专利名称：20(S)-人参皂苷Rh<sub>2</sub>硫酸化修饰及其硫酸酯钠分离鉴定方法
技术领域：
本方法涉及一种人参皂苷化学修饰及其衍生物分离鉴定方法，特别是20(0-人参皂苷Rh2硫酸化修饰 方法及其所生成20(5)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠的分离鉴定方法。
背景技术：
人参皂苷(Ginsenosides)是人参属植物人参、西洋参、三七等主要的有效成分之一，其结构由苷元和 糖或糖链组成，为达玛烷型四环三萜类化合物。从其构效关系可以看出，人参皂苷的生物学活性与其所含 的糖有关(#《,運，叛梦，嚴茶杰.乂参必众^^e^^^"^^话丝^^f^^^展与^^虔.汰銜《辟犬学学叛， 7999, 7(5 OJ , "/ 7J6)，如Rh2比Rg3少一个糖，而抗肿瘤活性Rh2比Rg3活性强，Rd比R&在C20 上多一个糖，却没有抗肿瘤活性。为了从人参皂苷中寻找活性更强药物，对其进行分子结构修饰，因苷元 为较稳定的环垸烃结构，很难进行改造，而对其糖或者糖链进行化学修饰则更显得容易和可能。
从糖链化学修饰出发，通过査阅大量的文献资料我们注意到多糖硫酸化修饰。硫酸化多糖除有抗凝作 用外，还具有多种生物活性，如增强机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等。人们通过化学修饰得到了较多的 天然多糖的硫酸化衍生物。如香菇多糖、褐藻淀粉、右旋糖酐、地衣多糖、牛膝多糖、昆布多糖等硫酸化 多糖,也表明具有很好的生物学活性(f劣乾李孰敦把远，等.多凝紫賴梦像银充遂展.^厨,秀工 L絲'扁，"，仰.-W"簾餘文清.微潔化多薪微游裔遂展.天孝,学，，2, 〃 "义-")。 由于多糖硫酸化修饰后表现良好活性，人参皂苷修饰的着眼点应放在糖或者糖链硫酸化修饰。从理论上讲 皂苷类的硫酸化修饰与多糖的硫酸化反应原理应该是相通的，都是在路易斯碱溶液中由S03H+取代多糖羟 基中的H、经中和得到硫酸酯盐(历庚元，李寿銜,A,克争.孕蘑多薪薪激蘑游^"成J 真贫谅奉话丝.^ 学学叛，卯(T2J : 707~/7i)。
人参皂苷的化学修饰主要集中于皂苷糖链的降解、代谢和合成，尤其是酶解人参皂苷得到抗肿瘤活性 强的Rh2 (遂遂，i遂乂参启^朋2贫，磨/^^游發究.徵生激学染吉，2003, .- 6/ M)、化合
物K 一神激多乂参巷伊Co附po"wfi -K游方法.20似/(W/柳W.0, 2朋5-W-26)等为
当前化学修饰研究的热点。1983年北川勋首次从红参中发现20(5>人参皂苷-11112 (ginsenoside-Rh2),其化 学名为20CS)-原人参二醇-3-氧-(3-D-卩比喃葡萄糖苷[20(5)-protopanaxadiol-3-0-p-D-gluc叩ytanoside](以下简 称Rh2)。从红参中分离到的Rh2仅有十万分之一的收率，为了提高Rh2的产量，大量研究者(^Z^^f.嚴 兹改变乂参^^薪基劍吝賴存乂参启就游方法.中厨专教，99"2764丄7999-03-/7;丈蓬无与翁效,赝 公眾.20向-乂参着武-朋2游教吝方兹J ^"药激级^激及应欲.9S/flO"7.S,"卵-M-05; ^ 腐辨学腐义遂众学激遭薪究尿 一浙潔俯霉及屑其潔,乂参启^劍吝獰存恋凝丝乂参启^游方法.^W专 3% WHWOH 2002-06-2。通过酸、碱或酶等降解方法对人参或西洋参中原人参二醇类皂苷进行糖链
化学修饰，得到了更多的Rh2,以满足实验或临床用药。目前尚未见皂苷类以及Rh2的硫酸化修饰方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于为人参皂苷Rh2的分子结构改造提供一种硫酸化修饰方法，也为20(5)-人参皂苷 Rh2硫酸酯钠的分离纯化及鉴定提供方法，为进一步优化人参皂苷的分子结构，寻找生物活性更强的人参 皂苷衍生物提供科学依据和新的研究思路，也为皂苷类化合物的深入开发提供一种思路。该方法包括酯化 试剂的制备，20(S)-人参皂苷Rh2与酯化试剂混合的摩尔比、反应的时间和温度，用柱层析分离的条件和 步骤，衍生物的HPLC、 IR、 MS、 'H-NMR; 13C-NMR的鉴定。
(一)酯化剂的制备
氯磺酸与预冷的无水吡啶充分混合、在冰盐浴下缓慢反应，出现淡黄色固体，酯化剂制备结束。
(二 ) 20(S)-人参皂苷Rh2硫酸化修饰 20(S)-人参皂苷Rh2溶于无水吡啶中，倒入放有酯化试剂的烧瓶，充分混合反应。
(三) 20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠的分离
