专利名称：通过使用石英振荡器测量痕量物质的方法
技术领域：
本发明涉及测量环境中痕量物质浓度的简单且极其精确的方法。更具体地，本发明涉及利用石英振荡器，和在结合蛋白质的二氧芑络合物和二氧芑之间的抗原-抗体反应中的竞争性反应的测量方法，和容易地测量环境中存在的痕量二氧芑含量的测量方法，以及获得二氧芑毒性等价量(TEQ)的测量方法。
背景技术：
近年来，因来自二氧芑等的环境激素和其它的环境污染已产生严重的社会问题。为了保护地球环境，要求可测量含量从ppm到ppt的化学物质的高等级的化学测量技术，以便研究这些环境污染物的爆发情况和暴露情况的实际状况。此外，为了改进监测精度，需要增加测量用样品和进行测量的次数这二者。
由于二氧芑具有许多异构体和同系物，和二氧芑以非常低的含量存在于环境中，因此不容易分析它们。目前气相色谱/质谱(GC/MS)法是最可靠的方法，和它广泛用于正式测量二氧芑。在GC/MS法中，在通过气相色谱分离蒸发的样品组分之后，通过离子化和质量分析来检测目标物质。
尽管通过GC/MS法的测量值具有可靠性，但设备和专用试剂昂贵。此外，需要要求熟练技术的样品预处理。也就是说，在注入到分析仪之前，需要尽可能地除去测量干扰物质，和此外，由于样品内极低、痕量的二氧芑导致需要事先浓缩二氧芑。在这些预处理中使用各种专用的玻璃设备，其中所述预处理由具有高等级技术的熟练分析者在数天的时间段内人工进行。结果，GC/MS法要求许多时间和分析用成本，和限制了监控频率的增加。
比GC/MS法更简单、更快速和不那么昂贵的方法是酶标记免疫分析法(ELISA方法)，该方法利用抗原-抗体反应作为中心。利用酶活性，使用通过共价键结合到酶上的抗原或抗体作为探针，ELISA法从而被用于检测抗体或抗原的存在。
尽管ELISA法比GC/MS法更简单、快速和不那么昂贵，但ELISA法可测量的最低水平是ng/ml单位(ppb单位)，而GC/MS法可测量的程度为pg/ml(ppt单位)。结果，仅半定量地使用ELISA法，在筛选的水平上监控，以供精确分析的需要。额外地，在ELISA法中需要抗体或抗原的标记处理。
另一方面，作为利用生物亲和性的痕量成分的测量方法如免疫反应和其它，正在研究一种利用表面胞质基因组共振(SPR)方法的生物传感器(Karube等，Analytica Chimica Acta，304(1995)139-145；Karube等，Analytica Chimica Acta，434(2001)223-230)，和使用石英振荡器的测量方法。
使用石英振荡器的测量方法通过吸附物质到石英振荡器的表面上并使用石英振荡器频率的变化可检测并测量痕量成分，其中所述振荡器频率的变化与所吸附的物质的重量成正比。结果，完全不需要用放射性同位素、染料、荧光物质、酶、自由基探针标记处理用于测量的抗体、次级抗体或抗原，从而使得容易、快速和便宜的测量变得可能。
石英振荡器在许多电子电路如钟表、计算机和通信/测量设备中用作高精度和稳定的振荡元件。此外，石英振荡器被称为石英晶体微量天平(QCM)，这是因为石英振荡器通过将在其电极上的粘着物重量定量地转化成振荡器频率的变化，从而能在从ng到fg的数量级上高灵敏地分析，和它除用作薄膜厚度测量计和化学传感器外还用作生物传感器。
使用石英振荡器测量痕量成分的通常方法是通过具有事先在石英振荡器表面上吸附/固定的识别元素并使之与被分析物反应，和获得反应之前和之后的频率变化，从而测量被分析物和识别元素之间的反应性，和被分析物的质量。
作为测量抗原-抗体反应的方法，例如提出了以下提及的方法，其中所述方法使用能特异地键合到作为抗原的被分析物上的抗体作为识别元素，进而使识别元素与石英振荡器结合。
在JP-A-63-11835所述的方法中，使用抗原或抗体固定在其表面上的石英振荡器生物传感器，在所述方法中，通过抗原-抗体反应，使固定抗体或抗原的胶乳或其它微粒进一步结合到通过抗原-抗体反应结合的基材上，从而放大石英振荡器生物传感器的灵敏度。
另一方面，在JP-A-03-77601所述的方法中，抗原或抗体在液体介质中与朝向该抗原或抗体的支持抗体或抗原的不溶性载体颗粒反应，同时允许不参与这种反应的固定在其上的抗原或抗体的石英振荡器在液体介质内振荡，从而测量石英振荡器振荡频率的变化，所述频率变化归因于因反应引起的凝块形成。
然而，在JP-A-63-11835和JP-A-03-77601所述的任何方法中，对于抗原来说，重要的是含多个抗体结合位点的聚合物。因此，当被分析物是低分子量物质如环境污染物，其中包括二氧芑等时，或当被分析物仅具有一个抗体结合位点时，抗原或抗体固定在其上的胶乳不可能结合到被分析物上，或者抗原或抗体固定在其上的不溶性载体形成凝块，使得不能结合到石英振荡器上，从而导致难以测量。
作为实例，为了解决该问题，在日本专利申请Nos.2001-117308和2001-117309以及在Xi Chun Zhou等的Analyst，2001，126，pp.71-78中披露了下述方法，该方法包括使用竞争性反应，允许多种被分析物结合到蛋白质聚合物上，形成与测试样品内的被分析物竞争的竞争性标准物质。根据这些文献中披露的方法，在测试样品内存在的较大量的被分析物导致更有效地防止竞争性标准物质结合到石英振荡器表面上的识别元素上，从而导致降低的频率变化。因此，甚至当测量目标为低分子量物质时，或当它是仅含一个抗体结合位点的物质时，高度敏感和高度精确的测量变得可能。
