专利名称：陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在线检测细胞或组织状态的系统，具体是一种陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统。用于生物技术领域。
背景技术：
从陆生植物与海藻中提取的次生代谢产物是目前重要的药用化合物来源，在当今世界市场上已知300多种生物产品中，90％以上能从陆生植物与海藻中找到。但其中某些化合物的化学结构复杂，很难通过化学合成或半合成的方法获得，从而使利用光生物反应器在可控和工程优化条件下培养陆生植物细胞或组织成为未来工业化大规模生产获得这些活性物质的有效手段。同人工栽培获得整株植物体相比，生物反应器培养具有可在线检测、可控、产品质量均一等优点；尤其，在可控条件下的工程优化为大幅度提高原本含量极微的次生物质的产量提供了可能。在反应器培养的过程中，实时了解细胞浓度和存活率情况是至关重要的。通过细胞浓度和存活率的数据，操作人员才能对细胞或组织生长情况进行控制。然而在目前检测反应器内细胞的生物状态，绝大部分仍然通过手工取样来完成，然后通过繁琐的实验来确定反应器内的细胞浓度和存活率，其有效性和即时性都不能满足自动化生产的需求。
经对现有技术文献的检索发现，Huang YM等人在《Biotechnology Progress》2002，1862-71上发表的“Dynamics of Oxygen Evolution and Biomass Productionduring Cultivation of Agardhiella subulata Microplantlets in a Bubble-ColumnPhotobioreator under Medium Perfusion”(“在鼓泡式光生物反应器中培养Agardhiella subulata微繁殖体的生氧动力学和生物量”，《生物技术进展》)一文中，提出了一种培养海洋藻类细胞或组织的光生物反应器系统，该系统由罐体、光照系统、灌注系统、pH和溶氧、鼓气装置、取样装置等组成。其中溶氧系统用来检测细胞的光合作用活性。该系统的不足之处在于不能实时检测细胞浓度和存活率，测量细胞浓度要经过取样装置取得样品后在实验台上测量细胞干重来解决，繁琐而且不准确。溶氧探测器仅能获得培养罐内的溶解氧浓度这一原始的数据，从而无法反映细胞的活性，不能得到准确的细胞存活率的数据。此外，频繁的取样增加了反应器系统染菌的风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，针对在现有光生物反应器中测量细胞浓度和细胞存活率这两个重要参数时自动化程度不高、速度慢、精确度低、需频繁取样的缺点，提供了一种陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统，使其能实现连续在线监测、全封闭运行，无需频繁取样，测量数据准确快速。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括支架、显示面板、数据采集器、光合活性检测系统、样品入口、样品出口、取样阀、透射皿入口阀、入射光源、透射皿、透射皿出口阀、感光板、蠕动泵。其连接方式为样品入口和样品出口位于支架外，作为和外接反应器罐体的接口，其余的组件均位于支架之内，样品入口、取样阀、光合活性检测系统、透射皿入口阀、透射皿、透射皿出口阀、蠕动泵和样品出口之间通过生物无害的硅胶管道依次相连，培养液在蠕动泵的带动下依次流经以上组件，然后返回到外接反应器中。透射皿正上方垂直固定入射光源。数据采集器的主体为x86兼容32位主机，具有COM1、COM2和COM3一共3个标准通讯接口。显示面板和数据采集器通过螺丝固定在支架上，显示面板和数据采集器的COM3端口通过数据线相连接。光合活性检测系统通过数据线与数据采集器的COM1端口相连接。感光板和数据采集器的COM2端口通过数据线相连接。
