专利名称：一种生物芯片标记和检测方法
技术领域：
本发明涉及一种生物芯片标记和检测方法。
背景技术：
由于无机纳米粒子(金,银，量子点等)具有特殊的物理和化学性质，近 十年来被广泛应用于各种纳米技术，生物纳米技术和生物医学检测技术等
领域(化学综述，C/ e/w, Wev.， 2004， 7似，293-346; C/2ew. itev., 2005, /6>5， 1547-1562)。表面增强拉曼(SERS)是一种非常灵敏的光学检测手段，其 理论检测限可以达到单分子，并且能定量与定性同时进行(化学物理B， 丄尸/7乂、 S， 1997,川7, 1338;拉曼光谱杂志，J.S/ erfm^., 2005,
36,485)。生物芯片是目前基因组学，蛋白质组学研究的重要工具，具有 高通量，并对检测样品消耗量少等优点(基因生物学，Genome Biol. 2001， 2， research 0004.1 0004.13)。但目前，生物芯片主要以荧光为检测手段， 因而在检测灵敏度，选择性等方面尚具有一定的缺点；拓展生物芯片的检 测手段对其发展有重要意义(Atowe， 2007， 4,437-444)。将金纳米粒子 标记生物芯片和表面增强拉曼检测生物芯片方法相结合，有助于提高生物 芯片的灵敏度，重现性和选择性。
发明内容
以多肽混合物如胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰 丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素甘氨酸修饰金
纳米粒于具有合成方法简单，快速并且稳定性好，生物相容性好等优点。
而亲和素-生物素(avidin-bu)tm)是目前发现的最稳定的配合物。本发明利 用亲和素-生物素反应以多肽如胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨 酸与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素甘 氨酸修饰的金纳米粒子标记物；通过拉曼染料修饰亲和素与生物素反应标 记生物芯片，并结合表面银增强技术以SERS为检测手段，研制一种生物 芯片标记与检测方法；并实现多肽，蛋白质检测和蛋白质之间相互作用和 酶与底物之间相互作用的研究。
本发明的目的是提供一种生物芯片标记和检测方法； 一种以金纳米粒 子标记物，表面增强拉曼为检测手段的生物芯片标记和检测方法。
本发明的方法的具体的技术方案如下
图1是本发明的方法的技术路线示意图。其中，a)是多肽检测；b) 是检测酶与底物相互作用；c是蛋白质检测。
(1) 多肽修饰金纳米粒子的合成，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多 肽混合溶液以摩尔比l: 50000混合，常温反应l小时后，在转速为13000 转/分钟的条件下通过3次离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒 子；
所述的多肽混合溶液为胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与 胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素甘氨酸 的混合溶液；
将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中，4°C下保存。
(2) 标记生物芯片，将以美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方
法制作的多肽或蛋白质生物芯片与200 pL的浓度为lOO ng/mL-lOO^g/mL 的拉曼活性染料标记的亲和素(avidin)和浓度为5.0xl(T9 M的多肽修饰 的金纳米粒子，在37。C反应1小时，得到标记生物芯片；得到的标记
生物芯片清洗并用N2吹干。
所述的生物芯片包括多肽浓度为l ng/mL-lmg/mL的点阵的多肽芯 片，含蛋白A(proteinA)浓度为IO ng/mL-l mg/mL的点阵的蛋白质芯片； 多肽底物浓度为l ng/mL-lmg/mL的点阵的多肽底物芯片。
(3) 银增强反应，为了进一步提高检测灵敏度，将标记的生物芯片 与l mL银增强溶液反应10分钟；所述银增强试剂为美国西格玛
(Sigma)产品，包括溶液A(硝酸银，AgN03)与溶液B(氢醌)两种溶液， 使用时溶液A与溶液按1:1混合。
(4) 以表面增强拉曼检测上述生物芯片，具体条件和步骤如下将
上述生物芯片放置于雷尼绍(Remshaw) 2000型激光共聚焦拉曼光谱仪 的显微镜样品台上，以氩离子激光器产生的能量为10毫瓦波长为514纳米 的激光为激发波长，使用CCD检测器采集拉曼光谱，每条拉曼光谱的采集 时间为10秒。
本发明的有益效果明显(1)本发明提供一种多肽修饰金纳米粒子标 记方法，与其他金纳米粒子标记方法相比具有，简单，稳定，快速等优点。 (2)本发明提供了金纳米粒子标记生物芯片和表面增强拉曼检测生物 芯片的方法具有一定的通用性，并具有灵敏度高(100ng/mL)，选择性好 以及样品消耗量少的特点。应用本方法可实现对多肽，蛋白质检测以及抗 原抗体(如蛋白A与免疫球蛋白G)，酶与底物(激酶PKA与底物)相互
作用研究。
利用这一方法所获得的多肽检测限为10 fg，线性范围为3个数量级。
这一方法所获得的蛋白A检测限为100fg，免疫球蛋白(IgG)的检
测限为O.l jiig/mL; 二者的线性范围均为3个数量级。 利用这一方法成功检测到PKA与底物相互作用。
图l本发明的方法的示意图。其中，a)是多肽检测；b是检测酶与底物 相互作用；c是蛋白质检测。 ' 图2是所获得的多肽点阵与a)以银增强试剂反应前和b)银增强试剂反
应后的光学照片。