然而，以上提及的使用石英振荡器的任一方法测量含简单物质的模型溶液。在现实世界的环境中，多种物质共存。例如，在二氧芑用模型溶液中，仅存在2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑(2，3，7，8-TCDD)，但在实际的取自环境的样品(例如，来自焚烧工厂的粉煤灰的提取物)中，具有以各种浓度共存于样品内的大于100种多组分的二氧芑和呋喃。
另一方面，在抗原-抗体反应过程中，磷酸盐缓冲的盐水(PBS)用作溶剂，但当不溶于水的物质，如二氧芑是测量目标时，将二甲亚砜(DMSO)和表面活性剂(含有0.05％Tween 20(商品名，由Sigma Chemical Co.制备)的磷酸盐缓冲液)与PBS混合，以使测量目标可溶。在此情况下，当在DMSO和表面活性剂的影响下固定到石英振荡器上的抗体的高级结构变化时，将不能识别单独的特定被分析物，因此将使用稳定剂以维持抗体的高级结构。因此，作为这种稳定剂，迄今为止使用牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白水解物、改性蛋白质或类似物。
然而，当测量环境样品时，常规稳定剂的稳定效果较低，和该效果不可能维持抗体的高级结构；和因此，即使使用能特异地结合到行为类似于抗原的被分析物上的抗体，也可能发生类似于被分析物的与基质的抗原-抗体反应，因此在包括多种组分的环境的混合物体系中难以进行准确测量。例如，当在环境样品内的2，3，7，8-TCDD被作为测量目标处理时，仅对2，3，7，8-TCDD显示出选择性的单克隆抗体一般不可能识别测量目标，因此不能带来准确的测量。结果，没有报道过取自环境的样品已实际上通过使用常规石英振荡器的方法来测量。
此外，当筛选(环境监控)二氧芑时，需要制备大量(相当于分析测试样品的数量)的固定抗二氧芑抗体的石英振荡器，所述石英振荡器必须储存，以便一次分析许多测试样品。
然而，由于当使用常规的稳定剂时，不可能长期储存石英振荡器，这是因为抗体的高级结构随时间流逝会劣化，和不可能识别单独的特定被分析物，因此不可能进行准确的测量。
另一方面，由于二氧芑的毒性随二氧芑的变体的不同而不同，从环境监控的角度考虑，在环境内的毒性等价量(TEQ)是重要的。此处，通过用实际测量的浓度乘以毒性等价系数，推导出毒性等价量。然而，由于使用石英振荡器，通过常规测量方法，难以准确地测量含多种组分的环境的混合物体系，因此也难以准确地测量毒性等价量。
根据下述说明，并结合附图，本发明的其它和进一步的特征与优点将更充分地变得显而易见。
图1是显示放置在石英振荡器上的识别元素(抗体)与稳定剂之间关系的前视图。
图2是显示2，3，7，8-TCDD浓度与本发明的石英振荡器的振荡频率的变化之间关系的图表。
图3是显示通过ELISA方法的测量结果和根据本发明方法的测量结果之间关系的图表。
图4是显示通过GC/MS方法的测量结果和根据本发明方法的测量结果之间关系的图表。
发明内容
本发明在于测量取自环境的样品或取自生物的样品内二氧芑浓度的方法，该方法包括使用石英振荡器；和测量其毒性等价量的方法。
本发明的最佳实施方式以下进一步解释本发明。
也就是说，本发明提供下述(1)一种测量方法，该方法包括将样品固定在具有识别元素和所述识别元素用稳定剂固定在其上的石英振荡器上，其中所述识别元素对特定被分析物具有特异结合能力，所述稳定剂包括合成聚合物；测量频率的变化量；比较该结果与通过使用竞争性标准物质获得的石英振荡器的频率变化量；和从而测量在被测量的样品内所述被分析物的含量。
(2)测量取自环境的样品或取自生物的样品内痕量成分的测量方法，该方法包括将样品固定在具有识别元素和所述识别元素用稳定剂固定在其上的石英振荡器上，其中所述识别元素对特定的多组分被分析物具有特异结合能力，所述稳定剂包括合成聚合物；
测量频率的变化量；比较该结果与通过使用竞争性标准物质获得的石英振荡器的频率变化量；和从而测量在被测量的样品内所述被分析物的含量。
(3)根据条目(1)或(2)的测量方法，该方法包括使用凝结元素(clot element)，所述凝结元素具有固定在不溶性载体颗粒上的识别元素；使在石英振荡器上的所述凝结元素和识别元素特异地结合到被分析物上；和进而放大并测量石英振荡器频率的变化。
(4)根据条目(1)-(3)任何一项的测量方法，其中被分析物是取自环境或取自生物的二氧芑、呋喃和溴化二氧芑。
(5)根据条目(1)-(4)任何一项的测量方法，其中被分析物是取自环境或取自生物的二氧芑，和识别元素是单克隆或多克隆抗体，所述单克隆或多克隆抗体可特异地结合到被认为是抗原的二氧芑上。
(6)根据条目(5)的测量方法，其中识别元素是IgG、IgM、Fab、F(ab′)2或ScFv，它们是单克隆或多克隆抗体。
(7)根据条目(4)-(6)任何一项的测量方法，该方法包括在含合成聚合物的稳定剂的共存下，固定单克隆或多克隆抗体在石英振荡器上，所述单克隆或多克隆抗体可特异地结合到被认为是抗原的二氧芑上；在储存数天之后，进行抗原-抗体反应；和从而测量二氧芑的浓度。