光合活性检测系统由溶氧探头、遮光罩、搅拌桨、取样室、冷光源组成。在取样室的顶端安装有溶氧探头，通过密封的插口竖直插在取样室顶部，并通过数据线与数据采集器的COM1端口相连接。光合活性检测系统是整个系统中用来检测细胞氧气生成速率的部分。遮光罩为不透光、隔热材料制成的圆柱形容器，取样室为生物无害的玻璃材料制成的圆柱形容器，取样室的侧外表面直接粘贴在遮光罩的内表面上，位于遮光罩的中段。搅拌桨为生物无害的磁性材料制作，安装于取样室顶部正中，其叶片下缘距搅拌室底部的距离为搅拌室高度的1/3。，搅拌桨以较低的速度搅拌取样室内的液体，保证其中的细胞或组织处于悬浮状态。距取样室的下表面5～10厘米处安装有冷光源，用螺丝固定在遮光罩的内壁底部。冷光源的光可以透过取样室的底面进入取样室，供取样室内的细胞进行光合作用。冷光源可以提供25～200μE/m2s的光强，基本覆盖了所有陆生植物和海藻细胞培养所使用的光强范围。当冷光源关闭时，取样室内的细胞不进行光合作用，仅通过呼吸作用消耗氧气，取样室内的溶解氧含量即缓慢下降，当冷光源打开时，细胞开始进行光合作用，取样室内的溶解氧含量即缓慢上升。通过溶氧探头探测到的溶解氧含量上升的速度即反映了细胞光合活性的大小。该信号通过数据采集器中搜集，作为计算细胞存活率的数据之一。
入射光源、透射皿和感光板为整个系统中检测细胞浓度的部分。透射皿为高度1厘米，直径3至5厘米的石英玻璃圆柱形容器，上下两表面的玻璃厚度不大于1毫米，外侧表面玻璃厚度不小于2毫米。透射皿水平固定在支架上，正上方垂直固定入射光源，入射光源的镜头距透射皿上表面3厘米。正下方固定水平的感光板，感光板的上表面距透射皿下表面3厘米。光线入射点、透射皿上表面的中心点和感光板的中心点位于同一直线上。入射光源为波长可调的可见光和紫外光发生器，入射光通过透射皿后，继续透射到下方的感光板上，感光板将检测到光强数据返回到数据采集器。数据采集器将该光强信号和标准的光强信号进行比较，即可以计算出透射皿内细胞的浓度。然后和从光合活性检测系统得到的溶解氧含量上升的速度联合起来，就可以计算机出单位量细胞的氧气生成速度，根据和标准值的比较，进一步计算出细胞的存活率。
本发明工作时，样品入口、样品出口分别连接到外接的反应器罐体上，蠕动泵将培养液从反应器罐体内抽入取样室和透射皿，当培养液充满整个取样室和透射皿时，入射光源打开，数据采集器首先从感光板获得细胞浓度数据。当冷光源关闭时，取样室内的氧气溶解量被细胞的呼吸作用逐渐耗尽，降低到接近零值，此时冷光源打开后，数据采集器即可采集取样室内氧气溶解量上升的过程，然后计算出细胞的存活率。当一个测量周期结束时，蠕动泵将系统内所有的培养液泵回外接的反应器，同时将取样室和透射皿内充满新一批的培养液，进行下一个周期的测量。
本发明将细胞的浓度和存活率的检测集中到一个仪器之中，节省了分析的时间和人力，实现了真正意义上的实时在线检测。细胞浓度和存活率的数据不仅比手工实验获得的数据准确可靠，而且能够进行整个培养过程中的连续不间断检测，所检测到的数据可以直接指导反应器的操作人员通过改变反应器的运行状态来提高细胞的产量和活性。整个系统全封闭运行，培养液和外界不存在接触和感染的机会，大大提高了操作人员的工作效率。
同现有技术相比，本发明更加模块化，集中考虑到细胞浓度和存活率的检测是一个一体的过程，将整个检测过程整合到一个系统中，高效快速，非常适合大规模工业化培养植物或海藻细胞的要求，可大大提高整个生产过程的自动化水平。
图1为本发明结构示意2为本发明光合活性检测系统结构示意3为本发明数据采集器结构示意中，1.支架 2.显示面板 3.数据采集器 4.光合活性检测系统 5.样品入口 6.样品出口 7.取样阀 8.透射皿入口阀 9.入射光源 10.透射皿11.透射皿出口阀 12.感光板 13.蠕动泵 14.溶氧探头 15.遮光罩 16.搅拌桨 17.取样室 18.冷光源 19.x86兼容32位主机 20.COM1端口 21.COM2端口 22.COM3端口。
