专利名称：一种蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法及专用微流控芯片的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及在一块集成微流控芯片平台上，采用在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离方法实现蛋白质样品的浓缩和分离的技术，特别提供了一种蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法及专用微流控芯片。
背景技术：
蛋白质组的研究是后基因组时代的基本任务之一。蛋白质组学研究的发展在很大程度上依赖与分析手段的发展，而在某些实际样品中，蛋白质的浓度一般较低，解决这个问题方法有几种一是使用高灵敏度的检测技术，如激光诱导荧光法，质谱法和安培法等；另一种是改进检测器的构形，如用增加光程的Z形池等；第三中是增加样品注入量的预浓缩法，主要包括电泳预浓缩和固相萃取等。电泳预浓缩是一种简易、有效和灵敏的方法，它包括场放大进样，等速电泳和等电聚焦等。但是在毛细管电泳中各种耦合方式的接口非常复杂，同时造成较大的死体积。而微流控芯片以其无死体积的交叉流路，同时以其快速，高效，为样品的在线预浓缩和分离提供了较优的平台。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法及专用微流控芯片。本发明以激光诱导荧光为检测手段，在不降低分离效率的前提下，提高样品的注入量，灵敏度得到很大的提高。
本发明具体提供了一种蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析用集成微流控芯片，其特征在于该集成微流控芯片将蛋白质的在线预浓缩和浓缩后的电泳分离分析过程集成在一块功能芯片上完成；该芯片由两个基本单元构成第一个基本单元为蛋白质的在线电泳预浓缩，第二个单元为蛋白质浓缩后的电泳分离分析。
本发明蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析用集成微流控芯片，其特征在于该芯片的进样通道为T字结构，具体结构形式如附图1所示；整个在线电泳预浓缩分离分析过程用电极进行自动控制，其中不存在人为干扰。
本发明蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析用集成微流控芯片，其特征在于供蛋白质分析用微流控芯片材料可以为石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物；内表面是被修饰过的(1)对于石英、玻璃芯片选用静态修饰、动态修饰对芯片进行预处理静态修饰方法为通过偶联剂将有机聚合物、蛋白质键合在微流控芯片通道的表面，有机聚合物是聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖，蛋白质是牛血清白蛋白。
动态修饰方法为在缓冲液中加入以表面活性剂为主要成分的添加剂，所述表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂。
(2)对于塑料芯片进行表面修饰选用化学、物理两大类方法物理方法是等离子体处理、光照射处理；化学方法是亲水、疏水性处理的。
本发明蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析用集成微流控芯片，其特征在于对于石英、玻璃芯片，其内表面采用静态修饰，通过偶联剂将有机聚合物键合在微流控芯片通道的表面；对于塑料芯片，其内表面采用离子体处理方法进行表面修饰。
本发明一种基于集成微流控芯片的蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法，其特征在于蛋白质的在线电泳预浓缩方法包括场放大进样、样品堆积、等速电泳；蛋白质预浓缩后的电泳分离方法包括区带电泳法、胶束电动色谱法、毛细管筛分电泳法、毛细管等电聚焦。
本发明蛋白质在线预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法，其特征在于蛋白质的在线电泳预浓缩方法是等速电泳；蛋白质预浓缩后的电泳分离方法是毛细管筛分电泳。
本发明蛋白质在线预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法，其特征在于蛋白质用荧光染料进行标记，浓缩分离后用激光诱导荧光检测。
本发明蛋白质在线预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法，其特征在于用荧光染料对蛋白质进行标记，所用荧光染料是共价标记染料、非共价标记染料蛋白质共价标记的荧光染料选自FITC系列、BODIPY系列、Cy系列、罗丹明系列和Alexa Fluor系列；蛋白质非共价标记的荧光染料选自Sypro系列、NanoOrange、Nile Red、MC 540。