(8)根据条目(1)-(7)任何一项的测量方法，其中该方法包括使用小尺寸的传感器系统，所述传感器系统是干电池驱动型或电池驱动型频率指示器和振荡电路的联合，或者由组合所述传感器系统和收集数据并控制用计算机形成的系统，从而测量石英振荡器的频率变化量。
(9)根据条目(1)-(8)任何一项的测量方法，所述方法包括结合石英振荡器到微型通道上，所述微型通道具有样品的提取/预处理功能，或将石英振荡器嵌入到微型通道内；并使用微型通道型化学反应系统，所述系统会加速在微型反应空间内的抗原-抗体反应时间。
(10)根据条目(1)-(9)任何一项的测量方法，其中作为被分析物的二氧芑是2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑。
(11)根据条目(1)-(10)任何一项的测量方法，所述方法包括通过高速溶剂萃取方法，从取自环境的样品或取自生物的样品中提出被分析物，并进行浓缩/清洗预处理。
(12)一种测量二氧芑的毒性等价量的测量方法，所述方法包括通过权利要求1-11任何一项的方法测量2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑的浓度，并测量全部样品的毒性等价量。
(13)用于条目(1)-(12)任何一项的方法的生物芯片，所述生物芯片包括具有识别元素和所述识别元素用稳定剂固定在其上的石英振荡器，其中所述识别元素对特定被分析物具有特异结合能力，所述稳定剂包括合成聚合物。
以下将详细地解释本发明。
首先，解释测量本发明浓度的方法。
本发明的特征在于使用含特定合成聚合物的稳定剂，和将识别元素固定在石英振荡器上，所述识别元素对包含在多组分的污染材料内的被分析物具有特异的结合能力，和将多种被分析物结合到聚合物蛋白质和类似物上，并将这看成为竞争性标准物质，和使用该竞争性反应，使之与测试样品内的被分析物竞争。在本发明中，通过使用含特定合成聚合物的稳定剂，可使用石英振荡器，准确地测量含多种组分的混合物体系的浓度，而这不能通过常规方法来测量。
抗体的抗原识别具有目标分子的空间结构的二级或三级高级结构，和尤其需要稳定三级高级结构，所述三级高级结构由Fab部分的末端后部的氨基酸序列(它是抗体的抗原识别位点)组成。同样需要稳定抗体结构对抗所有各种外部变化(温度、脱水、pH、离子强度)。本发明所使用的稳定剂能稳定这些。
在本发明的说明书中。稳定剂(也称为“阻止剂”)是提供(1)降低抗原的非特异吸附(选择性、敏感度的改进)和(2)维持高级结构的试剂，而维持高级结构是在免疫传感器过程中或在酶固定的免疫测定、固相放射免疫测定等的抗原-抗体反应过程中抗体的分子识别能力的基础(抗体的稳定性、持久性的改进)。
图1是显示放置在石英振荡器上的识别元素(抗体)与稳定剂之间关系的例示图。图1上方的一排示出了常规技术的实例，和下方的一排示出了本发明的实例。以下参考图1解释常规稳定剂和本发明稳定剂的差别。
在其中抗体3固定在其上的石英振荡器1的金电极2的表面处，能常规地使用的稳定剂5被物理吸附或化学结合到其中抗体3没有固定在其上的空间上，并进行排斥(或限制)样品内除被分析物以外的共存蛋白质的作用，以便在其中抗体3没有固定在其上的部分石英振荡器1上非特异地吸附。根据这一点，能在石英振荡器上获得单独的抗原-抗体反应的净应答。这一作用可类似地应用到本发明所使用的稳定剂4上。
然而，由于常规的稳定剂5大多数是取自生物的产品，如BSA和变性蛋白质，其本身不存在稳定作用，因此随着时间流逝，稳定剂5变性为稳定剂7，和它不可能维持抗体3的高级结构。由于这一点，抗体3变性为抗体6并与除特定被分析物以外的物质反应，因此不能单独地准确测量特定的被分析物。
与之相比较，由于在本发明中使用的稳定剂4本身对温度升高、时间变化、pH变化等具有耐久性，因此，相对于温度升高、时间变化、pH变化等，抗体3的活性下降很少，且因此抗体3的稳定高级结构得以维持，和能在抗体3固定在石英振荡器1上的状态下保持数天。
至于稳定剂，从维持抗体高级结构的角度考虑，使用化学结构类似于生物膜的化合物。例如，可提及由含磷酰胆碱基团的化合物的单元等组成的水溶性聚合物，所述化合物包括类似于构成细胞膜的脂质体的极性基团的结构，和至于具体实例，可提及由2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰胆碱(MPC)单元等组成的聚合物。MPC聚合物可以是均聚物、无规共聚物、嵌段共聚物、接枝聚合物、大分子单体的丙烯酸酯衍生物、富马酸乙酯的衍生物、苯乙烯衍生物和类似物。可通过在JP-A-06-313009、JP-A-10-296063、JP-A-2001-261740等中所述的方法制备MPC聚合物。
将包括类似于生物膜的化学结构的这些化合物溶解在PBS溶液中并用作稳定剂。至于稳定剂的具体实例，可提及Block Ace(商品名，由Snow Brand Milk Products Co.，Ltd.制备)、Lipidure(商品名，由NOFCorporation制备)或StabilGuard(商品名，由SurModics，Inc.制备)。
