专利名称：用于维持器官和细胞生存能力的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于延长器官、组织和细胞的保存，特别是被捐献用于移植的器官保存的组合物，以及制造和使用它们的方法。
背景技术：
在医学领域内器官移植技术的进展使得对来自捐献者的活器官、组织和细胞的需求不断增加。由于对组织配型和血型匹配的严格要求，使捐献的来源受到限制，可以获得的心脏、肝脏、肺脏、肾脏等的供应一般来说远远少于等待移植以延长生命的病人的数量。因此，对有限的捐献器官供应的最适化仍然有不断的需要。在该技术领域内寻求的一种最大化捐献器官的可用性的方法是通过改进器官在捐献后的保存。
总的来说，目前的捐献器官保存方案不试图为与正常的血液供应分开的器官重新产生类似体内的生理状态。相反，它们利用低于体温的温度(低于20℃，典型为大约4℃)，储存在中等渗透压的类似晶体的溶液中。最常用的用于心脏保存的溶液是威斯康星大学溶液(UW)、St.Thomas溶液和斯坦福大学溶液(SU)。
这种和其它现有的保存已经与其正常的营养源例如活动物或人的血液循环分离开的器官的生存能力的方法，依赖于用支持性的溶液接触和/或灌注器官，这种支持性的溶液被设计成提供pH缓冲、渗透压平衡和/或一些最少的营养支持，例如以葡萄糖和有限的其它基本营养物的形式。这种方法一般与将器官的温度降低到刚刚高于水的凝固点的方法相结合。这是为了降低器官组织的代谢速度，从而减慢营养的消耗和废物的产生。这些本领域现有的保存溶液包括例如等渗的盐溶液，可以包含各种比例的盐、糖、渗透试剂、局部麻醉剂、缓冲液以及其它的试剂，仅为示例之目的，例如在Berdyaev等的美国专利No.5432053中描述的试剂，以及Belzer等在美国专利Nos.4798824、4879283和4873230中描述的ViaSpan_产品，Taylor的美国专利No.5405742、Dohi等的美国专利No.5565317、Stern等的美国专利No.5370989和5552267中描述的试剂。ViaSpan_产品数据单将该产品描述为无菌的、非热源的溶液，用于在低于体温下冲洗和保存器官。该溶液大约的计算渗透压是320mOsM，钠浓度为29mEq/L，钾浓度为125mEq/L，pH为7.4。
含有丙酮酸、支持细胞膜电势的无机盐和白蛋白或胎牛血清的保存溶液在美国专利No.5066578中有描述，而美国专利Nos.6495532和6004579中描述的器官保存配方中包括了一种或多种磷脂酸或糖，以及溶血磷脂酸或糖和增强剂例如白蛋白，任选以脂质体组合物形式输送。
以这种方式支持的储存在低于体温温度下的器官的储存和运输仍然受到时间的限制。由于捐献器官的持续短缺，在重新植入以前延长储存和运输的时间仍然是长期存在的需要。业已假设，造成重新植入前储存时间短的一个重要原因是在冷藏过程中发生的损坏，以及在用移植受体的血液保温和重新灌注的过程中发生的组织损伤。
已经提出可以通过使用脂质体组合物来解决这个问题，该配方中包含了多种磷脂以防止细胞或器官组织在储存中凋亡(程序化细胞死亡)，参见例如美国专利Nos.6004579和6495532中的描述。但是，这个提议没有产生所寻求的器官在储存中的生存能力和寿命的改善。它还具有一些缺点，包括不希望具有的组织摄入磷脂的水平。
可以容易地认识到，在本技术领域内仍然长期存在着对改善活器官、组织、甚至细胞的保存、以延长它们在体内和离体离开正常的循环系统支持后的存活时间的组合物和方法的需求，这些方法还可以与适当的氧载体相结合，以增强对组织和细胞生存能力的维护。
发明简述在一个方面，本发明提供了用于维持细胞生存能力的两相组合物。该组合物包括含有基本营养培养基的第一相，以及含有具有外部亲脂外壳和内部亲水核心的纳米微粒的第二相，其中a)第一相含有生理相容浓度/量的水溶性或可分散的营养物质，以及生理盐；b)第二相的纳米微粒含有下列物质中的一种或多种脂类、脂肪酸、甾醇、游离脂肪酸、还可以有细胞生长因子；以及c)两相组合物的渗透压至少为大约300mOsM/kg。
两相组合物的pH优选在大约7.2到大约7.4。其核心部分可以包含游离的脂肪酸例如油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和其组合。此外，亲水的内部核心可以含有溶液或悬浮液，其中含有能够结合和释放氧的部分例如血红素蛋白。另一方面，亲水的内部核心含有生物活性的部分例如药物或其它治疗试剂。优选情况下，本发明的组合物的渗透压高于正常体液的渗透压，例如优选为至少大约300、更优选的范围为大约385-425mOsM/kg。
