专利名称：检测生物聚合物的方法；生物芯片；固定抗体的方法；以及在其上固定抗体的基质的制作方法
技术领域：
本发明描述了检测生物聚合物如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质的方法；以及使用这些方法的生物芯片。此外，本发明涉及固定抗体的方法，以及其上固定抗体的基质。
背景技术：
通过使用微点阵(microarray)检测生物聚合物(在下文中以DNA作为例子)的技术是公知的，例如在未审的公开的日本专利申请No.(JP-A)2000-131237中所描述的那种技术。这些类型的DNA微点阵通常按如下所述来形成和用于检测DNA将含有与靶mRNA(或cDNA)互补的序列的DNA探针的阵列(arrays)点样(spot)并随后固定在玻璃(或塑料)基质(substrate)上。使该基质与溶液中的一组荧光标记的靶mRNA(或cDNA)接触。此时，互补探针与靶mRNA(或cDNA)杂交并结合形成复合物。其序列不与探针互补的那些靶不发生杂交。当已充分进行杂交时，用缓冲液清洗基质的表面，洗掉任何未结合的靶分子。
靶mRNA(或cDNA)的存在或不存在，以及它们的量，可以从杂交所处的样斑处的荧光强度来光学测定。这样的光学测定方法已是很成熟的，并在JP-A2000-235035中详细描述了一个这样的例子。
传统的DNA微点阵方案的使用，例如以上所描述的那一方案未能提供满意的结果。每种方案中的每一步骤都造成许多问题，包括数据的精确性、再现性(reproducibility)、可重复性(repeatability)和灵敏性，这妨碍了实验数据的标准化。除了靶cDNA选择中的困难即疾病内容序列选择(diseasecontents sequence selection)的困难外，这些问题阻碍了DNA微点阵技术成功进入临床应用。
在解决上述问题中，根本的是改善S/N比率、检测灵敏度、检测时间、数据精确度，以及再现性。
发明概述本发明意在解决上述问题。具体地，本发明的一个目的是提供一种基于抗原-抗体相互作用和珠技术的检测生物聚合物的方法，以改善S/N比率和检测灵敏度，以及缩短检测时间。本发明的另一个目的是提供用于所发明的方法中的生物芯片。
图1是本发明检测生物聚合物的方法实例的原理的示意图。
图2是本发明中检测生物聚合物的方法实例的原理的第二示意图。
图3是本发明中检测生物聚合物的方法实例的原理的第三示意图。
图4是本发明的另一个实施例的、固定抗体分子的方法的原理的示意图。
图5是说明抗体分子是如何被固定到聚丙烯酰胺凝胶基质上的示意图。
发明详述在本发明中，组合了珠和DNA微点阵技术的优点。珠比平板提供了更大的表面积(每体积)，因此允许结合更多的探针DNA。另外，增加了探针DNA与靶分子之间的碰撞频率，这是由于与平板相比在溶液中的珠具有增大了的移动性。因此，溶液中的靶DNA捕获的灵敏性提高了。
作为缺点，需要鉴别在其上结合了探针DNA的个别珠。已试用各种技术，如使用彩色珠和两色光源，来解决此问题。然而，能成功鉴别的珠的数目仍然较小，设备变得更复杂、更昂贵、更大和更难以操作。本发明通过利用在固定在珠上的肽抗原与固定在阵列中的抗体(反之亦然)之间发生的抗原-抗体相互作用提供了这些问题的完美的解决方案。
以下参照图1至3详细地描述本发明。图1至3是说明本发明的检测生物聚合物的方法的示意图。请注意，在这里这些解释针对DNA生物聚合物。
如图1中所示，探针DNA(2)被固定到珠(1)的表面。所述珠可以是，例如，磁性的、金属的、和/或塑料的。地址接头(address linker)(3)被连结到珠(1)的表面上以能实现珠的鉴别信息(ID)的识别。地址接头(3)可以是抗原或(单克隆或多克隆)抗体。荧光标记(5)用于标记靶(4)，靶(4)可以是RNA、cDNA、或蛋白质(在下文中这些以“RNA”代表)。