所使用的稳定剂的浓度与用量可随稳定剂的类型的变化而变化，和在StabilGuard(商品名)的情况下，原样地使用初始溶液，和在Lipidure(商品名)的情况下，以在10mM PBS(pH7.0)内0.01-25％质量，优选0.1-5％质量，更优选0.2％质量的溶液形式使用它，对于石英振荡器的电极(电极直径0.5cm，电极面积0.196cm2)来说，同样优选使用0.01-0.05ml，更优选0.015-0.03ml。
一般地，在抗原-抗体反应中，磷酸盐缓冲的盐水(PBS)用作溶剂，但当在水中难以增溶的物质，如二氧芑是测量目标时，优选在PBS内混合二甲亚砜(DMSO)以增溶测量目标。优选以10-50％，更优选以25％的体积比混合DMSO。也可混合表面活性剂并替代DMSO使用。作为表面活性剂，例如可使用向其中添加了0.05％Tween 20(商品名，由SigmaChemical Co.制备)的磷酸盐缓冲液，且优选以0.01-5％，更优选以0.03-1％的体积比混合它。
没有特别限制本发明中的被分析物，和可提及，例如取自环境的样品如焚烧工厂的燃烧灰烬、粉煤灰、土、在燃烧器内部的残渣、污染的土壤、凝结的沉积物、污水、废水、地下水、河/湖/沼泽的水、淤泥，和包含在取自生物的样品内的痕量成分，如母牛的牛奶、母乳、血液、尿、体液、细胞组织。至于痕量成分，可提及，例如来自所谓的环境激素和类似物的环境污染物(它们被列为内分泌破坏剂)，如共面的PCB、呋喃、二氧芑、溴化二氧芑，和在人体内的痕量激素和类似物。此处所使用的术语“二氧芑”是多氯化二苯并对二氧芑(PCDD)和多氯化二苯并呋喃(PCDF)，和作为具体实例，可提及2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑和2，3，7，8-四氯二苯并呋喃。
在本发明中，可高灵敏地测量被分析物，甚至当它是低分子量物质(所述低分子量物质具有约100-1000的分子量)或仅具有一个抗体结合位点的物质时。
在本发明中，多个被分析物结合到聚合物蛋白质上，其中在允许它与测试样品内的被分析物竞争的反应中，所述聚合物蛋白质用作竞争性标准物质。本发明所使用的竞争性标准物质是结合到蛋白质聚合物上的多种被分析物。
没有特别限制蛋白质，和鉴于可获得性和经济因素，合适地使用例如血清白蛋白(它是在生物化学领域中广泛使用的分子量为数万的蛋白质)以及酶如过氧化物酶、β-半乳糖苷酶。
作为使多种被分析物结合到蛋白质聚合物上的方法，可提及，例如混合酸酐法、N-羟基琥珀酰亚胺法、相同反应性交联法、N-(间马来酰亚胺基苯甲酰氧基)琥珀酰亚胺型交联法或类似方法。
通过使用识别元素固定在其上的石英振荡器测量被分析物。
至于本发明所使用的石英振荡器，可使用常规地使用的那种，和关于它的变体，可提及例如AT Cut、GT Cut、BT Cut等，和电极材料可优选金、银和类似物。
没有特别限制石英振荡器的振荡频率，和它应当根据用途合适地选择，和可优选5-50MHz，和可更优选9-30MHz。当振荡频率小于5MHz时，灵敏度不足，和当它超过50MHz时，将产生噪音，影响实际应用。
通过固定识别元素和稳定剂在石英振荡器上，从而制备生物芯片。
没有特别限制固定识别元素到石英振荡器上的方法，和可通过常规方式进行。例如，可提及包括在石英振荡器的金电极表面上半胱胺处理之后戊二醛处理，接着允许识别元素吸附到表面上的方法。
固定在石英振荡器上的识别元素具有对被分析物特异的结合能力。没有特别限制本发明所使用的识别元素，只要产品特异地结合被分析物即可，和例如可提及产生与被分析物抗原-抗体反应的抗体，特异地识别被分析物的受体分子等。
至于经历与被分析物抗原-抗体反应的抗体，可提及，例如通过使用被分析物和半抗原化被分析物作为抗原，使动物如兔子、山羊、绵羊免疫而制备的单克隆抗体、多克隆抗体(IgG、IgM或类似物)或类似物。至于抗体，可使用例如，通过酶处理等获得的F(ab′)2、Fab′、Fab，和此外，可使用通过基因重组技术制备的Fab′、scFv和类似物。
对于识别被分析物的受体分子没有特别限制，和例如已知二氧芑结合到Ah(烯丙基烃)受体上，和因此可使用这种受体。
此外，作为识别元素，可使用具有结合到被分析物上的能力的肽、DNA或类似物，和可使用通过分子印记法制备的对被分析物具有补充结合位点的聚合物。
将识别元素固定在石英振荡器上，和优选通过固定游离的识别元素到不溶性载体颗粒上来形成凝结元素。通过在固定于石英振荡器上的识别元素和凝结元素之间夹入竞争性标准物质的络合物，使重量增加，结果将放大频率的变化量，和可检测/定量化浓度远远较低的被分析物。当识别元素是经历与被分析物抗原-抗体反应的抗体时，凝结元素将起到次级抗体的作用。
至于本发明中使用的不溶性载体颗粒，没有特别限制，只要它基本上不溶于本发明中使用的液体介质即可。可提及，例如由有机聚合物物质如聚苯乙烯、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-苯乙烯磺酸钠共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、苯乙烯-氯代甲基苯乙烯共聚物、氯化聚苯乙烯组成的颗粒；无机氧化物微粒如氧化硅、氧化硅-氧化铝；磁性金属微粒如用有机薄层涂布的铁氧体或类似物。
颗粒的直径可以较大，只要它可稳定地分散在液体介质中，以便产生振荡频率的足量变化即可，和优选0.01微米-1微米，更优选0.05微米-0.5微米。
