片段化或完整或修饰的白蛋白。
在本发明的一个优选方面，确定受试者肾病的倾向或对肾病进行早期诊断的方法应该在受试者出现微量白蛋白尿之前确定。
用本发明的HPLC方法检测样品中的白蛋白含量，会得到和常规RIA检测不同的结果。在HPLC技术中，在正常个体中可以观察低水平的白蛋白。当开始检测修饰的白蛋白水平上升，并朝微量白蛋白尿状态发展时，这个病人就可以被确定具肾病倾向。
在一个正常个体中，HPLC产生的片段图谱的特征是在全长天然白蛋白洗脱的区域中没有一个峰。相反，这个区域可以检测到多个片段化白蛋白。一种纯的蛋白产物(未修饰的)基本上产生一个单一峰。例如，使用疏水性HPLC，观察到白蛋白在39-44分钟时被洗脱出来(图5)。因此，正常个体将出现一个完全不同的片段图谱，表示它没有肾病或无肾病倾向。然而，当肾病向前发展时，修饰白蛋白的量首先增加，然后可以检测到它的天然形式。片段化图谱开始改变，并在全长白蛋白区域显示有更多的产物，因为出现了别的尖峰或峰扩大了，这都表明在尿中含有更多完整/修饰的白蛋白。
在一个尿样品的HPLC片段片图谱中，修饰的白蛋白可以出现在天然白蛋白洗脱的区域，但还出现了多个峰，这表明存在多种形式的修饰白蛋白。
在进一步的优选方案中，可以通过确定至少一种修饰白蛋白的存在或鉴定出至少一种修饰白蛋白来确定肾病的倾向。这可以由HPLC图谱上存在的特异峰来确定或鉴定，优选的峰应位于和天然白蛋白洗脱位置相对应的区域。
确定肾病倾向的方法可以应用到任何个体。肾病可由许多因素引发，如细菌感染，过敏反应，先天性缺陷，结石，肿瘤，化学物质或糖尿病。这种方法优选地用于确定糖尿病患者的肾病倾向，而糖尿病患者是很有可能发展成肾病的。优选的个体是白蛋白尿正常的糖尿病患者。然而，也可通过检测尿中完整或修饰白蛋白水平的增加来监控正常个体的疾病倾向。
本发明的方法可以通过上述的非抗体分离程序来进行。然而，对修饰蛋白特异的抗体也能用于检测修饰蛋白的存在。
利用下列方法可以获得修饰蛋白的抗体。仅通过实施例来具体描述白蛋白抗体制备的方法，这个方法可以轻易地应用于尿中任何其他蛋白抗体的制备。这种方法需要确定哪种修饰的白蛋白分子是最灵敏的鉴定糖尿病患者的标记，例如，哪些病人会发展成肾病并发症。
修饰白蛋白的特征是可以进行定量分离修饰的白蛋白分子，如通过制备性HPLC。通过诸如糖化的配基结合分析修饰蛋白。随后，确定单个修饰蛋白的氨基酸序列，优选的是通过质谱，利用下列文献中介绍的方法。Karger BL，Hancock WS(编辑)，生物大分子的高分辨分离和分析(High Resolution separation and analysis of biologicalMacromolecules)，第一部分，酶学方法基础(Fundamentals in Methods inEnzymology)，第270卷，1996，Academic Press，SanDiego，Califonia，USA；Karger BL，Hancock WS(编辑)，生物大分子的高分辨分离和分析(High Resolution separation and analysis of biologicalMacromolecules)，第二部分，酶学方法的应用(Applications in Methods inEnzymology)，第271卷，1996，Academic Press，SanDiego，Califonia，USA，这些文献以其全文在此引作参考。在一个优选的实施方案中，可能有大约3-4种修饰的白蛋白。