图3用本发明的方法所获得的检测的标准曲线图。其中a)是多肽检测 的标准曲线图，b)蛋白A (protein A)的检测的标准曲线图，c)是免疫蛋白 G(biotin-IgG)的检测的标准曲线图。
图4本发明的方法所检测获得的激酶PKA与底物多肽LRRASLG线互 作用的拉曼光谱图。
具体实施方式
实施例l:多肽检测
应用美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法制作含有7种不同 多肽浓度1 ng/mL， 10 ng/mL， 100 ng/mL， 1 jug/mL， 10 pg/mL， 100pg/mL， lmg/mL的点阵的多肽芯片，通过1% (w/v)牛血清蛋白(BSA) 封闭芯片。并依次与200jxL的(1) 1 [ig/mL荧光素标记的亲和素
(avidin-fluorescein)和(2) 5.0xl(T9 M多肽修饰的金纳米粒子各反应1 h， 再进一步与1 mL银增强溶液反应10分钟后应用Renishaw 2000型拉曼光 谱仪检测在激发波长为514 nm的拉曼响应。利用这一方法所获得的多肽检 测限为10 fg，线性范围为3个数量级。
实施例2:蛋白质检測
应用美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法制作含6种有不同 蛋白A(protein A)浓度10 ng/mL ， 100 ng/mL ， 1 ng/mL ， 10吗/mL ， 100ng/mL， lmg/mL的点阵的生物芯片，通过l。/。(w/v)牛血清蛋白(BSA) 封闭芯片。并依次与200 的(1) 10 ng/mL-lmg/mL生物素标记的免疫 蛋白G(biotin-IgG)， (2) 1 pg/mL荧光素标记的亲和素(avidin-fluorescein) 和(3) 5.0x10—9 M多肽修饰的金纳米粒子各反应1 h，再进一步与1 mL银 增强溶液反应10分钟后应用Renishaw 2000型拉曼光谱仪检测在激发波长 为514nm的拉曼响应。利用这一方法所获得的proteinA检测限为100 fg， IgG的检测限为0.1jiig/mL; 二者的线性范围均为3个数量级。
实施例3:检渊酶与底物相互作用
应用美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法制作含有7不同多 肽底物浓度lng/mL，10ng/mL， 100ng/mL， 1 pg/mL， 10 ng/mL， 100pg/mL， lmg/mL的点阵的多肽底物芯片，通过1% (w/v)牛血清蛋白 (BSA)封闭芯片。并依次与200 pL的(1) 100 三磷酸腺苷(ATP) 和100单位激酶PKA， (2) 20 ng/mL生物素修饰磷酸化丝氨酸抗体 (anti-phosphoserine-biotin ) ， ( 3 ) 1 ng/mL荧光素标记的亲禾口素 (avidin-fluorescein)和(4) 5.0xl(T9 M多肽修饰的金纳米粒子各反应1 h，
再进一步与1 mL银增强溶液反应10分钟后应用Renishaw 2000型拉曼光 谱仪检测在激发波长为514nm的拉曼响应。利用这一方法成功检测到PKA
与底物相互作用。
权利要求
1，一种生物芯片的标记与检测方法，其特征在于，其步骤和条件为(1)多肽修饰金纳米粒子的合成，将柠檬酸钠修饰的金纳米粒子与多肽混合溶液以摩尔比1∶50000混合，常温反应1小时后，在转速为13000转/分钟的条件下通过3次离心提纯反应产物，获得多肽修饰的金纳米粒子；所述的多肽混合溶液为胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酸与胱氨酰丙氨酰亮氨酰天门冬氨酰天门冬氨酰甘氨酰赖氨酰-生物素甘氨酸的混合溶液；将多肽修饰的金纳米粒子分散在中性磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存；(2)标记生物芯片，将以美国斯坦福大学布朗实验室所制定的标准方法所制作的生物芯片与200μL的浓度为100ng/mL-100μg/mL的拉曼活性染料标记的亲和素和浓度为5.0×10-9M的多肽修饰的金纳米粒子，在37℃反应1小时，得到标记生物芯片；得到的标记生物芯片清洗并用N2吹干；所述的生物芯片包括多肽浓度为1ng/mL-1mg/mL的点阵的多肽芯片，含蛋白A浓度为10ng/mL-1mg/mL的点阵的蛋白质芯片，多肽底物浓度为1ng/mL-1mg/mL的点阵的多肽底物芯片；(3)银增强反应，为了进一步提高检测灵敏度，将标记的生物芯片与1mL银增强试剂反应10分钟；(4)以表面增强拉曼检测上述生物芯片，具体条件和步骤如下将上述生物芯片放置于Renishaw 2000型激光共聚焦拉曼光谱仪的显微镜样品台上，以氩离子激光器产生的能量为10毫瓦，波长为514纳米的激光为激发波长，使用CCD检测器采集拉曼光谱，每条拉曼光谱的采集时间为10秒。
全文摘要
一种新型生物芯片标记与检测方法。本发明提供了金纳米粒子标记生物芯片和表面增强拉曼检测生物芯片的方法具有一定的通用性，并具有灵敏度高(100ng/mL)，选择性好以及样品消耗量少的特点。应用本方法可实现对多肽，蛋白质检测以及抗原抗体如蛋白A与免疫球蛋白G，酶与底物如激酶PKA与底物的相互作用研究。利用这一方法所获得的多肽检测限为10fg，线性范围为3个数量级。这一方法所获得的蛋白A检测限为100fg，免疫球蛋白(IgG)的检测限为0.1μg/mL；二者的线性范围均为3个数量级。利用这一方法成功检测到PKA与底物相互作用。
文档编号G01N33/48GK101201346SQ20071005638
公开日2008年6月18日 申请日期2007年12月6日 优先权日2007年12月6日
发明者刘殿骏, 桃 李, 王振新 申请人:中国科学院长春应用化学研究所