没有特别限制通过允许由不溶性载体颗粒承载识别元素形成凝结元素的方法，和可通过常规方式进行。例如，可提及使用偶联剂等用于不溶性载体颗粒的化学吸附方法，在作为不溶性载体颗粒的颗粒表面上使用胶乳(它是具有反应性官能团的聚合物物质)的化学吸附方法，或者利用疏水相互作用等的物理吸附方法。
没有特别限制凝结元素的浓度，和可合适地确立，和优选为0.01-1.0％质量，更优选0.05-0.5％质量。若它小于0.01％质量，则将不充分发生抗原-抗体反应，和若它大于1.0％质量，则凝结元素难以稳定地分散在液体介质中。
作为本发明中使用的设备，可使用例如在JP-A-03-77601中所述的设备。在测量设备中，石英振荡器末端被连接到测量系统上，所述测量系统包括振荡电路以及计算频率和处理数据的微机。
此外，通过使用小尺寸的传感器系统(它是集成干电池驱动型或电池驱动型频率指示器和振荡电路的单元)，本发明能进行测量。利用它，可用手携带测量设备且可在任何位置处进行测量。
此外，通过将石英振荡器嵌入微型通道内，和使用微型通道型化学反应系统(该系统加速在微型反应空间内的抗原-抗体反应时间)，从而本发明可完成测量。通过使用该系统，可在1分钟以内完成与测试部分内的被分析物的竞争性反应，从而能快速得多的测量。具体地，可使用在Kitamori等，Analytical Chemistry，Vol.73，No.6，1213-1218(2001)，Kitamori等，Analytical Chemistry，Vol.74，No.9，2014-2020(2002)中所述的系统。
在使用其中识别元素是实施例用抗体的方案的情况下，以下将解释本发明的测量方法的一个实施方案。
一旦测量，通过高速溶剂萃取方法，在数小时内萃取取自环境的样品或取自生物的样品，和进行浓缩/清洗预处理。在Kazuto等人的“Aquick dioxin analysis technique which combined high speed solventextraction method and immunoassay”，Journal of Resources andEnviroment，Vol37，No.9，87-91(2001)中公开了高速溶剂萃取方法。通过结合这一预处理，将本发明付诸实施，可根据收集的样品在4-5小时内获得分析结果，而通过常规的正式法由收集的样品来测量需要花费2周。
首先，在缓冲溶液或类似物的液体介质中浸渍石英振荡器，所述石英振荡器进行各种各样的化学处理以固定抗体或类似物，同时允许通过搅拌器以恒定的速度初步搅拌液体介质，其中所述液体介质放在恒温器室内以供测量。或者将已经历各种各样的化学处理来固定抗体或类似物的石英振荡器放在恒温器室内以供测量，和如下所述进行抗体的固定操作。
至于在本发明中使用的液体介质的实例，优选磷酸盐缓冲溶液、甘氨酸缓冲溶液、三盐酸(tris hydrochloric acid)缓冲溶液和类似物。考虑到迅速进行抗原-抗体反应和与此同时稳定地振荡，搅拌器的旋转速度优选500-1500rpm，更优选800-1000rpm。同样优选在反应过程中维持恒定的旋转速度。
接下来，制备生物芯片。将石英振荡器浸渍在以上提及的恒温器室内的液体介质中，和振荡，并通过石英振荡器承载抗体。然后在石英振荡器上添加0.1-5％的稳定剂，和之后用水洗涤掉没有固定在石英振荡器上的稳定剂。在干燥石英振荡器之后，或者在溶液中，当振荡频率稳定时，测量频率F1。在本发明中，在通过使用稳定剂固定抗体在石英振荡器上之后，接着储存数天，进行抗原-抗体反应，和可测量二氧芑的浓度。结果，它可制备并保持较大量的抗体固定的石英振荡器(生物芯片)，和一次分析大量的样品。优选在储存期期满之前使用如此生产的生物芯片。在干燥条件下，在25℃下的储存时间段优选1-60天，更优选1-7天。在干燥条件下，在0-4℃下(冰箱条件)，优选1-1000天，更优选1-365天，和特别地不大于30天。
接下来，添加多种抗原结合到其上的蛋白质与含抗原的样品的混合物，于是进行竞争性免疫反应。若此刻抗原包含在测试样品内，则会抑制具有多种抗原结合到其上的蛋白质结合到承载在石英振荡器表面上的抗体上。由于石英振荡器的频率将随着结合到石英振荡器上的物质的重量而下降，因此吸附到石英振荡器上的抗原结合的蛋白质的重量下降导致频率减少的下降。
除去并洗涤掉游离的抗原结合的蛋白质(它没有结合到石英振荡器表面上的抗体上)。在连续搅拌的同时，一旦恒定地稳定的频率测量为值F2。通过从所得的F1中减去F2，来计算频率的变化量ΔF。
尽管在以上提及的测量中反应温度可以是室温，但为了建立石英振荡器的高周期稳定性，优选在25-37℃的环境下操作温度，其中精度为±0.1℃。
在本发明中，通过使用已知浓度的被分析物来作出校正曲线，和通过使用它，计算在测试样品内的被分析物的浓度。
尽管通过用硫酸/含水过氧化氢的混合溶液、高锰酸钾溶液或类似物洗涤和除去固定在表面上的抗体等，可再次使用本发明中使用过的石英振荡器，但可在每次测量之后更换该石英振荡器，因为它便宜，约100yen。
特别地在分析二氧芑的情况下，由于二氧芑的毒性非常高，和必须使在洗涤之后的溶液燃烧和在浓缩之后在1500℃或更高的高温下分解，因此优选基本上作为一次性产品使用石英振荡器。