珠(1)和靶RNA(4)如上所述制备，根据需要通过物理或电的方法混合在容器(7)中的缓冲液(6)中。结果，靶RNA(4)结合到通过互补碱基配对固定在珠(1)表面的探针DNA(2)上。
然后将携带着前述复合物的珠与图2中所示生物芯片基质(10)上部位(11)的阵列一起保温。图2A和图2B分别显示生物芯片的侧视图和平面图。
地址探针蛋白(12)，如抗原或抗体，被预固定到部位(11)上以通过抗原-抗体相互作用来捕获固定在珠(1)表面的ID-识别型地址接头(3)。请注意，图3是在图2中圈出的区域A的放大图。
地址接头(3)通过抗原-抗体相互作用结合到地址探针蛋白(12)上。荧光标记(5)可用于鉴别探针部位(11)中的哪个地址探针蛋白(12)已结合到珠(1)上。使用荧光读出器(未示出)可以容易地检测荧光标记。
因此，可以有效地测定靶RNA(4)的存在和量。
例如，除了多克隆抗体，地址探针肽或生物聚合物也可以用做地址接头。在这种情况下，一种地址探针肽、生物聚合物或多克隆抗体被固定到基质上，其每一种都与一种特异性地址接头具有抗原-抗体关系。
本发明包括下列优点(1)可以固定大量的探针DNA，因为珠具有相当大的表面积与体积的比率。因此，可以以非常高的灵敏度捕获溶液中的痕量的靶聚合物。
(2)每个珠上增加了量的探针DNA可与更多靶DNA杂交，从而可提高S/N比率。
(3)由于珠的移动性，探针DNA和靶DNA相互间的碰撞机会增加了。因此，缩短了检测时间(主要是杂交所需要的时间)，并且靶DNA与探针DNA之间的杂交会非常灵敏。
下列具体实施方案描述了固定抗体的方法，以及在其上固定抗体的基质，其中这些方法可以用于以上所述的检测生物聚合物的方法，并可用于应用这些检测方法的生物芯片。
如上述实施例所说明的，抗体结合分子可特异性地结合到特异性抗原分子上。这些抗体通常在被固定到不溶性基质如塑料或金属(相当于上述实施例的基质)之后被使用。大多数这些不溶性物质非特异性地吸附生物聚合物。
将抗体分子固定到不溶性物质上的一种方法是通过利用被固定到该不溶性物质上的抗体结合分子。在这种情况下，通过共价键或通过非共价键如静电相互作用将抗体结合分子固定到不溶性物质上。例如，在JP-A2001-147229中描述了这种方法。
然而，传统方法具有以下缺点(1)由于不溶性物质非特异性地吸附生物聚合物，可能会妨碍免疫测定、分级分离和纯化。
(2)由于不溶性物质和抗体结合分子之间的第二(非特异性的)相互作用，分子会失去抗体结合能力；当抗体结合分子被放置得与不溶性物质极其近时就会发生所述的第二(非特异性的)相互作用。
下列实施例通过使用含有酰胺基团的凝胶来防止抗体结合分子的非特异性吸附，以及通过将抗体结合分子包埋到该含有酰胺基团的凝胶中来防止抗体结合活性的退化，解决了这些问题。这样，在本发明中，抗体分子被固定到含有酰胺基团的凝胶上或固定到在不溶性物质上的含有酰胺基团的凝胶上。
在这一实施例中，本发明使用聚丙烯酰胺凝胶作为基质材料。另外，以这样的方式制备基质以使得抗体结合分子被包埋到聚丙烯酰胺凝胶中，并且通过与该凝胶中的酰胺基团载体的结合可以防止它们的抗体结合活性的退化。
本发明的这一实施例还包括下列特征由于抗体结合分子被包埋在聚丙烯酰胺凝胶中，它们的抗体结合活性不会因与载体的结合而退化。通过将抗体结合分子引入到凝胶中，这些分子保持在一种接近于溶液中的状态，此状态中它们是功能上活跃的。此外，通过包埋进行的固定化不依赖于抗体结合分子的官能团，而主要依赖于由被包埋物质所形成的孔的大小。
如上所述制备的、包埋着抗体结合分子的聚丙烯酰胺凝胶可以直接地提供，或者用一不溶性物质做背衬(back up)。通过将聚丙烯酰胺凝胶或支撑聚丙烯酰胺凝胶的不溶性物质浸入在抗体溶液中来固定抗体分子。
以下参考图4和图5详细地描述本发明。图4是说明用于结合抗体分子的方法的原理的示意图，图5是说明抗体分子如何被固定到聚丙烯酰胺凝胶基质上的示意图。