在本发明的另一个方面，提供了三相的组合物，其中包含了上述成分(即两相组合物)，并与另外的含有纳米微粒的成分混合，纳米微粒具有外部亲脂的外壳和含有溶液或悬浮液的亲水的内部核心，溶液或悬浮液中含有能够结合和释放氧的部分例如血红素蛋白或生物活性部分。
在本发明的另一方面，提供了制备本文描述的两相和三相组合物的方法，以及离体保存或维持哺乳动物组织或哺乳动物器官的方法，这些组织或器官置于含有有效量的本文描述的组合物中。
发明详述因此，本发明提供了在体内，离体和/或体外保存/维持细胞、组织和器官的组合物，以及制造和使用这些组合物的方法。广义来说，本发明的组合物包含并掺入了脂质体和/或纳米微粒，它们被设计为包含支持性和/或保藏性的营养物，以及其它在非低于体温的温度范围、例如从大约20℃到大约37℃的范围内在体内和体外都能维持细胞、组织和/或器官的健康和生存能力的物质。本发明的组合物当然也可以在本领域常用的低于体温的温度范围内使用，这个温度范围可以是从低于20℃到大约4℃。不论被保存的器官/样品放置在什么温度下，本发明的组合物与现有技术相比都能够提供较好的结果。尽管当使用本发明的两相溶液时可以观察到这样的理想结果，当可选的氧载体作为组合物或优选的三相组合物的一部分被包括时，可以获得更有优势的结果。
在某些可选实施方案中，本发明的组合物带有氧载体，例如含有血红素部分的氧载体。在优选情况下，这是整合到脂质体和/或纳米微粒中的血红蛋白或血红蛋白衍生物。本领域已知的基于血红蛋白的氧载体的几个代表性的例子在美国专利Nos.5674528、5843024、5895810、5952470、5955581、6506725、6150507、6271351中有描述，每个公开在此引为参考。所包含的血红蛋白或氧载体的量被描述为能够有效达到预期治疗结果的量。它在某种程度上依赖于所选的组合物和技术人员的需要而变化，但是在大多数情况下，在最终的溶液中的存在量从大约0.01％到大约10％。
本发明还包括了在动物或人临床死亡发生之后，但是在所需器官或组织被取出用于捐献之前，处理或支持组织或器官的方法。任何需要渗透压和营养支持以最适化储存和运输的器官在体内和离体都可以得益于本发明的组合物。
通过灌注和/或与本发明的组合物接触而保存的器官和组织包括肾脏、肝脏、肺脏、心脏、心肺组合、胰脏、消化道的其它器官、血管、内分泌器官或组织、皮肤、骨骼，以及其它大量器官和组织，不一一例举。
本发明还包括了对需要这样的支持性治疗的活动物或人的治疗方法。因此，只作为示例的目的，本发明的组合物可用于对由外伤引起的急性失去正常血液循环的器官或组织提供局部的或全身性的循环或灌注支持，例如将本发明的组合物注入或暂时循环以支持部分切断的肢体，或者类似的情况，直到完成受损伤血管系统的外科修复。
本发明还包括了在外科手术过程中，例如在局部的血液循环被中断或损害的情况下，保存和保护完整组织和/或器官的方法。这样的情况包括例如组织或器官的灌注作为外科手术中需要中断局部或全身循环的部分步骤。本发明的组合物还考虑到了在由疾病或事故引起的解剖学上的损伤区域修复期间或之前的使用，例如在恢复循环系统完整性之前帮助保存完全或部分受损的手指或肢体。
也考虑到了本发明的组合物可用于研究领域中人和动物的细胞、组织和器官的保存，在这些研究中活的细胞、器官和其它培养技术对于基础和应用生物医学研究和/或需要在体外保存组织生存能力的诊断过程来说是必需的。
本文中使用的术语“器官”既包括实体器官例如肾脏、心脏、肝脏、肺脏，也包括器官的功能性部分例如皮肤节片、动脉节段、肝脏、肾脏、肺脏可移植的小叶等。本文使用的术语“组织”是指聚集形式的活的细胞材料，例如器官的一小部分，以及分散的细胞例如从心肌、肝脏或肾脏分散、分离和/或培养的细胞，包括骨髓细胞及子代细胞、造血干细胞及子代细胞，以及除非特别指出之外的其它各种已知的血液成分。
本文使用的术语“纳米微粒”被定义为双层的乳状微粒，优选具有亲脂性的外层和亲水性的核心，大小(平均直径)在大约100nm到大约300nm之间，更优选大小在大约100nm到大约200nm之间。
