专利名称：检测单纯疱疹病毒I型抗体IgM的免疫胶体金试剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测抗体的免疫胶体金试剂，还涉及该试剂的制备方法。
背景技术：
现有用于检测单纯疱疹病毒I型抗体IgM的方法主要有酶联免疫吸附、放射免疫试验、免疫胶体金渗滤法、免疫印迹试验(WBA)等。酶联免疫吸附(EIA)方法的缺陷是需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用；检测操作人员需要经过专业培训；操作过程相对比较复杂，检测所需时间比较长；检测所需费用较高，不能实现单人份检测。免疫胶体金渗滤法的缺陷是操作过程相对比较复杂，不能实现一步操作；试剂需要低温保存；检测所需费用较高；检测所需时间比胶体金免疫层析法要长。放射免疫试验的缺陷是操作人员需要经过专业培训；操作过程复杂，要求高；试剂需要低温保存；由于试验涉及到放射性同位素，试验不是很安全，所以很少采用；检测费用较高；检测所需时间长。免疫印迹试验(WBA)的缺陷是操作人员需要经过专业培训；操作过程复杂，要求高；试剂需要低温保存；目前尚无商品化的HSV血清抗体的蛋白印迹检测试剂盒面世，这种方法仅限于某些专业实验室中进行；检测费用高；检测所需时间长。
发明内容
本发明的目的是为了克服当前技术在推广使用中存在的缺陷，提供一种不需要特定仪器设备辅助的检测试剂，并且能有效地降低检测成本，减轻需检测人员的负担。同时提供该试剂的制备方法。
检测单纯疱疹病毒I型抗体IgM的免疫胶体金试剂包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，PVC背衬一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫包被了抗u链单克隆抗体—胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上包被了单纯疱疹病毒I型特异性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG。
该试剂的制备方法包括以下步骤(1)制备单克隆抗体取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代，用人源性的u链注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯抗u链单克隆抗体；(2)制备多克隆抗体用人源性的u链多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，纯化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；(3)制备胶体金用柠檬酸三钠等还原剂将氯金酸还原成20nm～40nm的胶体金颗粒；(4)制备抗u链单克隆抗体胶体金标记物将胶体金与单克隆抗体按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混匀，使胶体金与抗体形成稳定的复合物，通过纯化浓缩形成抗u链单克隆抗体—胶体金标记物；(4)将抗u链单克隆抗体胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将抗单纯疱疹病毒I型特异性表面膜抗原和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜的检测区和控制区，充分干燥。
本发明的积极效果在于价格低廉，生产流程简单，成本低，检测的费用比使用其它检测方法要便宜得多；检测速度快，全过程只需30分钟，可以实现自我检测；可以现场检测；特异性好、灵敏度高、重复性好；操作简便，快速定性，结果准确、快速，操作简便，无需冲洗过程和标准对照，可分批或单个样品及时检测；易于推广使用，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作。
具体实施例方式
将PVC背衬一端依次粘附样品垫、包被了抗u链单克隆抗体和胶体金结合物的结合垫，中间粘附包被了单纯疱疹病毒I型特异性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG的硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。
按以下步骤制备(1)制备单克隆抗体取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代，用人源性的u链注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯抗u链单克隆抗体；(2)制备多克隆抗体用人源性的u链多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，纯化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；(3)制备胶体金将100ml 0.01％氯化金用0.9ml 1％柠檬酸三钠还原成40nm大小的颗粒；(4)制备抗u链单克隆抗体胶体金标记物用0.1mol/LK2CO3将胶体金溶液的pH值调至8.2左右，将胶体金溶液与单克隆抗体按100ml胶体金溶液中加入1mg单克隆抗体的比例混合均匀，使胶体金与抗体形成稳定的胶体金复合物，再通过多次离心、弃上清、清洗，通过纯化浓缩形成抗u链单克隆抗体—胶体金标记物，冷藏备用；(5)用Biodot点膜机将抗u链单克隆抗体胶体金标记物喷涂在胶体金结合垫上，将抗单纯疱疹病毒I型特异性表面膜抗原和羊(兔)抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上，充分干燥；(6)将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫、吸水垫等依次粘在PVC背衬上；(7)将粘好的PVC材料切成一定宽度的试剂条，即制成检测单纯疱疹病毒I型抗体IgM的免疫胶体金试剂。
在检测前先将样本和试剂条(板)放在室温条件下放置一段时间(10分钟)，使其恢复至室温；从铝箔袋中取出检测试剂条，按MARK线下箭头所示的方向将试剂条浸入样本溶液中，液面不得超过MARK线，5秒～8秒后取出，平放在操作台上；如果是试剂板从铝箔袋中取出检测试剂板，平放在操作台上，往加样孔中滴加3滴(约120ul)样品溶液(血清)；3分钟～15分钟内即可判断结果，30分钟后判断的结果为无效。
结果判断如果样品中有要检测的“单纯疱疹病毒I型抗体IgM”存在，则检测线处出现红色条带，同时质控线上也出现红色条带，此时结果为阳性；如果样品中没有要检测的“单纯疱疹病毒I型抗体IgM”存在，则检测线处无条带出现，但质控线上出现红色条带，此时结果为阴性。如果质控线上没有红色条带出现，则产品无效。
权利要求
1.检测单纯疱疹病毒I型抗体IgM的免疫胶体金试剂及制备方法，该试剂包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，PVC背衬一端依次粘附样品垫、结合垫，中间粘附硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫，其特征在于结合垫包被了抗u链单克隆抗体-胶体金的结合物，硝酸纤维素膜上包被了单纯疱疹病毒I型特异性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的检测单纯疱疹病毒I型抗体IgM的免疫胶体金试剂及制备方法，其特征在于该试剂的制备方法包括以下步骤(1)制备单克隆抗体取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代，用人源性的u链注射BALB/C小鼠腹腔，收取腹水，以亲和层析法提纯抗u链单克隆抗体；(2)制备多克隆抗体用人源性的u链多次免疫小鼠，提取抗血清免疫山羊或家兔，纯化后得羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG；(3)制备胶体金用柠檬酸三钠等还原剂将氯金酸还原成20nm～40nm的胶体金颗粒；(4)制备抗u链单克隆抗体胶体金标记物将胶体金与单克隆抗体按1∶0.005～0.015(ml/mg)比例混匀，使胶体金与抗体形成稳定的复合物，通过纯化浓缩形成抗u链单克隆抗体—胶体金标记物；(4)将抗u链单克隆抗体胶体金标记物包被在胶体金结合垫上，将抗单纯疱疹病毒I型特异性表面膜抗原和羊(兔)抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜的检测区和控制区，充分干燥。
全文摘要
检测单纯疱疹病毒I型抗体IgM的免疫胶体金试剂及制备方法，该试剂将PVC背衬一端依次粘附样品垫、包被了抗u链单克隆抗体和胶体金结合物的结合垫，中间粘附包被了单纯疱疹病毒I型特异性表面膜抗原和羊(或兔)抗鼠IgG的硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。该试剂是一种特异性强、敏感性高、简易快速、费用低廉、能现场检测，全过程只需30分钟，操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作。
文档编号G01N33/569GK1431505SQ0311513
公开日2003年7月23日 申请日期2003年1月24日 优先权日2003年1月24日
发明者张少恩 申请人:湖州瑞泽生物技术有限公司