获得抗修饰白蛋白抗体的方法是为了开发一种针对修饰白蛋白的诊断用免疫测定法，它可以预测糖尿病患者，如那些发展成肾病并发症的患者。为了完成这个方法，用HPLC分离了足量的修饰白蛋白。把这些修饰白蛋白相继注射入动物如兔子获得抗体，为了得到好的滴度，用常规的技术和下列文献中介绍的方法分离抗体。这些文献如Godrng JW，单克隆抗体原理和应用，单克隆抗体在细胞生物学，生物化学和免疫学中的产生和应用(Production and Application ofMonoclonal Antibodies in Cell Biology，Biochemistry and Immunology)，第二版，1986，Academic Press，伦敦，英国，或Johnstone A，Trorpe R，免疫化学实践(Immunochemistry in Practice)，第三版，1996，BlackwellScience Ltd Oxford，UK，它们全部在此引作参考。获得的抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。
优选的是，至少一种修饰白蛋白被分离和鉴定用于确定肾病倾向。分离出来的不同种修饰白蛋白可以产生不同的用于免疫测定的抗体。这些抗体可以加上一些酶标记，放射性标记，荧光标记或化学发光标记。检测方法包括，但不限于放射性免疫测定法，免疫放射分析，荧光免疫测定，酶联免疫测定和蛋白A免疫测定。这些测定可以用下列文献介绍的方法进行。Godrng JW，单克隆抗体原理和应用，单克隆抗体在细胞生物学，生物化学和免疫学中的产生和应用(Productionand Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology，Biochemistryand Immunology)，第二版，1986，Academic Press，伦敦，英国；JohnstoneA，Trorpe R，免疫化学实践(Immunochemistry in Practice)，第三版，1996，Blackwell Science Ltd Oxford，UK；Price CP，Newman DJ(编辑)免疫测定原理和实践(Principles and Practice of Immunoassay)，第二版，1997，Stockton Press，New York，NY，USA，它们以其全文在此引作参考。
本发明的目的是提供一件物品或一种试剂盒，这种试剂盒能快速和准确地确定样品中修饰蛋白如修饰白蛋白的存在与否，按需要定量或非定量确定。试剂盒中的每种成分均单独包装在合适的容器中。单个容器又可以识别其内容的方式加以标记。而单独包装的成分又可置于能容纳所有需要的成分的大容器中。和这试剂盒一起的还有说明书，它能解释怎么使用这个试剂盒。这些说明书可以写在或附在试剂盒上。
本发明也涉及一种确定用于肾病和/或疾病的肾病并发症的治疗剂的方法，这种方法包括a) 给人施用一种药剂，它被怀疑能治疗这种疾病；b) 获得这个人的尿样；和c) 测定样品中的修饰蛋白，其中尿中可能存在也可能不存在修饰蛋白或在一段时间内修饰蛋白的数量降低都表明这种药剂能治疗这种疾病。这种治疗剂可以是溶酶体激活剂，它能直接或间接地激活溶酶体，因此，也使用溶酶体去消化肾小球后滤过蛋白，它是健康肾的信号。
运输蛋白到溶酶体的过程在糖尿病人白蛋白尿形成机制中发挥了作用。参与运输的胞内分子是蛋白激酶C(PKC)。可以考虑配制一种药物或药剂去激活溶酶体运输或抑制PKC活性。
因此，本发明的一个方面是提供了一种激活溶酶体的化合物，它用于再激活溶酶体或再激活指导底物到溶酶体或产物离开溶酶体的过程。