用NaOH中和至pH 7.0，除去沉淀，干燥滤液。TLC分析，分为I 、 II、 III类物质，样品用正相柱层 析法分离，TLC检测流分，分段收集流分I、 II、 III，并干燥。再将流分II用反相柱层析分离，得到2个 20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠。用HPLC分析，结果表明这2个20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠用70%甲醇冲 柱，柱保留时间1个为8分钟左右，另1个为10分钟左右。
(四) 20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠的结构鉴定
IR光谱分析、MS分析、核磁共振波谱分析。MS结果表明分子量均为724，其中1个的IR光谱中除 保留Rh2特征吸收峰外，增加了还增加了硫酸酯键(810cm"左右C-O-S的拉伸振动特征吸收峰，和1230 cm"左右的吸收的S=0峰)，是在Rh2分子-OH的H上取代了 1个-S03Na基团，核磁共振波谱结果表明一 个是在RhrC,2位上-OH的H上取代， 一个是在glc-C6位上-OH的H上取代，他们是一对同分异构体。
本发明中涉及的氯磺酸与20(S)-人参皂苷Rh2的质量摩尔比的范围1~4 : 1，氯磺酸的量影响20(5)-人参皂苷Rh2分子上OH的H取代，氯磺酸的量过少，则产量较少，有大量没有反应的20(Q-人参皂苷Rh2。 过量氯磺酸会增加的20(S)-人参皂苷Rh2分子上更多的OH的H被取代。
本发明中涉及的20(S)-人参皂苷Rh2的纯度达到94.6%。 20(5>人参皂苷处2硫酸化修饰反应的温度范 围室温 40'C。反应时间范围3~9h。本发明涉及的反应温度不能过高，过高的反应温度影响衍生物的 产量。
本发明中涉及20(5)-人参皂苷Rh2硫酸化修饰反应后产物的TLC分析所用展开系统CHCl3_AcOEt —MeOH—H20 (15 : 40 : 22 : 10)取水相。正相柱层析法分离的填料为硅胶(100-200目、1.5X30 cm), 流动相依次用[CHCl3—MeOH (12 : 1); CHC13—MeOH (8:1); CHC13—MeOH (3:1)]洗脱，TLC 检测流分。反相柱层析分离的填料为ODS (50 um、 1X25 cm),用80%甲醇洗脱，每瓶收集5~7 mL。
本发明中涉及的HPLC分析的条件为70%色谱纯甲醇溶解(1 mg/mL)，检测条件为HYPERSILBDSds柱(5nmlD4.6)，流动相色谱纯甲醇水=70 : 30 (V/V)，柱温室温，进样量5 pL，检测波长: 203 nm，用sp-2000色谱工作站2.12版进行分析。
表1是20(5)-人参皂苷Rh2与2个20(5>人参皂苷处2硫酸酯钠"C-NMR数据比较
表1 20(5>人参皂苷Rh2与2个20(5)-人参皂苷处2硫酸酯钠13C-NMR数据比较(S c)
Compounds Compounds
No.CRh2-Reference Rh2-ExperimentII alibNo.CRh2-ReferenceRh2-ExperimentII alib
C-l39.439.339.439.2C-1916.416.515.716.4
227.327.327.627.22073.273.174.173.1
88.988.988.889.52127.027.026.826.8
440.240.240.140.12235.435.335.135.3
56.756.656.556.52323.123.223.023.1
618.718.618.518.624126.4126.5126.3126.5
36.136.036.736.025130.7130.9130.9130.9
837.237.137.237.02625.726.025.926.0
950.750.650.850.52717.717.817.917.9
1039.839.839.839.72828.328.328.228.3
1132.232.230.0*32.22916.016.016.516.0
1271.171.180.6*71.13017.317.217.417.2
1348.848.746.9*48.7G-C-l106.7107.1107.1107.2
1451.951.952.9*51.9G-C-275.875.975.975.8
1531.531.532.131.5G-C-378.778.978.878.3
1626.826.926.827.0G-C-472.272.072.071.5*
