专利名称：彩色胶乳层析法诊断试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于医学检验领域，涉及一种利用彩色胶乳层析的诊断试纸条。
背景技术：
彩色胶乳标记层析检测技术是继胶体金标记技术以后，在胶乳凝集试验的基础上发展起来的，作为一种免疫学方法，它是免疫亲和技术、印迹技术、免疫标记技术和层析技术的结合，由于其同金标技术一样具有快速、操作简便、试剂稳定、可室温储运、不易污染的特点发展迅速。
彩色胶乳标记技术是将不同直径范围0.1μm～1μm的彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯类或其他大分子物质共价结合，利用大分子物质具有的羧基、氨基、羟基等基团结合蛋白质物质(抗原/抗体)，当此彩色胶乳标记的蛋白质(抗原/抗体)与检测样本中足够的相应抗体/抗原结合后形成的胶乳标记复合物，被膜上包被的抗原/抗体捕获，彩色胶乳标记物在相应的配体处大量聚积时，形成肉眼可见红色、紫红色、黑色、蓝色或者其他颜色的条带，因而可用于定性或者半定量的快速免疫检测方法中。
在免疫检测中，国内外主要采用放射性免疫、酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金标记等方法的试纸条。这些试纸条都存在不同程度的缺陷。以目前广泛采用的免疫胶体金层析法试纸条为例，存在以下不足之处(1)胶体金是一种纳米颗粒，制备胶体金纳米颗粒较难，且颗粒直径较难控制均匀。
(2)胶体金标记过程中用到强还原剂，同时要接触重金属者离子，对人体健康和安全有一定影响。
(3)胶体金标记过程是物理吸附过程，故液相时稳定性较差。
(4)显色后只能是单一颜色——紫红色，不能根据不同的品种或不同要求变化颜色。
发明内容
本发明的目的在于提供一种彩色胶乳层析法诊断试纸条，能发挥胶乳标记层析检测技术快速、简便、操作方便的优点，避免现有检测技术的缺点和不足。
本发明所述的彩色胶乳层析法诊断试纸条，该试纸条是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆彩色胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被抗体或抗原，控制区包被抗鼠抗体。
所述的包被膜上，根据所采用双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争抑制法等检测方法，在检测区中包被相应的抗体或抗原；控制区所包被的抗鼠抗体，是用纯化的IgG免疫小鼠得到的。
本发明的另一目的在于提供一种彩色胶乳层析法诊断试纸条的制备方法。
本发明所述的彩色胶乳层析法诊断试纸条的制备方法，包括以下步骤A.彩色胶乳的共价活化超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×106～1.0×107/ml，8000×g离心1～5分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者50mM～200Mm pH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波处理30秒；加入一定量的20～100mg/mlEDC，混匀；室温孵育30分钟后8000×g、离心1～5分钟，沉淀用20mM～100mM的pH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置于2～8℃环境中备用，以标记蛋白质；B.彩色胶乳微粒标记蛋白的制备将步骤A中活化后的彩色胶乳超声波处理30秒后，按照1μg～125μg蛋白/100ul彩色胶乳的比例加入需标记的蛋白质，混匀后室温搅拌反应2小时，3次离心洗涤，每次8000×g、离心1～5分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波处理30秒，用磷酸缓冲液恢复一定体积，放置室温备用，以涂覆玻璃纤维膜；C.抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上及其封闭膜上包被的检测区和控制区是将抗原/抗体和抗鼠抗体调节一定浓度，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为6～15μg/ml，将抗原/抗体及抗鼠抗体喷到玻璃纤维膜上，两区间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋，以备贴板用；D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆彩色胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