以下将解释本发明的毒性等价量的测量方法。
在二氧芑的情况下，通过用指定的毒性等价系数乘以每一组分的浓度，可计算每一组分的毒性等价量(TEQ)。由World HealthOrganization/International Programme on ChemicalSafety(WHO/IPCS)规定毒性等价系数。
2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑(2，3，7，8-TCDD)的毒性等价系数为1，和已知当与环境中的其它二氧芑相比时，它与高的毒性等价系数相关。同样已知2，3，7，8-TCDD在环境内的浓度高于其它二氧芑的浓度。因此，通过本发明以上提及的方法测量2，3，7，8-TCDD的浓度，和根据通过使用GC/MS方法事先作出的校正曲线，可测量样品内全部二氧芑的毒性等价量。可将这种毒性等价量的测量方法应用到取自环境的样品和取自生物的样品上。
实施例基于下述实施例，更详细地描述本发明。然而，不通过这些实施例限制本发明。
实施例1<石英振荡器的抗2，3，7，8-TCDD抗体固定和稳定处理>
通过将2，3，7，8-TCDD(它是一种低分子量化合物)视为被分析物进行试验。
使用At Cut(9MHz)的石英振荡器。首先，用硫酸/含水过氧化氢的混合溶液洗涤石英振荡器的金电极表面。在用纯水洗涤之后，在石英振荡器上以2.5L/min循环氮气用于干燥。接下来，石英振荡器的金电极表面用0.01M半胱胺处理，并用1％戊二醛溶液连续处理，和在激活抗体结合之后，用1ml纯水洗涤3次。
接下来，通过在石英振荡器上添加50μg/ml抗2，3，7，8-TCDD单克隆抗体的30微升PBS溶液(pH7.4)，和通过在25℃下反应90分钟，使抗体固定在石英振荡器上。在用1ml纯水洗涤3次之后，在石英振荡器上添加30微升0.02M的甘氨酸溶液，以便覆盖(cap)在石英振荡器上残留的未反应的醛基，和在25℃下进行反应30分钟。在用1ml纯水洗涤3次之后，在石英振荡器上添加30微升0.2％稳定剂-PBS溶液，和在25℃下进行反应90分钟。Lipidure-HM(商品名，由NOF Corporation制备)用作稳定剂。在用1ml纯水洗涤3次之后，在石英振荡器上以2.5L/min的流速循环氮气供干燥，和60分钟之后，测量固定抗体的石英振荡器的振荡频率，和测量值表示为F1。
<抗原-抗体反应I>
以1∶3的比例，将2，3，7，8-TCDD的DMSO溶液混合到100ng/ml2，3，7，8-TCDD结合的卵白蛋白(由Research Diagnostics，Inc.制备)的10mM PBS溶液(pH7.4)内，和将它视为25％的DMSO溶液。通过在0.001、0.01、0.1、1、10和100ng/ml的浓度下溶解2，3，7，8-TCDD来制备竞争性反应的抗原溶液。
将10微升每种抗原溶液加入到以上所述制备的抗2，3，7，8-TCDD抗体固定的石英振荡器上，并在25℃下反应60分钟，进行抗原-抗体反应I。由于抗原-抗体反应象约300MHz一样显著，若判断65％的抗原-抗体反应率足够的话，则可在10分钟的反应时间内完成反应。在完成反应之后，接着用1ml纯水洗涤3次，以2.5L/min的流速在石英振荡器上循环氮气供干燥，和在30分钟之后，测量抗体固定的石英振荡器的振荡频率，和测量值表示为F2。
通过从F1中减去F2计算的数值表示为ΔF1，和结果见表1。此外，图2示出了与2，3，7，8-TCDD浓度之间的关系，并用作校正曲线，用于测量包含从以下提及的实施例1的焚烧工厂的粉煤灰中提取的样品内的二氧芑的浓度。
表1
根据表1，显而易见的是，本发明中可测量低至0.001ng/ml(1pg/ml)到100ng/ml的痕量浓度的2，3，7，8-TCDD。
实施例2<抗原-抗体反应II(通过胶乳试剂的敏化反应)>
通过溶解2，3，7，8-TCDD(由Research Diagnostics，Inc.制备)在1ng/ml的2，3，7，8-TCDD-结合的卵白蛋白(由ResearchDiagnostics，Inc.制备)溶液内，以制备溶液为1ng/ml，和将这视为抗原溶液。以与实施例1相同的方式进行抗原-抗体反应I，然后，在洗涤之后，通过添加10微升抗2，3，7，8-TCDD单克隆抗体固定的抗2，3，7，8-TCDD胶乳悬浮液(固体部分0.01％)到免疫试剂用胶乳(由Sekisui Chemical Co.，Ltd.制备)内，进行抗原-抗体反应II，并在25℃下培育60分钟。在完成反应之后，通过用纯水洗涤，测量抗体固定的石英振荡器的振荡频率，和测量值表示为F3。
通过从F2中减去F3计算的数值表示为ΔF2，结果见表2。
为了参考，将单独的1ng/ml 2，3，7，8-TCDD结合的卵白蛋白(由Research Diagnostics，Inc.制备)溶液(它是竞争性标准物质)作为抗原溶液处理，并以相同的方式测试。结果见表2。
对比例1以与实施例2相同的方式进行试验，所不同的是不使用胶乳试剂和稳定剂。结果见表2。
表2
根据表2，显而易见的是，通过添加胶乳颗粒，频率变化的测量值高10倍或更高，因此在高灵敏度下测量是可能的。