1754.854.653.554.9G-C-578.078.578.675.7*
1816.817.016.816.9G-C-663.363.263.268.6*
*表示与Rh2不同的化学位移值
图1是20(5>人参皂苷Rh2和反应后所有物质的TLC 其中左边是反应用的20(5)-人参皂苷Rh2
右边是反应后所有物质，将其分为I、 II 、 III类物质 图2是ODS柱分离得到II a、 II b的HPLC 其中左边是IIa的柱保留时间
右边是IIb的柱保留时间 图3是20(S)-人参皂苷Rh2和II a的IR光谱 其中上面一条是IIa的IR光谱
下面一条是20(5)-人参皂苷Rh2的IR光谱 图4是IIa的MS图5是IIb的MS 图6是IIa的13C-NMR及放大谱 图7是lib的13C-NMR及放大谱 图8是20(Sy人参皂苷Rh2的结构图 图9是IIa的结构图 图10是IIb的结构图具体实施方式
实施例1
在带有搅拌装置和冷凝装置的烧瓶中加入预冷的无水吡啶2mL，并将烧瓶置于冰盐水浴中，较为剧烈 的不停搅拌，再将氯磺酸84 ^L逐滴加入，出现淡黄色固体，酯化剂制备结束。精确称取20(5>人参皂苷 Rh2200mg，溶于2mL无水吡啶中。倒入放有酯化试剂的烧瓶，置于室温下不停搅拌，反应3小时。
反应物在冰浴中用1 mol/L NaOH中和至pH 7.0。有白色沉淀析出，减压过滤，干燥滤液得310 mg。 用展开系统(CHCl3—AcOEt—MeOH—H20 (15 : 40 : 22 : 10)取水相)进行TLC分析，分为I 、 II、 III类 物质。用2倍硅胶拌样，硅胶柱层析方法分离(硅胶100-200目、1.5X30 cm)，依次用展开系统(CHC13 —MeOH (12 : 1); CHC13—MeOH (8 : 1); CHCl3_MeOH (3 : l))为流动相洗脱，TLC检测流分，分 段收集流分I、 II、 III，并干燥。回收流分n约有100mg,将流分II用ODS (SOum、 1X25 cm)填料进行 反向柱层析分离，80%甲醇洗脱，每瓶收集5mL，分别得到两个衍生物IIa (40mg)、衍生物IIb (46mg)。
衍生物IIa进行HPLC、红外吸收光谱、质谱、核磁共振波谱分析，确定分子结构。
衍生物IIb进行HPLC、质谱、核磁共振波谱分析，确定分子结构。
实施例2
在带有搅拌装置和冷凝装置的烧瓶中加入预冷的无水吡锭2mL,并将烧瓶置于冰盐水浴中，较为剧烈 的不停搅拌，再将氯磺酸21 ^L逐滴加入，出现淡黄色固体，酯化剂制备结束。精确称取20(5)-人参皂苷 Rh2100mg,溶于2mL无水吡啶中。倒入放有酯化试剂的烧瓶，置于室温下不停搅拌，反应3小时，然 后加热至30、 4CTC，各反应3小时。
反应物在冰浴中用1 mol/LNaOH中和至pH7.5。有白色沉淀析出，减压过滤，干燥滤液得150mg。 用展开系统(CHCl3—AcOEt—MeOH—H20 (15 : 40 : 22 : 10)取水相)进行TLC分析，分为I 、 II、 III类 物质。用2倍硅胶拌样，硅胶柱层析方法分离(硅胶100 200目、1.5X30 cm)，依次用展开系统(CHC13 —MeOH (12 : 1); CHCl广MeOH (8:1); CHC1广MeOH (3:1))为流动相洗脱，TLC检测流分，分 段收集流分I、 II、 III，并干燥。回收流分II约有50mg，将流分II用ODS (50um、 1X25 cm)填料进行 反向柱层析分离，80%甲醇洗脱，每瓶收集5mL，分别得到两个衍生物IIa (20mg)、衍生物IIb(22mg)。
衍生物IIa进行HPLC、红外吸收光谱、质谱、核磁共振波谱分析，确定分子结构。
6衍生物IIb进行HPLC、质谱、核磁共振波谱分析，确定分子结构。
权利要求
1. 一种20(S)-人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠的分离鉴定方法。其特征在于20(S)-人参皂苷Rh2溶于吡啶，以氯磺酸-吡啶盐作为酯化试剂进行硫酸化修饰。
2. 按照权利要求1所述20(5>人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠 的分离鉴定方法。其特征在于氯磺酸与Rh2的质量摩尔比的范围1~4:1。
3. 按照权利要求1所述20(5)-人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(5)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠 的分离鉴定方法。其特征在于所用的原料20(5>人参皂苷处2纯度》94.6%。
