专利名称：一种高通量筛选反向蛋白质芯片、制备方法及其检测方法
技术领域：
本发明涉及一种适用于高通量筛选的蛋白质芯片、其制备方法及利用所述芯片的检测方法。
背景技术：
蛋白质芯片是继基因芯片之后，作为基因芯片的补充发展起来的一种生物芯片技术。蛋白质是生命活动的执行者和体现者。在转录时，一个基因可能以多种mRNA形式剪接，并且同一蛋白质可能以多种形式进行翻译后的修饰，一个蛋白质组不是一个基因组的直接产物，蛋白质组中蛋白质的数目可以超过基因组的数目。因此，蛋白质表达谱比mRNA表达谱更能真实地反映生物体的功能机制。蛋白质芯片提供了在同一时相分析整个蛋白质组的可能。
现有蛋白质芯片的制作，首先是按照预先设计的方式将大量不同的蛋白质点阵于固相载体上，形成蛋白质的阵列，即蛋白质芯片，然后往芯片上加入带有特殊标记的蛋白质分子，通过两者的结合进行蛋白质的功能分析、检测和用于药物筛选。
生命科学研究的微量化、自动化技术、组合化学以及新的检测方法为新药发现赋予了新的概念--高通量药物筛选。目前，高通量药物筛选是发现新药的重要途径。一个新的药物作用靶点发现后，建立一个稳定、敏感、可信的高通量筛选模型，然后对大量未知样品进行针对该靶点的筛选，是高通量药物筛选的主旨。
目前，蛋白质芯片应用于药物筛选的方法主要是，将大量功能蛋白质点阵于片基上，然后均匀覆盖待测样品，观察其与某种蛋白质的作用。这种方法的局限性在于一次只能筛选一种样品，同时不能对大量未知样品针对一个药物作用靶点蛋白进行筛选，从某种意义上说，这种方法是蛋白质芯片对蛋白质功能研究的一个补充，所以说这种方法还不是完全意义上的高通量药物筛选蛋白质芯片。
本发明所述反向蛋白质芯片应用于高通量药物筛选，将进一步提高药物筛选的效率，会大幅度降低成本，这种技术会为高通量药物筛选注入新的活力。
发明内容
为了解决现有蛋白质芯片技术在高通量药物筛选中的局限，本发明提供一种针对一个药物作用靶点可以对多个样品同时进行筛选的反向蛋白质芯片。
本发明的另一目的在于提供一种简单、低成本、易于实施的用于高通量新药筛选的反向蛋白质芯片的制备方法。
本发明所述反向蛋白质芯片由固相载体和作为药物作用靶点的蛋白质，其中所述作为药物作用靶点的蛋白质预先固定在固相载体的表面。
利用本发明所述反向蛋白质芯片的制备和检测包括如下步骤1)在固相载体表面均匀固定一层作为药物作用靶点的蛋白质薄层；2)在允许待测样品与药物靶点相互作用的条件下，将待测未知样品点阵于蛋白质层上，使待测样品通过与作为靶点的蛋白质的相互作用而被结合；3)洗去未与蛋白质结合的样品后，再均匀覆盖用于与药物作用靶点的蛋白质相结合的经标记的配体物或底物；4)检测所述固相载体上是否存在不带有上述标记的暗点或区域，作为有待进一步复筛的阳性样品。
本发明所述的反向蛋白质芯片中，所述被均匀固定在固相载体上的蛋白质可以选自任一已知可以作为药物作用靶点的蛋白质，例如膜受体、核受体和酶，如G蛋白偶联受体、雌激素受体LOX-1膜蛋白受体等。
在本发明的一个具体实施方案中，所述反向蛋白质芯片上采用氧化型低密度脂蛋白受体LOX-1，用于筛选LOX-1受体拮抗剂。在本发明又一具体实施方案中，所述反向蛋白质芯片上采用雌激素受体ER，用于筛选雌激素受体拮抗剂。本发明另一具体实施方案中，所述反向蛋白质芯片上采用弹性蛋白酶，用于筛选弹性蛋白酶抑制剂。
本领域普通技术人员知晓，能够利用本发明所述反向蛋白质芯片，通过点阵于其上预先固定有药物作用靶蛋白质的芯片进行高通量筛选的样品，包括但不限于，化合物、天然产物(包括动物、植物、矿物、微生物及其他原材料)和中药提取物。