本发明的检测原理是将不同直径范围0.1μm～1μm的彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯类或其他生物大分子物质如抗原/抗体共价结合，当此彩色胶乳标记的蛋白质(抗原/抗体)与检测样本中足够的相应抗体/抗原结合后形成的复合物，被膜上包被的抗原/抗体捕获，彩色胶乳标物在相应的配体处于大量聚积时，形成肉眼可见红色、紫红色、黑色、蓝色或者其他颜色的条带，因而可用于定性或者半定量的快速免疫检测中。(夹心法)所形成的检测带是一条肉眼可见的显色带，出现可见的显色带为样本中含有目的蛋白使检测带上积聚的彩色胶乳颗粒为肉眼所见，如果检测带不可见，表明样本中无目的蛋白或者浓度很低，以致检测带上积聚的彩色胶乳颗粒不能被肉眼所见。
本发明所述的彩色胶乳层析法诊断试纸条与放射性免疫、酶联免疫法相比，具有操作安全(无放射物污染)、简便(简单操作一步完成)、适合单人/份检测(放免、酶免不适合单人/份或少量样品检测)和快速(10分钟左右即可有结果)等优点；与免疫胶体金标记试纸条相比，本发明具有蛋白质标记过程不需接触重金属离子、而且颜色多样可变等优点。
本发明所述的试纸条可以使用双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争抑制法等检测方法的试纸条，应用范围广，能够用于单项检测或者一检多项的快速检测试纸条，能够检测全血、血清、血浆、唾液、尿液、食品等样本；能够用于妊娠检测、疾病诊断、毒品检出、细菌检出等目的蛋白的检测。
图1是本发明的结构示意图；图2是本发明在采用双抗夹心法时检测结果的示意图。
图3是本发明在采用竞争抑制法时检测结果的示意图。
图4是本发明用于一检多项时检测结果的示意图。
具体实施例方式
本发明所述的彩色胶乳层析法诊断试纸条，如图1所示，该试纸条是在底衬1上顺次相互搭接地粘贴样品垫2、涂覆彩色胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜3、包被膜4以及吸水纸5而形成的膜条，包被膜4有检测区6和控制区7，检测区6包被抗体或抗原，控制区7包被抗鼠抗体。
本发明所述的试纸条可以使用双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争抑制法等检测方法的试纸条。图2是采用双抗夹心法试纸条时的结果示意图，如图2(a)所示，样本中的抗原或者抗体的浓度可使彩色胶乳微粒在检测区(T区)6处积聚形成肉眼可条带，控制区(C区)7出现可见的条带，表示样本阳性；如图2(b)见的所示，检测区(T区)6处不形成肉眼可条带，控制区(C区)7出现可见的条带，表示样本阴性，不含被检测抗原或者抗体。图3是采用竞争抑制法试纸条的结果示意图，如图3(a)所示，样本中的抗原或者抗体与包被在检测区的抗原或者抗体竞争结合彩色胶乳标记的抗体或者抗原。当样本中抗原或者抗体的浓度足够结合胶乳标记的抗体或者抗原时，当样本经过包被线时，没有多余的彩色胶乳标记的蛋白与包被抗原或者抗体结合，不能在检测区(T区)6积聚形成条带，即检测区不出现条带。如图3(b)所示，阴性结果显示样本中无目的抗原或者抗体，检测区(T区)6无条带出现。
如图4所示，本发明可用于一检多项检测项目，如图4(a)所示，当样本中含有全部被检项目时，会出现两条检测带(代表两项检测指标)，一条控制带；如图4(b)所示，样本中含有某一检测项目时，出现对应的检测带和控制带；如图4(c)所示，不含有任何检测项目时，仅出现一条控制带；如果不出现任何条带，说明检测试剂盒失效。
实施例一早早孕HCG胶乳检测试纸条(双抗体夹心法)本实施例早早孕HCG胶乳检测试纸条采用双抗体夹心法的层析检测原理，利用彩色胶乳标记hCG单克隆抗体，包被膜上检测区(T)包被有α-hCG单克隆抗体，质控区(C)包被抗鼠抗体。当检测样本中含有促腺素人绒毛膜(hCG)时，样本中的hCG抗原与胶乳标记的hCG单抗结合，形成Ag-Ab*胶乳复合物，在层析作用下，到达包被有α-hCG单克隆抗体的检测区(T)，反应形成Ab-Ag-Ab*胶乳复合物，当样本中hCG浓度不小于25mlU/ml，彩色胶乳标物在此处于大量聚积时，形成肉眼可见红色、紫红色、黑色、蓝色或者其他颜色的条带，从而可以判断样本阳性，即受检者怀孕。
如图3所示，加样后，反应1～2分钟即可看到检测区(T区)6和质控区(C区)7相应的位置上出现紫红色条带，如果C区7和T区6均出现紫红色条带，如图3(a)，结果为阳性，说明样品含有hCG；T区6不出现紫红色条带，如图3(b)，结果为阴性，说明样品不含hCG。C区7不出现紫红色条带，说明试纸条失效。
本实施例采用的双抗体夹心法还可以适用于排卵(LH，促黄体生成素)，乙型肝炎表面抗原(HbsAg)，心肌肌钙蛋白(Tn-I，Tn-T)、肿瘤标记物(AFP、PSA、CEA、FOB)、衣原体(CT)等。