本发明的另一个方面是提供了一种组合物，它含有激活溶酶体的化合物和载体。
本发明的再一个方面是提供了一种防止或治疗肾病的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的溶酶体激活化合物。
本发明的另一方面是提供了一种方法，它可以筛选许多化合物，从而鉴定出能激活溶酶体或指导底物到溶酶体或产物离开溶酶体的化合物，所述方法包括下列步骤a) 将所述化合物与溶酶体接触，测定它激活溶酶体的能力，其中所述溶酶体被激活后，其活性会发生变化；b) 测试在肾组织中将胞内过程恢复到基本正常水平的能力，其中所述肾组织的溶酶体活性低；和/或c) 测试在肾组织中将组织周转率恢复到基本正常水平的能力，其中所述肾组织的溶酶体活性低。
肾中溶酶体和蛋白，尤其是白蛋白的降解相关。在微量白蛋白尿状态下，可能是因为溶酶体失活，相当数量的白蛋白逃脱了溶酶体降解。溶酶体降解能力的恢复可以恢复肾中胞内过程和组织周转率的平衡。
溶酶体激活化合物是能和溶酶体直接或间接作用的化合物。间接作用时，化合物和一种成分作用，影响溶酶体的活性。然而，结果导致了溶酶体的激活，因此它降解蛋白能力增强。
本发明的另一个方面是提供了一种组合物，它含有激活溶酶体的化合物和载体。
组合物可以是生理上可接受或可药用的组合物。然而，它将是一种能稳定贮存溶酶体激活化合物的组合物。如果这个组合物是可药用的组合物，它可能适合用于防止或治疗肾病的方法中。
本发明的再一个方面是提供了一种防止或治疗肾病的方法，所述方法包括给受试者施用一种有效量的溶酶体激活化合物。
如上所述，溶酶体激活化合物可通过再激活溶酶体发挥作用，以便细胞过程和组织更新全部或部分恢复，从而导致肾功能部分或全部恢复。在任何情况下，给动物施用一种溶酶体激活化合物后，有肾病的动物的溶酶体活性会全部或部分恢复。
给药的方式可以是口服或肠胃外给药。口服方式包括片剂，胶囊，粉末和糖浆等给药方式。肠胃外给药包括静脉给药，肌内给药，皮下给药或腹膜内给药途径。
溶酶体活性的改变是优选的，因为它能增强溶酶体的活性，从而改善白蛋白的降解。既能激活溶酶体，也能改善细胞过程和/或组织更新是大部分所需的溶酶体激活化合物的特征。希望溶酶体激活化合物被优选用来恢复肾功能。
本发明的另一方面是提供了一种防止受试者肾病的方法，所述的方法包括a) 检测尿样品中完整和修饰的完整白蛋白的含量；b) 检测尿中完整白蛋白数量的变化，这些完整白蛋白由于被修饰过，所以用常规RIA方法检测不到，其中这种变化是肾病倾向的指征；和c) 当这种变化被确定后，对患肾病的动物进行治疗。
下列提供的实施例是为了说明本发明，而不是限制本发明。
实施例实施例1人血清白蛋白(HAS)的大小排阻层析利用正常的健康志愿者提供的尿样分析尿中白蛋白的分布。
将3H[HAS](人血清白蛋白)注射入健康志愿者，收集尿样和血浆，用G-100柱对它们进行大小排阻层析分析。这个柱用PBS(pH＝7.4)在4℃以20mL/hr的速度洗脱。柱子的外水体积(Vo)用蓝色葡聚糖T2000确定，而总体积用含氚水确定。
1mL水性样品中的氚放射性用3ml闪烁体确定，并在Wallac 1410液体闪烁计数器(Wallal Turku，Finland)上进行检测。
图2所示为白蛋白在尿液和血浆中的分布。
实施例2正常的健康志愿者和糖尿病患者中的白蛋白分泌将实施例1中使用的3H[HAS]注射入正常的健康志愿者和糖尿病患者。收集尿样，用实施例1的方法确定3H[HAS]。
在如实施例1所进行的大小排阻层析上，正常的健康志愿者(图3)显示分泌的是片段化白蛋白。