结合抗体分子的过程描述如下如图4(A)中所示，将含有酰胺基团的单体(101)和抗体结合分子(102)混合在一起。将该混合物施加到基质(103)(一种不溶性物质)的表面上，如图4(B)中所示，然后进行聚合反应。不溶性聚合物复合物如金属、塑料或玻璃用做基质(103)。通过该聚合反应，抗体结合分子(102)被捕获于由含有酰胺基团的凝胶(在下文中聚丙烯酰胺凝胶用做这样的凝胶的例子)形成的网格结构中(见图4(C))。
当固定抗体时，通过滴加方式施用包含抗体分子(104)的溶液，如图4(D)中所示。抗体分子可以是单克隆或多克隆抗体。抗体结合分子(102)被固定在聚丙烯酰胺凝胶中。抗体分子(104)在抗体结合分子(102)的特异性结合部位(105)的一点或多点处结合这个抗体结合分子(102)。如此来设置抗体结合分子(102)以使得其物理地包埋在聚丙烯酰胺的网格(cage)中。结果，抗体分子(104)的基部被固定到抗体结合分子(102)上，其抗原结合部位暴露并可接近抗原分子。
图5是说明用于基于上述原理固定抗体分子的基质的示意图。此图说明抗体分子(104)是如何通过包埋在聚丙烯酰胺凝胶(110)中的抗体结合分子(102)被固定到基质上的。此图也显示了被许多不同抗体定位(addressed)的抗体结合分子(102)，所述抗体例如对抗抗原A和B的抗体。
在此图中，物质(120)是一种不溶性物质，如玻璃。玻璃基质(120)的表面用甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(methacryloxypropyltrimethoxysilane)130处理。通过聚合反应将聚丙烯酰胺凝胶(110)施加到该表面，这有助于将聚丙烯酰胺凝胶(110)粘附到玻璃(120)上。
如图4中所示，抗体结合分子(102)(一种生物聚合物或一种具有抗体结合活性的聚合物复合物，如蛋白G或其类似物)通过非共价键包埋在聚丙烯酰胺凝胶(110)中。抗体分子(104)的基部结合于抗体结合分子(102)，如图5中所示，使得其抗原识别部位(106)与溶液接触(在图中面朝上)。以此种方式，相应的抗原结合到抗体分子(104)的抗原识别部位106。更具体地，对应抗体A的抗原107a结合到抗体A的抗原识别部位106a，对应于抗体B的抗原107b结合到抗体B的抗原识别部位106b。
含有酰胺基团的物质如聚丙烯酰胺凝胶(110)显著地减小了非特异性吸附，并因此增大了抗原识别部位(106)向溶液的暴露。这两个优点进一步提高了抗体-抗原相互作用的效率和特异性。
上述实施例说明了本发明的下列效果(1)因为1)抗体结合分子与含有酰胺基团的凝胶相组合，和2)抗体结合分子捕获抗体基部而不是抗体-抗原结合部分，和3)抗体上的抗体-抗原结合部分因此自由地与抗原结合，所以减少了非特异性结合并且改善了均一方向的排列。因此，改善了抗体-抗原结合特异性。
(2)因此，可以设计一种固定了抗体的基质，其对于高灵敏的免疫测定或对于分级分离或对于利用抗原进行的纯化是有用的。
在此具体地描述的优选实施例只是为了解释和说明本发明，本发明并不限于这些实施例；更确切地说，在不背离本发明的思想和基本技术的情况下可以做出各种变化和改进。下列实施例就包含了这样的变化和改进。
权利要求
1.通过将靶生物聚合物捕获到基质面(substrate side)来检测生物聚合物的方法，该方法包括以下步骤a)添加荧光标记的靶生物聚合物和珠，其中探针生物聚合物和特异于所述珠的ID的地址接头被固定在溶液中所述珠的表面(该地址接头可以是抗体、肽或其他生物聚合物)；b)使所述靶生物聚合物与所述探针生物聚合物杂交；和c)利用固定在基质上并与所述地址接头有抗原-抗体关系的地址探针肽、生物聚合物或抗体，通过抗原-抗体相互作用捕获所述的地址接头。