本领域普通技术人员知晓，用于本发明所述反向蛋白质芯片检测的标记物，应当为能够与所选靶点蛋白质具有特异性结合反应的配体、DNA和酶底物，只要所述标记物不影响待测物与所述蛋白质之间的相互作用。
本领域普通技术人员知晓如何选择适于本发明所述反向蛋白质芯片的所述固相载体。具体的，能够用于本发明的固相载体包括但不限于表面带有活化基团的玻璃片、醋酸纤维薄膜、硝酸纤维薄膜、尼龙膜、硅片、钢片等。事实上，本领域普通技术人员知晓，不影响所选靶蛋白质与待测样品结合以及标记物对靶蛋白质标记的任一固相载体均适于本发明。
本发明所述反向蛋白质芯片突破了目前蛋白质芯片进行药物筛选不能上通量的局限，实现了一种药物高通量筛选分子或细胞模型对大量待筛样品在生物芯片上的处理。
与现有技术相比，本发明的优越性在于第一，将高通量新药筛选嫁接于蛋白质芯片上，可以大大提高新药筛选的通量，一张蛋白质芯片可以容纳至少10个384孔板的容量；第二，本方法耗材少、成本低，一方面极大地减少了建立高通量筛选模型所需蛋白质的用量，同时也节省了待测样品的用量，每个点样品量仅纳升级；第三，本发明蛋白质芯片适合于任何受体-配体、受体-DNA和酶-底物相互作用的药物筛选系统。
图1药物高通量筛选蛋白质芯片的制备原理示意图。
图2用药物高通量筛选蛋白质芯片进行膜受体-配体模型的高通量筛选。
以下结合附图和实施例，以举例方式进一步说明本发明所述反向蛋白质芯片及利用所述芯片的检测方法。
实施例1以膜受体为靶点的高通量药物筛选蛋白质芯片以及利用所述芯片对凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)拮抗剂的筛选已知，LOX-1是一种主要由内皮细胞表达的膜受体，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)是其天然配体。以LOX-1-oxLDL相互作用建立分子模型，高通量筛选LOX-1受体拮抗剂。具体制被检测过程如下1.载体玻片的表面清洁处理与活化先将载玻片放入1∶10稀释了的去污剂温水中，以超声处理5min，然后用蒸馏水多次冲洗，再以100％甲醇冲洗，洗净的玻片放于烘箱内烘干。将玻片浸入第一层包被液APTS(氨基丙基三甲氧基硅烷，aminopropyltrimethoxysilane)中浸泡10min，再以95％乙醇洗涤，放入空气中干燥，然后于真空烘箱内80℃烘烤2小时。
氨基化后的玻片浸入第二种包被液BS3中(双磺琥珀酰亚胺基辛二酸酯，bis-sulfosuccinimidyl suberate)，室温下浸泡20min，然后在无尘烘箱内37℃干燥15min。
这样制好的活化玻片与蛋白连接(共价结合)后，以蒸馏水冲洗6h，蛋白连接仍保持良好。可在干燥条件下保存6周。
2.蛋白质芯片的制备
将制备的膜受体蛋白LOX-1(0.5mg/ml)，均匀铺于活化玻片表面，使之均匀吸附于活化玻片上。为了避免受体蛋白失活，此过程在冰上进行，然后4℃晾干，用PBS冲洗3次，晾干后将待测样品(化合物、天然产物、中药提取物等)点阵于如上制备的包被LOX-1的玻片上。
点样完成后，将玻片置于湿度30-40％的芯片杂交盒，室温反应。20min后以PBS冲洗玻片3次，每次1min。晾干后加入适量荧光标记的配体，覆以盖玻片使之均匀分布后，置于湿度30-40％、封闭芯片杂交盒，15min后以PBS冲洗玻片3次，每次1min。
点样区域四个角及中心分别点有两个阳性对照，为未标记荧光的LOX-1特异性配体，oxLDL。