糖尿病患者(图4)在大小排阻层析上显示存在基本上是全长和片段化白蛋白。然而，用这些方法检测到的白蛋白分泌速率为5μg/min(对照)和1457μg/min(糖尿病患者)的量级。
实施例3完整白蛋白和完整/修饰白蛋白在HPLC上的确定从正常的健康志愿者，白蛋白尿正常的糖尿病患者和巨量白蛋白尿患者中收集尿样。把中流尿收集到50μL尿样品容器。将尿样冷冻，直到进一步使用。在HPLC分析之前，以5000g离心尿样。
用疏水性柱子Zorbax 300SB-CB(4.6mm×150mm)对尿样进行HPLC分析。利用50μL的样品环。
使用下列条件从柱子上洗脱样品溶剂A水1％三氟乙酸溶剂B60％乙腈，0.09％TFA溶剂A2 99.96＞00.0049.58分钟压力9.014M帕斯卡(～1100psi)。
溶剂B2 0.04＞100.049.58分钟压力7.154M帕斯卡使用的波长是214nm。
实施例4用标准技术纯化制备抗体的修饰白蛋白先将微量白蛋白尿患者的尿液通过30kDa膜过滤，以将尿中修饰白蛋白从低分子量(＜30000)蛋白片段中分离出来，微量白蛋白患者的完整白蛋白浓度用浊度计(turbitimer)(包括常规的免疫化学测定法)检测是43.5mg/L。通过过滤保留下来的物质用浊度计试验确定，完整白蛋白的浓度为27.4mg/L。保留下来的物质在Sephadex G100上进行大小排阻层析。收集峰所在部分的物质，这部分是和完整白蛋白共洗脱下来的。用浊度计方法确定物质中白蛋白的含量是15.2ml/L。该物质然后在有完整白蛋白抗体的柱上进行亲和层析。这个柱子只能结合有常规表位的白蛋白。从柱子上洗脱下来的物质的产量小于6mg/L(浊度计的最低灵敏性)。具免疫反应性的白蛋白结合到亲和柱上是意料中的。洗脱物然后进行反相HPLC层析(如上所述)，从而确定样品中没有免疫反应活性的白蛋白的数量。对应于30.91mg/L纯化的修饰白蛋白的1452个单位面积如图5所注。纯化的修饰白蛋白然后可用标准方法制备抗体。
结果图5所示的是单独白蛋白HPLC图谱。在保留时间大致为39-44分钟时，可以获得一个基本上是单一的洗脱峰。
图6所示为血浆的HPLC图谱，它在保留时间大致为39-44分钟时，表现出了一个完全不同的白蛋白峰，还有别的对应于其他血浆蛋白的峰。
图7所示为正常的健康志愿者的HPLC图谱，它显示在尿样中没有白蛋白峰。个体降解排泄到尿中的白蛋白很可能是通过一个活性的溶酶体。大量片段化的产物是很明显的，这表明某些种类的白蛋白是占优的，尤其是保留时间大致低于14.5分钟时的那种白蛋白。
分析白蛋白尿正常的糖尿病患者(用RIA检测白蛋白分泌速率是8.07μg/min)的尿样(图8)，在保留时间大致为39-44分钟时，可以明显地显示少量洗脱的修饰白蛋白。常规测试表明尿样中存在小于6mg/L的白蛋白，而本发明的方法却表明尿样中的白蛋白的真正含量是26.7mg/L。对这个个体的这种疾病的治疗早应该开始。白蛋白副产物或片段化白蛋白的出现和正常的健康志愿者中的一样。
分析白蛋白尿正常的糖尿病患者(白蛋白分泌速率是17.04μg/min)的另一尿样(图9)，RIA测试表示白蛋白分泌进了这个患者的尿中。然而，在HPLC图谱上(图9)，白蛋白或修饰白蛋白峰在保留时间大致为39-44分钟时很明显。常规测试表明尿样中存在小于6mg/L的白蛋白，而本发明的方法却表明尿样中白蛋白的真正含量是81.3mg/L。对这个个体的这种疾病的治疗早应该开始。该峰开始出现多峰形图谱。对应于完整白蛋白的更小峰表明修饰白蛋白代表的是39-44分钟的峰。和没有白蛋白峰的正常的健康志愿者的图谱相比，这个白蛋白峰的出现表明完整/修饰白蛋白数量在检测水平上的变化。这可能是易患肾病的信号。