实施例3测试包含在由焚烧工厂的粉煤灰中提取的样品内的2，3，7，8-TCDD的抗原-抗体反应。类似于实施例1，将抗-2，3，7，8-TCDD-抗体固定在石英振荡器上并进行稳定化处理，和通过在作为竞争性反应的标准物的100ng/ml 2，3，7，8-TCDD结合的卵自蛋白(由Research Diagnostics，Inc.制备)溶液内溶解从焚烧工厂的粉煤灰中提取的样品，以1ng/ml制备竞争性反应的溶液，并将这视为抗原溶液。通过使用该溶液，以与实施例1相同的方式进行抗原-抗体反应。结果见表3。
对比例2以与实施例3相同的方式进行试验，所不同的是不使用稳定剂。结果见表3。
表3
根据表3，显而易见的是，当测量环境样品(它为混合物)时，和在未添加稳定剂的情况下，振荡器频率变化的应答显著下降。与此相比，在添加稳定剂的本发明实施例中，频率变化的测量值高10倍或更高，当与其中未添加稳定剂的情况相比时，因此能高灵敏度地测量。
在其中未添加稳定剂的情况下，通过包含在实际环境样品内的高度浓缩的多组分物质或者抗体本身的交叉反应的抑制导致基于抗原-抗体反应的频率变化下降，这导致难以稳定地获得应答。此外，在其中未添加稳定剂的情况下，在测量溶液内各种高度浓缩的多组分物质的混合物如二氧芑、呋喃，不允许抗-2，3，7，8-TCDD单克隆抗体维持高级结构以正常地经历抗原-抗体反应，从而可能导致不正常的频率应答。
实施例4通过ELISA方法测量在实施例3中使用的样品内的2，3，7，8-TCDD的浓度，和研究与通过本发明方法的测量结果的关系。图3示出了结果。图3是显示通过本发明方法的测量结果和通过ELISA方法的测量结果之间关系的图表。
此外，通过GC/MS方法测量相同的样品，和研究与通过本发明方法的测量结果的关系。至于测量设备，使用HP-6890/JMS-700 Mstation(商品名，由JEOL Ltd.制备)作为气相色谱/质谱仪，和MS-MP8220D(商品名，由JEOL Ltd.制备)作为数据处理系统。在GC/MS方法中，测量存在于样品内的单独的二氧芑组分的浓度(如四氯二苯并对二氧芑(TeCDDs)、五氯二苯并对二氧芑(PeCDDs)、六氯二苯并对二氧芑(HeCDDs)、七氯二苯并对二氧芑(HpCDDs)、八氯二苯并对二氧芑(OCDDs)、四氯二苯并呋喃(TeCDFs)、五氯二苯并呋喃(PeCDFs)、六氯二苯并呋喃(HeCDFs)、七氯二苯并呋喃(HpCDFs)、八氯二苯并呋喃(OCDFs))，和通过用各毒性等价系数乘以各组分的浓度计算各组分的毒性等价量，和对各毒性等价量求和，并计算在样品内全部二氧芑的毒性等价量(TEQ)。图4示出了结果。图4是显示通过本发明方法的测量结果和通过GC/MS方法的测量结果之间关系的图表。
根据图3，显而易见的是，通过本发明方法的测量结果与通过ELISA方法的测量结果非常相关。因此，本发明的方法可用作浓度测量方法替代ELISA方法。同样根据图4，显而易见的是，通过本发明方法的测量结果与通过GC/MS方法的测量结果也非常相关。因此，本发明的方法可用作毒性等价测量方法替代GC/MS方法。
实施例5将100ng/ml 2，3，7，8-TCDD-结合的卵白蛋白(由ResearchDiagnostics，Inc.制备)溶液视为抗原溶液，和以与实施例1相同的方式，在石英振荡器上固定抗2，3，7，8-TCDD抗体，且进行稳定化处理。随后，在25℃下储存样品过夜之后，以与实施例1相同的方式进行2，3，7，8-TCDD的抗原-抗体反应的测量实验。测量结果见表4。
对比例3以与实施例5相同的方式制备样品和进行2，3，7，8-TCDD的抗原-抗体反应的测量实验，所不同的是不进行稳定化和过夜储存。测量结果见表4。
对比例4-6以与实施例5相同的方式制备样品和进行2，3，7，8-TCDD的抗原-抗体反应的测量实验，所不同的是不进行稳定化。类似地测试3次，和每次视为对比例4-6。各测量结果见表4。
表4
根据表4，显而易见的是，当用于二氧芑分析的抗体固定的石英振荡器保存过夜时，抗原-抗体反应的数量显著下降。在此情况下，当它没有稳定剂时，基于抗原-抗体反应的频率变化小，和没有稳定地获得应答。
相反，当与没有经历储存过夜的对比例3相比较时，含有稳定剂的本发明实施例显示出稳定的应答，尽管在储存过夜之后，它的抗原-抗体反应程度经历约10％的下降。
实施例6以与实施例3相同的方式测量包含在从焚烧工厂的粉煤灰中提取的样品内的2，3，7，8-TCDD浓度。测量结果为97ng/ml。将所测量浓度应用到图4所示的校正曲线，结果毒性等价量为49ng-TEQ/ml。
使用相同的样品，通过GC/MS方法测量各组分的浓度。测量结果见表5。
表5
根据表5，显而易见的是，样品内全部二氧芑的毒性等价量为58ng-TEQ/ml。
因此，通过测量2，3，7，8-TCDD(已知在环境内的二氧芑当中，它以最高浓度存在且显示出最高的毒性)的浓度，和根据通过使用GC/MS方法事先制作的校正曲线，能测量样品内全部二氧芑的毒性等价量。