具体实施例方式
如图1-3所示，本发明包括支架1、显示面板2、数据采集器3、光合活性检测系统4、样品入口5、样品出口6、取样阀7、透射皿入口阀8、入射光源9、透射皿10、透射皿出口阀11、感光板12、蠕动泵13。其连接方式为样品入口5和样品出口6位于支架1外，其余的组件均位于支架1之内，样品入口5、取样阀7、光合活性检测系统4、透射皿入口阀8、透射皿10、透射皿出口阀11、蠕动泵13和样品出口6之间通过生物无害的硅胶管道依次相连，透射皿10正上方垂直固定入射光源9，显示面板2和数据采集器3通过螺丝固定在支架1上，显示面板2、光合活性检测系统4、感光板12均通过数据线和数据采集器3相连接。
数据采集器3主体为x86兼容32位主机19，具有COM1接口20、COM2接口21和COM3接口22，显示面板2和数据采集器3的COM3端口22通过数据线相连接，光合活性检测系统4通过数据线与数据采集器3的COM1端口20相连接，感光板12和数据采集器3的COM2端口21通过数据线相连接。
光合活性检测系统4由溶氧探头14、遮光罩15、搅拌桨16、取样室17、冷光源18组成。取样室17的顶端设置溶氧探头14，通过密封的插口竖直插在取样室17的顶部，并通过数据线与数据采集器3的COM1端口20相连接。遮光罩15为不透光、隔热材料制成的圆柱形容器，取样室17为生物无害的玻璃材料制成的圆柱形容器，取样室17的侧外表面直接粘贴在遮光罩15的内表面上，位于遮光罩15的中段。搅拌桨16用无毒的生物相容性塑料制作，距取样室17的下表面5～10厘米处有冷光源18，用螺丝固定在遮光罩15的内壁底部。搅拌桨16设置在取样室17顶部正中，其叶片下缘距搅拌室17底部的距离为搅拌室17高度的1/3。
透射皿10水平固定在支架1上，为高度1厘米，直径3至5厘米的石英玻璃圆柱形容器，上下两表面的玻璃厚度不大于1毫米，外侧表面玻璃厚度不小于2毫米。入射光源9的镜头距透射皿10上表面3厘米。透射皿10正下方固定水平的感光板12，感光板12的上表面距透射皿10下表面3厘米。光线入射点、透射皿10上表面的中心点和感光板12的中心点位于同一直线上。
本发明固定安装好后，将样品入口5、样品出口6分别连接到外接的反应器罐体上，打开取样阀7、透射皿入口阀8和透射皿出口阀11，然后打开蠕动泵13，将培养液从反应器罐体内抽入取样室17和透射皿10，当培养液充满整个取样室17和透射皿10时，关闭取样阀7、透射皿入口阀8、透射皿出口阀11和蠕动泵13，打开入射光源9，数据采集器3首先从感光板12获得细胞浓度数据，并将此数据显示到显示面板2上。与此同时，取样室17内的溶解氧含量不断下降，数据采集器3将此信息反映到显示面板2上，约30分钟之后，取样室17内的氧气溶解量降低到接近零值，此时打开冷光源18，数据采集器3通过溶氧探头14开始采集取样室17内氧气溶解量上升速度信息，并将氧气的生成速度与细胞浓度的比值记录下来，同标准值相比，计算出细胞的存活率。此时一个测量周期结束，打开取样阀7、透射皿入口阀8和透射皿出口阀11，然后打开蠕动泵13，将系统内所有的培养液泵回外接的反应器，同时将取样室17和透射皿10内充满新一批的培养液，可进行下一个周期的测量。
用本发明监测7升光生物反应器灌注培养日本海带配子体细胞的细胞浓度和细胞存活率，灌注用培养基的氮浓度选择0.5935mmol/L，氮磷摩尔比选择16∶1，光强选择40μE/m2s。结果发现在20％的培养基更新率下，到培养至第36天时灌注培养的细胞浓度比接种时增长11.8倍，细胞存活率达到98.4％，一个数据点的测量仅耗时50分钟。
权利要求