实施例二艾滋病HIV1/2型诊断试纸条(双抗原夹心法)本实施例艾滋病HIV1/2型诊断试纸条采用双抗原夹心法的层析检测原理，利用彩色胶乳标记HIVgp36，gp41以及gp27重组抗原，包被膜上检测区(T)包被一定浓度的HIVgp36，gp41以及gp27重组抗原，质控区(C)包被抗鼠抗体。当检测样本中含有HIV抗体时，样本中的HIV抗体与胶乳标记的HIV抗原结合，形成Ab-Ag*胶乳复合物，在试纸条层析作用下，到达包被有HIVgp36，gp41以及gp27的检测区(T)，反应形成Ag-Ab-Ag*胶乳复合物，当样本中HIV抗体浓度1∶1280，彩色胶乳标物在此处于大量聚积时，形成肉眼可见红色、紫红色、黑色、蓝色或者其他颜色的条带，从而可以判断样本阳性，即受检者感染HIV；阴性情况，说明受检者没有HIV抗体，21天后仍然阴性，排除受检者感染HIV病毒的可能。
本实施例采用的双抗原夹心法还可以适用于，乙型肝炎表面抗体(HbsAb)，丙型肝炎(HCV)等。
实施例三毒品检测试纸条(竞争抑制法)本实施例毒品检测试纸条建立在竞争抑制性免疫层析的原理上，利用彩色胶乳标记原理检测尿样中或其它样品中是否含有毒品。在每个膜条的测试区(T)包被毒品-BSA(或者毒品-BTG)结合物，控制区C区包被抗鼠抗体。在膜条的下端粘涂覆金标抗体的玻璃纤维膜。尿液中不含毒品时，胶乳标记抗体结合物在毛细作用下，与尿液一起沿膜向前移动。到达固定有毒品结合物的测试区(T)时，胶乳标记抗体与预包被的毒品结合反应形成复合物显示一条红线，在测试区(T)显示有颜色的条带说明尿样中呈阴性，不含毒品。当尿液中含有毒品时，其将和包被在测试区的毒品竞争性结合一定量的抗体。当尿液中毒品达到足够浓度时，它将与标记的定量抗体完全结合，因而阻止了胶乳标记抗体与预包被在检测区上毒品结合物的结合，因此，测试区(T)不显色为阳性结果。在控制区(C)无论样品中有无毒品，均显色，说明检测板性能正常；若控制区(C)不显色，则说明本测试版性能失效。
本实施例采用的间接法原理可用于检测的毒品(包括海洛因、大麻、可卡因、冰毒、吗啡、鸦片、摇头丸、安非他命(苯丙胺)、巴比妥、苯二氮卓类，美沙酮、PCP)、丙型肝炎(HCV)。
本发明所述的胶体金层析法检测血液HIV1/2抗体的试纸条的制备方法见以下实施例实施例四本实施例的制备方法包括以下步骤A.彩色胶乳的共价活化超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×106～1.0×107/ml，8000×g离心1～5分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者50mM～200Mm pH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波处理30秒；加入一定量的20～100mg/mlEDC，混匀；室温孵育30分钟后8000×g、离心1～5分钟，沉淀用20mM～100mM的pH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置于2～8℃环境中备用，以标记蛋白质；B.彩色胶乳微粒标记蛋白的制备将步骤A中活化后的彩色胶乳超声波处理30秒后，按照1μg～125μg蛋白/100ul彩色胶乳的比例加入需标记的蛋白质，混匀后室温搅拌反应2小时，3次离心洗涤，每次8000×g、离心1～5分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波处理30秒，用磷酸缓冲液恢复一定体积，放置室温备用，以涂覆玻璃纤维膜；
C.抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上及其封闭膜上包被的检测区和控制区是将抗原/抗体和抗鼠抗体调节一定浓度，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为6～15μg/ml，将抗原/抗体及抗鼠抗体喷到玻璃纤维膜上，两区间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋，以备贴板用；D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆彩色胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
实施例五本实施例的制备方法与实施例四基本相同，不同点在于所述的步骤B中，彩色胶乳微粒标记蛋白的制备方法是将步骤A活化后的彩色胶乳超声波处理30秒后，按照75μg蛋白/100ul彩色胶乳的比例加入需标记的蛋白质，混匀后室温搅拌反应2小时，3次离心洗涤，每次8000×g、离心1～5分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波处理30秒，用磷酸缓冲液恢复一定体积，放置室温备用，以涂覆玻璃纤维膜。