分析白蛋白尿正常的糖尿病患者(白蛋白分泌速率是4.37μg/min)的更多尿样，HPLC图谱如图9所示。再次，可以在保留时间大致为39-44分钟时检测到修饰的白蛋白，这个时间段在图上有多个峰。这个患者再次用RIA测定后登记为白蛋白正常。常规测试表明尿样中存在小于6mg/L的白蛋白，而本发明的方法却表明尿样中白蛋白的真正含量是491mg/L。对这个个体的这种疾病的治疗早应该开始。评价修饰白蛋白有必要鉴定这些变化，这是很明显的。患者应该被确定为具有肾病倾向。当肾病向前发展时，修饰白蛋白将会持续增长。
如图11所示，分析了巨量白蛋白尿患者的尿样。一个十分显著的白蛋白峰在保留时间大致为39-44分钟时明显显示有多个峰。患者的白蛋白含量是1796mg/L。对这个个体的治疗正在进行。
如图12-14所示，通过纵向研究，本发明的方法能对肾病倾向进行早期检测。图12-14显示一些情形，其中如果使用了本发明的检测修饰白蛋白的方法，对糖尿病的ACE抑制剂治疗应早在其开始之前进行。用本发明的方法检测修饰白蛋白来预测肾病的发作比用常规RIA更有效。
实施例5
图16是一示意图，表示完整的滤过蛋白可以被正常功能的肾和病变的肾所降解的方式。
图17所示为胰蛋白酶消化的白蛋白样品的HPLC图谱，所述白蛋白已通过一个截留分子量为30000的膜过滤。滤液在2-30分钟产生许多洗脱峰。
图18所示为一个对照的正常受试者的HPLC图谱，图中显示洗脱时间在10-30分钟时，出现了许多片段。而患巨量白蛋白尿(1457毫克/分钟)的糖尿病患者的HPLC图谱在10-30分钟时却表现出显著不同的片段图谱。
图19所示为患有肾病的受试者的HPLC图谱。和图18比较，滤过蛋白的片段化过程被抑制了。片段的数目减少了而片段的大小却增加了。
所有这些文献以其全部内容在此引作参考。
最后，可以理解，在不偏离本发明在此概括的精神的前提下，可以进行其他不同的修饰和/或改变。
权利要求
1.一种诊断受试者的肾病和/或疾病的肾病并发症的方法，其包括a)获得受试者的尿样；b)将尿样上样到一个装置上，从而产生(crate)尿蛋白的片段图谱；c)用蛋白酶处理不同状态的患者的尿样，从而蛋白水解切割尿样中的蛋白；d)将经蛋白水解处理的尿样上样到一个装置上，以产生(crate)一个这种处理的尿蛋白片段图谱；e)比较步骤c)和d)得到的片段图谱，其中蛋白图谱是受试者肾发生病变的指征。
2.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白片段图谱在大小和序列上和源自完整滤过蛋白的特定片段进行比较。
3.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白片段图谱在蛋白的酶剪切位点进行比较。
4.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白片段图谱和对照样品的蛋白片段图谱进行比较。
5.根据权利要求1所述的方法，其中装置是层析，电泳或沉降装置。
6.根据权利要求1所述的方法，其中装置是层析，电泳或沉降装置。
7.根据权利要求1所述的方法，其中装置是一维或两维或三维的电泳装置。
8.根据权利要求1所述的方法，其中装置是HPLC装置。5.根据权利要求1所述的方法，其中装置是质谱装置。
9.根据权利要求1所述的方法，还包括对氨基酸进行测序以确定肽序列的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤在一段时间内可以重复使用。