2.权利要求1的方法，其中缓冲溶液与靶生物聚合物和珠一起添加；并且所述溶液通过物理或电的方式搅拌。
3.权利要求1的方法，其中所述珠是一种磁性的、金属的或塑料的珠。
4.权利要求1的方法，其中所述靶生物聚合物是RNA，cDNA，或蛋白。
5.一种生物芯片，其中1)地址探针肽、生物聚合物或抗体被固定在基质上，所述地址探针肽，生物聚合物，或抗体均能够通过抗原-抗体反应来捕获地址接头，2)其中所述地址接头用于珠的ID识别，并且是抗体、地址探针肽或生物聚合物，和3)其中所述地址接头和通过杂交与靶生物聚合物相结合的探针聚合物一起被固定在所述珠的表面。
6.一种固定抗体的方法，该方法包括以下步骤1)将含有酰胺基团的凝胶固定在由不溶性物质组成的物质上，所述凝胶中包埋了抗体结合分子；和2)将抗体分子的基部结合到抗体结合分子上。
7.权利要求6的方法，其中所述抗体结合分子被非共价键地包埋在含有酰胺基团的凝胶中，并且它是一种包含抗体结合活性的生物聚合物或聚合物化合物，例如蛋白G或该家族的一种蛋白。
8.权利要求6的方法，其中不溶性聚合物化合物如金属、塑料或玻璃被用做所述的不溶性物质。
9.权利要求6的方法，其中含有酰胺基团的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。
10.权利要求6的方法，其中所述的抗体结合分子在抗体分子上的一个或多个部位与该抗体分子相结合。
11.一种基质，其通过与抗体结合分子结合而固定了抗体，其中所述抗体结合分子通过非共价结合作用包埋在不溶性物质上的含有酰胺基团的凝胶中。
12.权利要求11的基质，其中所述的抗体结合分子被非共价键地包埋在酰胺基团中，它是一种含有抗体结合活性的生物聚合物或聚合物复合物，如蛋白G或该家族的一种蛋白。
13.权利要求11的基质，其中一种不溶性聚合物化合物如金属、塑料或玻璃用做不溶性物质。
14.权利要求11的基质，其中所述含有酰胺基团的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。
15.权利要求11的基质，其中所述不溶性物质的表面用甲基聚丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷处理，并且通过聚合将含有酰胺基团的凝胶施加在该表面上。
16.权利要求1的方法，其中所述地址接头通过权利要求6所述的方法固定在所述基质上。
17.权利要求5的生物芯片，其中权利要求11所述的基质用于固定所述地址探针肽、生物聚合物或多克隆抗体。
全文摘要
本发明涉及基于抗原－抗体相互作用的生物聚合物检测方法，其中该方法显示出提高了的S/N比率、提高了的检测灵敏度和减少了的检测时间。本发明还涉及这些方法在生物芯片上的应用。本发明还涉及抗体固定方法，其中抗体分子被固定到含有酰胺基团的凝胶、或不溶性物质上的含有酰胺基团的凝胶上。使用这样的凝胶防止了抗体结合分子的非特异性吸附。通过将这些抗体结合分子包埋在这样的凝胶中，防止了它们的抗体结合活性的退化。通过将靶生物聚合物捕获到基质面来检测生物聚合物的方法，包括以下步骤(1)将靶生物聚合物，连同探针生物聚合物和由抗体或地址探针肽或连结于它们的表面的生物聚合物地址接头所识别的珠一起，置入溶液中；(2)使靶生物聚合物与探针生物聚合物杂交；以及(3)通过抗原－抗体相互作用、通过地址探针肽或生物聚合物或多克隆抗体分子来识别结合到基质上的地址接头。固定抗体的方法包括以下步骤(1)在二或三维空间中将用抗体结合分子包埋的含有酰胺基团的凝胶施加在不溶性物质的基质上；和(2)将抗体分子的基部附着到抗体结合分子上。
文档编号G01N33/543GK1629636SQ200410090010
公开日2005年6月22日 申请日期2004年10月8日 优先权日2003年10月6日
发明者嶋本伸雄, 须佐太树, 福岛和久 申请人:情报系统研究机构, 横河电机株式会社