实施例六本实施例的制备方法与实施例四基本相同，不同点在于所述的步骤C中，抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上及其封闭方法是膜上包被的检测区和控制区是将抗原/抗体和抗鼠抗体调节一定浓度，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为10μg/ml，将抗原/抗体及抗鼠抗体喷到玻璃纤维膜上，两区间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋，以备贴板用。
权利要求
1.彩色胶乳层析法诊断试纸条，其特征在于该试纸条是在底衬(1)上顺次相互搭接地粘贴样品垫(2)、涂覆彩色胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜(3)、包被膜(4)以及吸水纸(5)而形成的膜条，包被膜(4)有检测区(6)和控制区(7)，检测区(6)包被抗体或抗原，控制区(7)包被抗鼠抗体。
2.根据权利要求1所述的彩色胶乳层析法诊断试纸条，其特征在于所述的玻璃纤维膜(3)上涂覆的彩色胶乳微粒的直径范围为0.1μm～1μm。
3.如权利要求1所述的彩色胶乳层析法诊断试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A.彩色胶乳的共价活化超声波处理胶乳微球体30秒后，调节胶乳微球体浓度为1.0×106～1.0×107/ml，8000×g离心1～5分钟，离心后收集沉淀物用蒸馏水或者50mM～200Mm pH6.0～7.0磷酸钠溶液溶解，并超声波处理30秒；加入一定量的20～100mg/mlEDC，混匀；室温孵育30分钟后8000×g、离心1～5分钟，沉淀用20mM～100mM的pH5.0～6.0的柠檬酸缓冲液溶解，放置于2～8℃环境中备用，以标记蛋白质；B.彩色胶乳微粒标记蛋白的制备将步骤A中活化后的彩色胶乳超声波处理30秒后，按照1μg～125μg蛋白/100ul彩色胶乳的比例加入需标记的蛋白质，混匀后室温搅拌反应2小时，3次离心洗涤，每次8000×g、离心1～5分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波处理30秒，用磷酸缓冲液恢复一定体积，放置室温备用，以涂覆玻璃纤维膜；C.抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上及其封闭膜上包被的检测区和控制区是将抗原/抗体和抗鼠抗体调节一定浓度，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为6～15μg/ml，将抗原/抗体及抗鼠抗体喷到玻璃纤维膜上，两区间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋，以备贴板用；D.在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆彩色胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸，得到试纸板，按照要求切割成不同宽度的试纸条。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤B中，彩色胶乳微粒标记蛋白的制备方法是将步骤A活化后的彩色胶乳超声波处理30秒后，按照75μg蛋白/100ul彩色胶乳的比例加入需标记的蛋白质，混匀后室温搅拌反应2小时，3次离心洗涤，每次8000×g、离心1～5分钟，沉淀用PBS-TBN溶解并超声波处理30秒，用磷酸缓冲液恢复一定体积，放置室温备用，以涂覆玻璃纤维膜。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤C中，抗体或抗原包被到硝酸纤维素膜上及其封闭方法是膜上包被的检测区和控制区是将抗原/抗体和抗鼠抗体调节一定浓度，膜液量为20ul/35cm，用包被缓冲液稀释包被抗原/抗体，浓度为10μg/ml，将抗原/抗体及抗鼠抗体喷到玻璃纤维膜上，两区间隔5mm，应细致均匀，室温凉干20分钟；25℃～37℃在封闭液浸泡60分钟，取出后置25℃～37℃烘干处理2小时，封袋，以备贴板用。
全文摘要
本发明公开了一种彩色胶乳层析法诊断试纸条。本发明所述的彩色胶乳层析法诊断试纸条，该试纸条是在底衬上顺次相互搭接地粘贴样品垫、涂覆彩色胶乳微粒标记蛋白的玻璃纤维膜、包被膜以及吸水纸而形成的膜条，包被膜有检测区和控制区，检测区包被抗体或抗原，控制区包被抗鼠抗体。本发明能发挥胶乳标记层析检测技术快速、简便、操作方便的优点，避免现有检测技术的缺点和不足。
文档编号G01N33/531GK1580778SQ20041002729
公开日2005年2月16日 申请日期2004年5月21日 优先权日2004年5月21日
发明者王继华, 李文美 申请人:王继华