4. 按照权利要求1所述20(5>人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(5)-人参皂苷处2硫酸酯钠 的分离鉴定方法。其特征在于20(5>人参皂苷Rh2硫酸化修饰反应的温度范围室温 40'C。反应时间范围 3~9h。
5. 按照权利要求4所述20(5)-人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(5)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠 的分离鉴定方法。其特征在于用NaOH中和至pH 7.0,除去沉淀，干燥滤液。20(5)-人参皂苷Rh2硫酸化 修饰反应后产物的TLC分析所用展开系统CHC13—AcOEt—MeOH—H20 (15 : 40 : 22 : 10)取水相， TLC分析，分为I、 II、 III类物质。正相柱层析法分离的填料为硅胶(100-200目、1.5X30 cm)，流动相 依次用[CHCl3_MeOH (12 : 1); CHC13—MeOH (8:1); CHC13—MeOH (3:1)]洗脱，TLC检测流 分，分段收集流分I 、 II、 III，并干燥。再将流分II用反相柱层析分离，其填料为ODS (50um、 1X25cm)， 用80%甲醇洗脱，每瓶收集5~7 mL。得到2个20(Q-人参皂苷处2硫酸酯钠。
6. 按照权利要求5所述20(5>人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(5)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠 的分离鉴定方法。其特征在于20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠的HPLC分析的条件为70%色谱纯甲醇溶解(1 mg/mL)，检测条件为HYPERSILBDSds柱(5 pmlD4.6),流动相色谱纯甲醇水=70 : 30(V/V)， 柱温室温，进样量5pL，检测波长203 nm，用sp-2000色谱工作站2.12版进行分析。
7. 按照权利要求1 6所述20(5>人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(5)-人参皂苷Rh2硫酸酯 钠的分离鉴定方法。其特征在于20(S)-人参皂苷Rh2硫酸酯钠应用红外光谱、质谱、核磁共振波谱进行结 构鉴定。MS结果表明分子量均为724，其中1个的IR光谱中除保留Rh2特征吸收峰外，增加了还增加了 硫酸酯键(810 cm-l左右C-O-S的拉伸振动特征吸收峰，和1230 cm-l左右的吸收的S=0峰)，是在Rh2 分子-OH的H上取代了 1个-S03Na基团，核磁共振波谱分析结果表明他们是一对同分异构体， 一个是在 Rh2-C12位上-OH的H上取代， 一个是在glc-C6位上-OH的H上取代。
8. 按照权利要求1所述20(5)-人参皂苷Rh2硫酸化修饰方法及其所生成20(5>人参皂苷Rh2硫酸酯钠 的分离鉴定方法。其特征在于包括皂苷类化合物硫酸化修饰方法及其所生成产物的分离鉴定方法。
全文摘要
本方法涉及一种人参皂苷化学修饰及其衍生物分离鉴定方法，特别是20(S)-人参皂苷Rh<sub>2</sub>硫酸化修饰方法及其所生成20(S)-人参皂苷Rh<sub>2</sub>硫酸酯钠的分离鉴定方法。本发明的特征是将制备好的氯磺酸-吡啶酯化剂与20(S)-人参皂苷Rh<sub>2</sub>进行反应，通过柱层析分离技术，分离到2个目标化合物20(S)-人参皂苷Rh<sub>2</sub>硫酸酯钠。谱学证明其除保留Rh<sub>2</sub>红外光谱特征峰外，还增加了硫酸酯键，其分子量均为724，是在Rh<sub>2</sub>分子-OH的H上取代了1个-SO<sub>3</sub>Na基团，是一对同分异构体。本发明的目的在于为人参皂苷的分子结构改造提供一种硫酸化修饰方法，为寻找生物活性更强的人参皂苷衍生物提供科学依据和新的研究思路，也为皂苷类化合物的深入开发提供一种思路。
文档编号G01N21/35GK101440114SQ20071005633
公开日2009年5月27日 申请日期2007年11月22日 优先权日2007年11月22日
发明者付本懂, 鲁 王, 申海清, 褚秀玲, 许小琴, 韦旭斌 申请人:韦旭斌;王 鲁;付本懂