1.一种陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统，包括支架(1)、显示面板(2)、数据采集器(3)、样品入口(5)、样品出口(6)、取样阀(7)、蠕动泵(13)，其特征在于，还包括光合活性检测系统(4)、透射皿入口阀(8)入射光源(9)、透射皿(10)、透射皿出口阀(11)、感光板(12)，其中样品入口(5)和样品出口(6)位于支架(1)外，其余的组件均位于支架(1)之内，样品入口(5)、取样阀(7)、光合活性检测系统(4)、透射皿入口阀(8)、透射皿(10)、透射皿出口阀(11)、蠕动泵(13)和样品出口(6)通过硅胶管道依次相连，透射皿(10)正上方垂直固定入射光源(9)，显示面板(2)和数据采集器(3)通过螺丝固定在支架(1)上，显示面板(2)、光合活性检测系统(4)、感光板(12)均通过数据线和数据采集器(3)相连接。
2.根据权利要求1所述的陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统，其特征是，数据采集器(3)主体为x86兼容32位主机(19)，具有COM1接口(20)、COM2接口(21)和COM3接口(22)，显示面板(2)和数据采集器(3)的COM3端口(22)通过数据线相连接，光合活性检测系统(4)通过数据线与数据采集器(3)的COM1端口(20)相连接，感光板(12)和数据采集器(3)的COM2端口(21)通过数据线相连接。
3.根据权利要求1所述的陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统，其特征是，光合活性检测系统(4)由溶氧探头(14)、遮光罩(15)、搅拌桨(16)、取样室(17)、冷光源(18)组成，取样室(17)的顶端设置溶氧探头(14)，通过密封的插口竖直插在取样室(17)的顶部，并通过数据线与数据采集器(3)的COM1端口(20)相连接，取样室(17)的侧外表面直接粘贴在遮光罩(15)的内表面上，位于遮光罩(15)的中段，冷光源(18)设置在取样室(17)的下表面，用螺丝固定在遮光罩(15)的内壁底部，搅拌桨(16)设置在取样室(17)顶部正中。
4.根据权利要求3所述的陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统，其特征是，遮光罩(15)为不透光、隔热材料制成的圆柱形容器，取样室(17)为生物无害的玻璃材料制成的圆柱形容器，距取样室(17)的下表面5～10厘米处设置冷光源(18)，搅拌桨(16)叶片下缘距搅拌室(17)底部的距离为搅拌室(17)高度的1/3。
5.根据权利要求1所述的陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统，其特征是，透射皿(10)为高度1厘米，直径3至5厘米的石英玻璃圆柱形容器，上下两表面的玻璃厚度小于或者等于1毫米，外侧表面玻璃厚度大于或者等于2毫米，透射皿(10)水平固定在支架(1)上，正上方垂直固定入射光源(9)，入射光源(9)的镜头距透射皿(10)上表面3厘米，透射皿(10)正下方固定水平的感光板(12)，感光板(12)的上表面距透射皿(10)下表面3厘米，光线入射点、透射皿(10)上表面的中心点和感光板(12)的中心点位于同一直线上。
全文摘要
一种陆生植物与海藻细胞反应器在线生物状态检测系统，包括支架、显示面板、数据采集器、光合活性检测系统、样品入口、样品出口、取样阀、透射皿入口阀、入射光源、透射皿、透射皿出口阀、感光板、蠕动泵。样品入口和样品出口位于支架外，其余的组件均位于支架之内，样品入口、取样阀、光合活性检测系统、透射皿入口阀、透射皿、透射皿出口阀、蠕动泵和样品出口通过硅胶管道依次相连，透射皿正上方垂直固定入射光源，显示面板和数据采集器固定在支架上，显示面板、光合活性检测系统、感光板均和数据采集器相连接。本发明将整个检测过程整合到一个系统中，高效快速，适合大规模工业化要求，可大大提高整个生产过程的自动化水平。
文档编号G01N27/409GK1632573SQ200410093429
公开日2005年6月29日 申请日期2004年12月23日 优先权日2004年12月23日
发明者赵锐, 齐瀚实, 陈思晔, 张宝红, 黄娜 申请人:上海交通大学