根据本发明，在含多组分的污染材料如取自环境的样品、取自生物的样品内的痕量成分，可通过非常容易的操作，在高灵敏度下快速地测量。例如，可通过使用取自生物的样品如人血清、尿、体液或取自环境的样品如河/湖的水、淤泥、燃烧炉的灰尘作为分析样品，检测痕量成分。特别地，可高灵敏度地测量来自所谓环境激素和类似物的环境污染物(它们被列位内分泌破坏剂)如二氧芑和在人体内的痕量激素等。二氧芑测量的常规正式方法(GC/MS方法)每次分析花费约250000yen，和它的分析时间花费接近4周。与之相比，根据本发明，能以每次分析约20000yen的成本，在约4小时内以与正式方法相同精度水平地测量。此外，关于测量设备，正式方法的设备装置值60000000yen，而在本发明中，它值约10000yen。因此，本发明在经济上极其有利。
根据本发明，通过测量在环境内高度浓缩且毒性致命的2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑(2，3，7，8-TCDD)的浓度，和通过计算毒性等价量，可测量在含多种组分的被污染材料，如取自环境的样品、取自生物的样品内二氧芑的总体毒性等价量。
本发明的测量方法能通过非常容易的操作在高灵敏度下快速地测量。因此，它适合作为测量环境污染物的测量方法，所述环境污染物包括被称为内分泌破坏剂的所谓环境激素等在内，如在含多种组分的被污染材料如取自环境的样品和取自生物的样品内的二氧芑，和在人体内的痕量激素，以及测量其毒性等价量的测量方法。
以涉及本发明实施方案的形式描述了本发明，我们的目的是不通过说明书的任何细节限制本发明，除非另有说明，而是在所附权利要求中列出的精神和范围内广义地解释本发明。
权利要求
1.一种测量方法，该方法包括将样品固定在具有识别元素和将所述识别元素固定在其上的稳定剂的石英振荡器上，其中所述识别元素对特定被分析物具有特异结合能力，所述稳定剂包含合成聚合物；测量频率的变化量；比较该结果与通过使用竞争性标准物质获得的石英振荡器的频率变化量；和从而测量在被测量的样品内所述被分析物的含量。
2.一种测量取自环境的样品或取自生物的样品内痕量成分的测量方法，该方法包括将样品固定在具有识别元素和将所述识别元素固定在其上的稳定剂的石英振荡器上，其中所述识别元素对特定的多组分被分析物具有特异结合能力，所述稳定剂包含合成聚合物；测量频率的变化量；比较该结果与通过使用竞争性标准物质获得的石英振荡器的频率变化量；和从而测量在被测量的样品内所述被分析物的含量。
3.根据权利要求1或2的测量方法，该方法包括使用凝结元素，所述凝结元素具有固定在不溶性载体颗粒上的识别元素；使在石英振荡器上的所述凝结元素和识别元素特异地结合到被分析物上；和从而放大并测量石英振荡器频率的变化。
4.根据权利要求1-3任何一项的测量方法，其中被分析物是取自环境或取自生物的二氧芑、呋喃和溴化二氧芑。
5.根据权利要求1-4任何一项的测量方法，其中被分析物是取自环境或取自生物的二氧芑，和识别元素是单克隆或多克隆抗体，所述单克隆或多克隆抗体可特异地结合到被认为是抗原的二氧芑上。
6.根据权利要求5的测量方法，其中识别元素是IgG、IgM、Fab、F(ab′)2或ScFv，它们是单克隆或多克隆抗体。
7.根据权利要求4-6任何一项的测量方法，该方法包括在含合成聚合物的稳定剂的共存下，固定单克隆或多克隆抗体在石英振荡器上，所述单克隆或多克隆抗体可特异地结合到被认为是抗原的二氧芑上；在储存数天之后，进行抗原-抗体反应；和从而测量二氧芑的浓度。
8.根据权利要求1-7任何一项的测量方法，其中该方法包括使用小尺寸的传感器系统，所述传感器系统是干电池驱动型或电池驱动型频率指示器和振荡电路的联合，或者由组合所述传感器系统和收集数据并控制用计算机而形成的系统，从而测量石英振荡器的频率变化量。
9.根据权利要求1-8任何一项的测量方法，所述方法包括结合石英振荡器到微型通道上，所述微型通道具有样品的提取/预处理功能，或将石英振荡器嵌入到微型通道内；并使用微型通道型化学反应系统，所述系统会加速在微型反应空间内的抗原-抗体反应时间。
10.根据权利要求1-9任何一项的测量方法，其中作为被分析物的二氧芑是2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑。
11.根据权利要求1-10任何一项的测量方法，所述方法包括通过高速溶剂萃取方法，从取自环境的样品或取自生物的样品中提出被分析物，并进行浓缩/清洗预处理。
12.一种测量二氧芑的毒性等价量的测量方法，所述方法包括通过权利要求1-11任何一项的方法测量2，3，7，8-四氯二苯并对二氧芑的浓度，并测量全部样品的毒性等价量。
13.用于权利要求1-12任何一项的方法的生物芯片，所述生物芯片包括具有识别元素和所述识别元素用稳定剂固定在其上的石英振荡器，其中所述识别元素对特定被分析物具有特异结合能力，所述稳定剂包含合成聚合物。
全文摘要
一种测量方法，该方法包括将样品固定在具有识别元素和所述识别元素用稳定剂固定在其上的石英振荡器上，其中所述识别元素对特定被分析物具有特异结合能力，所述稳定剂包括合成聚合物；测量频率的变化量；比较该结果与通过使用竞争性标准物质获得的石英振荡器的频率变化量；和从而在被测量的样品内测量所述被分析物的含量。
文档编号G01N5/02GK1662804SQ0381462
公开日2005年8月31日 申请日期2003年5月27日 优先权日2002年5月28日
发明者黑泽茂 申请人:独立行政法人产业技术综合研究所