11.根据权利要求1所述的方法，其中片段图谱在一段时间的变化表示早期肾病。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述疾病选自肾病，尿崩症，I型糖尿病，II型糖尿病，肾病(肾小球肾炎，细菌和病毒性肾小球肾炎，甲型球蛋白肾病，和过敏性紫斑症，膜增生性肾小球肾炎，膜性肾病，休格连氏干燥症，肾病综合症(微小变化疾病，局部性肾丝球硬化症和相关紊乱)，急性肾功能衰竭，急性肾小管间质性肾炎，肾盂肾炎，泌尿生殖系统炎性疾病，子痫前症，肾移植排斥反应，麻风，反流性肾病，肾结石)，遗传性肾病(髓质囊性病，髓质海绵肾疾，多囊肾(常染色体显性遗传性多囊肾，常染色体隐性遗传性多囊肾，结节性硬化)，脊髓血管瘤症，家族性薄肾小球基膜疾病，胶原蛋白III肾小球病，纤维连接蛋白肾小球病，阿颇特症候群，法布瑞氏症，甲髌综合征，先天性泌尿异常)，浆细胞恶病质症(多发性骨髓瘤，淀粉样蛋白病及相关紊乱)，发热病(家族性地中海热，HIV感染-AIDS)，炎性疾病(全身性血管炎(结节性多动脉炎，韦格纳肉牙肿病，多动脉炎，坏死性和新月体性肾小球肾炎)，多发性肌炎-皮肌炎，胰腺炎，类风湿关节炎，全身性红斑狼疮，痛风)，血液病(镰状细胞贫血病，血栓性血小板低下性紫斑症，溶血性尿毒症候群，急性皮质坏死，肾血栓栓塞)，创伤和外科手术(大面积损伤，烧伤，腹部和血管手术，麻醉的诱导)，药物(青霉胺，类固醇类)以及滥用药物，恶性疾病(上皮(肺，胸)，腺癌(肾)，黑素瘤，淋巴网状组织，多发性骨髓瘤)，循环系统疾病(心肌梗塞，心脏衰竭，外周血管疾病，高血压，冠心病，心血管非动脉硬化疾病，心血管动脉硬化疾病)，皮肤病(牛皮藓，全身性硬皮病)，呼吸道疾病(COPD，阻塞性睡眠息症，高海拔hypoia)和内分泌疾病(肢端巨大症，糖尿病，尿崩症)。
13.根据权利要求1所述的方法，其中蛋白选自白球蛋白，球蛋白(α-球蛋白(α1-球蛋白，α2-球蛋白)，β-球蛋白，γ-球蛋白)，优球蛋白，假球蛋白I和II，血纤蛋白原，α1酸性糖蛋白(血清类粘蛋白)，α1糖蛋白，α1脂蛋白，血浆铜蓝蛋白，α2 19S糖蛋白，β1转铁蛋白，β1脂蛋白，免疫球蛋白A，E，G和M，辣根过氧化物酶，乳酸脱氢酶，葡糖氧化酶，肌球蛋白，溶菌酶，蛋白激素，生长激素，胰岛素或甲状旁腺激素。
14.一种诊断受试者非肾病的方法，其包括a)获得受试者的尿样；b)将尿样上样到一个装置上，从而产生(crate)尿蛋白的片段图谱；c)用蛋白酶处理不同状态的患者的尿样，从而蛋白水解切割尿样中的蛋白；d)将经蛋白水解处理的尿样上样到一个装置上，从而产生(crate)一个这种处理的尿蛋白片段图谱；e)比较步骤(c)和(d)得到的片段图谱，其中蛋白图谱是受试者肾发生病变的指征。
15.根据权利要求14所述的方法，其中这种疾病会引起进入循环系统的蛋白水平上升。
16.根据权利要求1所述的方法，其中这种疾病包括癌症。
全文摘要
本发明根据大小，和源自完整滤过蛋白特定片段的序列以及蛋白多肽链上酶切割的位点提供了一种产生和分析蛋白质片段图谱的方法，而这个蛋白质片段图是病态肾的特征。在肾通过过程中，滤过蛋白被降解，出于这点考虑，本发明描述的方法也能用来检测衍生自非肾病产生的蛋白的蛋白片段。这些滤过蛋白的尿分析目前检测不到这些蛋白的完整形式。因此，用来检测和分析肾通过过程中由降解产生的片段的方法能够检测疾病的严重性。
文档编号G01N30/34GK1520462SQ02812985
公开日2004年8月11日 申请日期2002年6月27日 优先权日2001年6月28日
发明者韦恩·D·康珀, 韦恩 D 康珀 申请人:莫纳什大学