本发明蛋白质在线预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法，其特征在于用荧光染料对蛋白质进行标记，所用荧光染料是共价标记染料FITC系列。
本发明蛋白质在线预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法，其特征在于用荧光染料对蛋白质进行标记，所用荧光染料是非共价标记的荧光染料Sypro系列。
本发明提供的集成微流控芯片平台可以将蛋白质进行在线电泳预浓缩，同时将浓缩后的蛋白质进行电泳快速分离。整个分析过程时间小于250秒，操作简便，灵敏度比常规的十字进样方法提高了约50倍。
图1蛋白质在线预浓缩-分离分析用集成微流控芯片结构图；图2微流控芯片无胶筛分分离蛋白质的电泳图谱；图3集成微流控芯片上等速电泳在线预浓缩-无胶筛分分离和十字进样无胶筛分分离蛋白质的电泳比较图谱；
图4集成微流控芯片上等速电泳在线预浓缩-无胶筛分分离蛋白质的重复性电泳图谱。
具体实施例方式(图形说明图2微流控芯片无胶筛分分离蛋白质的电泳图谱；其中FITC为荧光素异硫氰酸酯，为碳酸酐酶，2为鸡母鸡卵白蛋白，3为牛血清白蛋白，4为伴清白蛋白。
图1中浓缩检测点在通道7与主通道相连接处附近的主通道内；分离检测点在通道8远离通道7的一侧。)蛋白质在线电泳预浓缩-电泳分离分析集成微流控芯片按图1所示，材料为石英、玻璃、不同的有机材料如PMMA、PDMS等。以等速电泳预浓缩-无胶筛分分离蛋白质为例，等速电泳的前导离子可以是氯离子，磷酸根离子，硼酸根离子等阴离子，尾随离子可以是甘氨酸根离子，醋酸根离子等阴离子；无胶筛分的筛分介质为各种形式的高分子化合物，如聚乙二醇，甲基聚丙烯酰胺，葡聚糖，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺，琼脂糖等。集成微流控芯片的通道内充满无胶筛分分离缓冲液，而在1通道内充满尾随电解质，在1和4通道之间形成一个不同电泳淌度电解质的界面，蛋白质样品进样后进行等速电泳浓缩，浓缩后实现无胶筛分分离。在分离通道内进行蛋白质的分离分析，需要进行各种形式的表面修饰，以防止蛋白质在通道内壁的吸附。修饰过程可以是任何形式的物理或者化学修饰。对于石英和玻璃芯片修饰方法主要有静态和动态两种修饰方法，静态修饰通常是指将一些有机聚合物或者某些蛋白质通过偶联剂键合在通道的表面，有机聚合物主要有聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖等；蛋白质有牛血清白蛋白等。动态修饰重要是指在缓冲液中加一些添加剂，主要是一些表面活性剂，包括阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂等。对于塑料芯片的表面修饰，主要是物理或者化学方法，物理方法有等离子体处理、光照射处理等，化学方法主要是根据材料的不同对通道表面进行亲水或者疏水性处理。
实施例1所用集成微流控芯片为本实验室自行设计，以玻璃基片采用标准光刻、湿法腐蚀和键合制作，构型如图1所示，通道尺寸为80μm×20μm，通道用线性聚丙烯酰胺进行修饰。蛋白质常规的十字进样无胶筛分分离采用集成微流控芯片中十字交叉部分，运行缓冲液是一定浓度的葡聚糖和磷酸缓冲液。蛋白质标准为分子量从31kD到78kD的4种蛋白质，分别为碳酸酐酶(31kDa)，鸡母鸡卵白蛋白(43kDa)，牛血清白蛋白(66kDa)和伴清白蛋白(78kDa)。蛋白质用十二烷基硫酸钠和巯基乙醇混合100℃加热变性6min。激光诱导荧光检测，标记蛋白质的染料是荧光素异硫氰酸酯，激光波长470nm。得到的微流控芯片无胶筛分分离蛋白质电泳图谱如图2所示。
实施例2所用微流控芯片为本实验室自行设计，以玻璃基片采用标准光刻、湿法腐蚀和键合制作，构型如图1所示，通道尺寸为80μm×20μm，通道用线性聚丙烯酰胺进行修饰，同时为了消除通道大小对浓缩倍数的影响，十字进样分离与等速电泳-无胶筛分分离分别在同一块微流控芯片上完成。运行缓冲液是一定浓度的葡聚糖和硼酸缓冲液，其中硼酸根离子为等速电泳浓缩的前导离子，尾随电解质为一定浓度的甘氨酸溶液。蛋白质标准为分子量从31kDa到78kDa的4种蛋白质，分别为碳酸酐酶(31kDa)，鸡母鸡卵白蛋白(43kDa)，牛血清白蛋白(66kDa)和伴清白蛋白(78kDa)。蛋白质用十二烷基硫酸钠和巯基乙醇混合100℃加热变性6min。激光诱导荧光检测，标记蛋白质的染料是荧光素异硫氰酸酯，激光波长470nm，得到的微流控芯片等速电泳浓缩-无胶筛分分离和十字进样无胶筛分分离蛋白质的电泳比较图谱如图3所示，通过计算峰面积，得到浓缩倍数约为50倍。