3.检测将如上述加入待测样品的蛋白质芯片在芯片扫描仪(Scaner-3，中科院光电所)以激发520nm，发射560nm波长检测荧光强度。
一旦阳性待测样品与LOX-1结合后，竞争了LOX-1与其荧光标记的特异配体oxLDL结合的位点，则扫描结果显示为暗点，而背景显示荧光亮度。
如图2所示，四周及中心阳性对照物与LOX-1结合，竞争了荧光标记配体的与其结合，显示为暗点，未结合待测样品被洗去后显示为强的绿色荧光背景。
4.结果分析运用Photoshop分析软件，每一张蛋白芯片设有数个阳性对照，以阳性对照暗点的灰度值为标准，分析样品暗点的灰度值。
阳性抑制率％＝(阳性药OD值/阴性对照OD值)*100％样品抑制率％＝(样品OD值/阴性对照OD值)*100％以阳性药抑制率为阈值为标准确定复筛样品。
实施例2以雌激素受体为靶点的高通量筛选蛋白质芯片以及利用所述芯片对雌激素受体拮抗剂的高通量药物筛选。
雌激素受体(ER)是核受体的一种，当雌激素受体α(ERα)配体结合区(LBD)或DNA结合区(DBD)与其特异性配体或DNA结合后，引起热休克蛋白(HSP)结构改变，使其不能与共激活因子结合，抑制基因转录。
1.载体表面的清洁处理与活化同实施例1。
2.蛋白质芯片的制备将纯化的ERα(0.5mg/ml)，均匀铺于活化玻片表面，使之均匀吸附于活化玻片上，为了避免受体蛋白失活，此过程在冰上进行，然后4℃晾干，用PBS冲洗3次，晾干后将待测样品点阵于包被ERα的玻片上。
点样完成后，将玻片置于湿度30-40％的芯片杂交盒，室温反应。20min后以PBS冲洗玻片3次，每次1min。晾干后加入适量FAM(N-3-fluoranthylmaleimide，Sigma)标记的DNA，包含雌激素反应元件(ERE)的双链寡核苷酸，覆以盖玻片使之均匀分布后置于湿度30-40％、封闭芯片杂交盒，15min后以PBS冲洗玻片3次，每次1min。芯片阳性对照为未标记的ERE。
3.检测将经上述处理的反向蛋白质芯片在芯片扫描仪以激发488nm，发射508nm波长检测荧光强度。因为阳性待测样品与ERα结合后，竞争了其DBD位点，所以扫描结果显示为暗点，而背景显示蓝色荧光亮度。
4.结果分析运用Photoshop分析软件，每一张蛋白芯片设有数个阳性对照，以阳性对照暗点的灰度值为标准，分析样品暗点的灰度值。
阳性抑制率％＝(阳性药OD值/阴性对照OD值)*100％样品抑制率％＝(样品OD值/阴性对照OD值)*100％以阳性药抑制率为阈值为标准确定复筛样品。
实施例3以弹性蛋白酶为靶点的高通量筛选蛋白质芯片以及利用所述芯片进行弹性蛋白酶抑制剂的高通量药物筛选。
1.载体玻片的表面清洁处理及活化先将载玻片放入10％的NaOH中，95％乙醇清洗，烘干。以1％的琼脂糖溶液3ml铺板，待其凝固后浸泡于蒸馏水中，每2小时换水一次，6小时以后取出置37℃恒温孵育箱中孵育，烘干后取出。
2.弹性蛋白酶芯片的制备将经如上处理的玻片，表面均匀铺一层弹性蛋白酶(0.5mg/ml)溶液，置于芯片杂交盒中，加水保湿，置4℃冰箱中使弹性蛋白酶自然吸附(5小时)，吸附后取出，pH7.4的Tris-HCl溶液冲洗3次，晾干，使用芯片点样仪将待测样品(中科院电工所)点阵于玻片上，置于芯片杂交盒中反应，15min后用PH7.4的Tris-HCl溶液冲洗3次。
晾干后在玻片上均匀铺弹性蛋白酶底物-弹性蛋白，重新置于芯片杂交盒中，加水保湿，置37℃恒温孵育箱中孵育，每2小时加水一次，8小时后取出，观察结果。
3.检测弹性蛋白酶与底物反应后呈黄色，而当所点样品抑制弹性蛋白酶活性时，点样处应不显色，使用显微照相机摄像，PhotoShop分析，点样处为暗点，蛋白芯片背景为黄色。