实施例3所用微流控芯片为本实验室自行设计，以玻璃基片采用标准光刻、湿法腐蚀和键合制作，构型如图1所示，通道尺寸为80μm×20μm，通道用线性聚丙烯酰胺进行修饰，运行缓冲液是一定浓度的葡聚糖和硼酸缓冲液，其中硼酸根离子作为等速电泳浓缩的前导离子，尾随电解质为一定浓度的甘氨酸溶液。蛋白质标准为分子量从31kDa到78kDa的4种蛋白质，分别为碳酸酐酶(31kDa)，鸡母鸡卵白蛋白(43kDa)，牛血清白蛋白(66kDa)和伴清白蛋白(78kDa)。蛋白质用十二烷基硫酸钠和巯基乙醇混合100℃加热变性6min。激光诱导荧光检测，标记蛋白质的染料是荧光素异硫氰酸酯，激光波长470nm，重复运行4次，迁移时间的相对标准偏差(RSD)＜2％，峰面积的RSD＜7％，得到的重复性谱图如图4所示。
权利要求
1.一种蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析用集成微流控芯片，其特征在于该集成微流控芯片将蛋白质的在线预浓缩和浓缩后的电泳分离分析过程集成在一块功能芯片上完成；该芯片由两个基本单元构成第一个基本单元为蛋白质的在线电泳预浓缩，第二个单元为蛋白质浓缩后的电泳分离分析。
2.按照权利要求1所述蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析用集成微流控芯片，其特征在于该芯片的进样通道为T字结构，整个在线电泳预浓缩分离分析过程用电极进行自动控制。
3.按照权利要求1所述蛋白质预浓缩分离分析用集成微流控芯片，其特征在于供蛋白质分析用微流控芯片材料为石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物；(1)对于石英、玻璃芯片选用静态修饰、动态修饰对芯片进行预处理静态修饰方法为通过偶联剂将有机聚合物、蛋白质键合在微流控芯片通道的表面，有机聚合物是聚乙烯醇、聚乙烯乙酸酯、羟乙烯纤维素、聚乙二醇、聚丙烯酰胺、聚糖，蛋白质是牛血清白蛋白。动态修饰方法为在缓冲液中加入以表面活性剂为主要成分的添加剂，所述表面活性剂是阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂及两性表面活性剂。(2)对于塑料芯片进行表面修饰选用化学、物理两大类方法物理方法是等离子体处理、光照射处理；化学方法是亲水、疏水性处理。
4.按照权利要求3所述蛋白质预浓缩分离分析用集成微流控芯片，其特征在于供蛋白质分析用微流控芯片材料为石英、玻璃、PMMA、PDMS聚合物；对于石英、玻璃芯片采用静态修饰，通过偶联剂将有机聚合物键合在微流控芯片通道的表面；对于塑料芯片采用离子体处理方法进行表面修饰。
5.一种基于权利要求1所述集成微流控芯片的蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析方法，其特征在于蛋白质的在线电泳预浓缩方法包括场放大进样、样品堆积、等速电泳；蛋白质预浓缩后的电泳分离方法包括区带电泳法、胶束电动色谱法、毛细管筛分电泳法、毛细管等电聚焦。
6.按照权利要求5所述蛋白质在线预浓缩和浓缩后的电泳分离分析方法，其特征在于蛋白质的在线电泳预浓缩方法是等速电泳；蛋白质预浓缩后的电泳分离方法是毛细管筛分电泳。
7.按照权利要求5所述蛋白质在线预浓缩和浓缩后的电泳分离分析方法，其特征在于蛋白质用荧光染料进行标记，浓缩分离后用激光诱导荧光检测。
8.按照权利要求7所述蛋白质浓缩与分离分析方法，其特征在于用荧光染料对蛋白质进行标记，所用荧光染料是共价标记染料、非共价标记染料蛋白质共价标记的荧光染料选自FITC系列、BODIPY系列、Cy系列、罗丹明系列和Alexa Fluor系列；蛋白质非共价标记的荧光染料选自Sypro系列、NanoOrange、Nile Red、MC 540。
9.按照权利要求8所述蛋白质浓缩与分离分析方法，其特征在于用荧光染料对蛋白质进行标记，所用荧光染料是共价标记染料FITC系列。
10.按照权利要求8所述蛋白质浓缩与分离分析方法，其特征在于用荧光染料对蛋白质进行标记，所用荧光染料是非共价标记的荧光染料Sypro系列。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种蛋白质在线电泳预浓缩和浓缩后电泳分离分析用集成微流控芯片，其特征在于该集成微流控芯片将蛋白质的在线预浓缩和浓缩后的电泳分离分析过程集成在一块功能芯片上完成；该芯片由两个基本单元构成第一个基本单元为蛋白质的在线电泳预浓缩，第二个单元为蛋白质浓缩后的电泳分离分析。该芯片的进样通道可以为T字型结构，整个在线电泳预浓缩分离分析过程可以用电极进行自动控制。使用本发明提供的集成微流控芯片平台，整个分析过程时间小于250秒，操作简便，在不降低分离效率的前提下，提高样品的注入量，灵敏度得到很大的提高。
文档编号G01N21/64GK1779431SQ20041008756
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月17日 优先权日2004年11月17日
发明者林炳承, 黄淮青, 戴忠鹏 申请人:中国科学院大连化学物理研究所