4.结果分析运用Photoshop分析软件，每一张蛋白芯片设有数个阳性对照，以阳性对照暗点的灰度值为标准，分析样品暗点的灰度值。
阳性抑制率％＝(阳性药OD值/阴性对照OD值)*100％
样品抑制率％＝(样品OD值/阴性对照OD值)*100％以阳性药抑制率为阈值为标准确定复筛样品。
权利要求
1.一种用于高通量筛选的反向蛋白质芯片，其由固相载体和作为药物作用靶点的蛋白质组成，其中所述作为药物作用靶点的蛋白质预先固定在固相载体的表面。
2.权利要求1所述的反向蛋白质芯片，其作为靶点的蛋白质以薄层形式均匀固定于固相载体表面。
3.权利要求1所述的反向蛋白质芯片，其中所述作为靶点的蛋白选自膜受体蛋白、核受体蛋白和酶。
4.根据权利1所述的反向蛋白质芯片，其中固相载体选自表面带有活化基团的玻璃片、醋酸纤维薄膜、硝酸纤维薄膜、硅片、尼龙膜、钢片。
5.一种利用权利要求1所述反向蛋白质芯片进行高通量检测的方法，包括步骤1)在固相载体表面均匀固定一层作为药物作用靶点的蛋白质薄层；2)在允许待测样品与药物靶点相互作用的条件下，将待测未知样品点阵于蛋白质层上，使待测样品通过与作为靶点的蛋白质的相互作用而被结合；3)洗去未与蛋白质结合的样品后，再均匀覆盖用于与药物作用靶点的蛋白质相结合的经标记的配体物或底物；4)检测所述固相载体上是否存在不带有上述标记的暗点或区域，作为有待进一步复筛的阳性样品。
6.根据权利要求5所述的方法，其中将待测样品点阵形式分布于预先固定有作为药物靶点的蛋白质的固相载体表面。
7.权利要求5所述的方法，其中将经标记的特异性配体均匀覆盖于吸附有蛋白和样品的固相载体上。
8.权利要求5所述的方法，其中经标记的配体选自蛋白质，DNA和酶底物。
9.权利要求8所述的方法，其中所述的标记物选自荧光指示剂、同位素、生物素。
10.一种制备权利要求1所属高通量筛选用反向蛋白质芯片的制备方法，包括以下步骤1)常规清洁处理固体载片，然后表面酰基化处理而使其具有吸附蛋白活性；2)将受体蛋白(或酶)均匀固定于活化后的固体载片表面；3)将待测样品点阵于固定受体蛋白的载片，置于湿度30％-40％封闭芯片杂交盒，温度和反应时间由具体蛋白反应条件而定，洗去未与受体蛋白结合的样品；4)加入荧光标记的特异性配体(或DNA，或酶底物)，覆以盖玻片使之均匀分布于固体载片，置于湿度30％-40％封闭芯片杂交盒，温度和反应时间由具体受体-配体(或受体-DNA，或酶-底物)反应条件而定，洗去未与受体蛋白结合的荧光标记配体(或DNA，或底物)。
全文摘要
本发明涉及一种适用于高通量药物筛选的蛋白质芯片，及其制备技术及其检测方法。具体的，本发明的高通量筛选反向蛋白质芯片是将药物作用靶点相关的蛋白质以薄层形式均匀固定于固相载体表面，然后在蛋白层上以点阵形式分布待筛选样品，将选自荧光、同位素以及其他可检测物质的标记物标记的受体蛋白特异性配体与固相载体表面受体蛋白进行结合，检测结果显示背景为结合配基均匀信号，待测样品与受体蛋白有特异性结合后，阳性结果为反向的暗点。采用本发明所述反向蛋白质芯片技术能够实现一个药物作用靶点对化合物、天然产物、中药提取物在生物芯片上的大量快速筛选。
文档编号G01N33/50GK1719253SQ20041006355
公开日2006年1月11日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年7月9日
发明者杜冠华, 张天泰, 周勇 申请人:中国医学科学院药物研究所