此外，为了描述的方便而使用的单数形式并没有任何限制的目的。因此，除非特别指明，为了简化说明而提到含有“纳米微粒”的成分包括了一个或多个这样的纳米微粒，例如具有足够的纳米微粒用于所需目的的制备物。
本发明的组合物概括地说，在本发明的大多数优选情况下，本发明的组合物包括两相水性的基本营养培养基和乳状微粒例如脂质体或纳米微粒。基本营养培养基包括各种成分的组合，包括从氨基酸、盐类、微量元素、维生素、简单的糖类等中选择的成分。这种基本营养培养基还可以添加一些成分的组合，可以包括溶解或分散在水性培养基中的缓冲液、抗氧化剂、血容量扩张剂、能量物质、黄嘌呤氧化酶抑组合物等。
因此，基本营养培养基含有许多营养物和矿物因子，其浓度类似血液、血清、血浆和/或正常身体组织中的浓度，尽管它们中的某些不是天然的血液成分。例如，缓冲液的存在代替了血液缓冲系统，葡聚糖和甘露糖提供了增加的渗透压，高于正常情况下由血液蛋白等提供的渗透压，谷胱甘肽是保护性试剂，肝素的存在使血液凝集最小化，Yeastolite提供了补充维生素。
在某些可选实施方案中，本发明的组合物还包括了一种或多种本领域现有的抗微生物试剂，例如抗生素、抗菌剂、特异性抗体和/或其它本领域现有的控制器官、组织和/或细胞中微生物污染的试剂。大多数本领域现有的抗微生物试剂在Goodman & Gilman’s的《治疗学的药物基础》(第十版)，McGraw Hill出版社出版，中有详细的引用，在此以其全文引为参考，特别注意第43-51章。
在某些附加的可选实施方案中，本发明的组合物还包括下列之一抗凝剂、血栓溶解剂和抗血小板药剂以防止在器官准备、储存和移植当中凝血或纤维蛋白形成，例如肝素和相关的葡糖胺聚糖、双香豆素、苯丙羟基香豆素、醋硝香豆素、双香豆素乙酸乙酯、二氢茚二酮及其衍生物、阿司匹林和双嘧哌胺醇等。非甾醇类的抗炎试剂也可以选择性包含在某些实施方案中，例如在据信炎症过程是缩短例如用于移植的器官、组织或细胞的储存寿命的病因的情况下。所有前述的试剂在Goodman & Gilman’s(同上)中有更详细的描述，在此引为参考。这些化合物被包含的量被描述为有效达到所需治疗结果的量。它在某种程度上依赖于所选的组合物和技术人员的需要而变化，但是在大多数情况下，在最终的溶液中的存在量从大约0.01％到大约10％。
本发明的组合物的第二相包括脂-水乳液，将例如脂类、脂肪酸、甾醇和可选的生长因子或其它被认为对活细胞包括血管内皮细胞的生存能力是必需的物质包含在微粒中，这些微粒具有亲脂性外层以便于通过细胞膜，和具有亲水性内层以便在细胞内递送。
有许多可以购买到的细胞或组织培养基产品，它们不含有未确定的蛋白或动物血清，可以被采用做基本营养培养基，或用做制备本发明的组合物的出发点，只要这些培养基与本发明组合物的特定要求相符就行。例如，本发明的组合物除了上面提到的基本细胞营养培养基外，优选具有下面的特点或元素能量物质以补充细胞内ATP能量库，并在灌注和保存过程中提供给有氧代谢；抗氧化剂和/或黄嘌呤氧化酶抑制剂以减轻由于游离的氧自由基引起的重新灌注的损伤。
“纳米微粒”脂乳液或脂质体由亲脂性的外层和亲水性的内核组成。它包括了脂类和/或甾醇外膜、基本的脂肪酸和亲水性的内核。亲水性的内核包括主要物质例如蛋白衍生的生长因子以及可选的其它物质，例如ATP等。
在某些可选实施方案中，这个内核可以被适当的氧载体所包括或替代，例如血红素蛋白或血红素蛋白的溶液或悬浮液，包括例如天然来源的血红素，经过可选的突变或化学修饰以在获得的器官和组织中具有更有效运输和释放氧气带走二氧化碳的氧饱和曲线的重组血红素和/或人造的水溶性血红素，对氧载体的类型略举数例。
具有优势的是，在最优选的实施方案中本发明的组合物不含动物血清或未确定的蛋白。
关于本发明的组合物可能如何起作用这方面并不打算受到任何理论或假说的束缚，据信一旦与被处理细胞的细胞膜相接触，疏水性的外层就与细胞膜融合，允许本发明的纳米微粒的亲水性内核被那些细胞吸纳到细胞质中，从而释放出增强生存能力的补充能量化合物和主要生长因子。此外还相信相对于正常体液的渗透压更高的渗透压可以减轻细胞的膨胀，便于保存血管细胞的完整性。
在优选实施方案中，基本营养培养基包括生理适合浓度的盐、水溶性维生素、氨基酸和核苷酸。简单举例，这些包括但不限于腺苷及其磷酸盐、尿苷及其磷酸盐、其它的核苷酸和脱氧核苷酸；B族维生素、例如B1、B2、B6、B12、生物素、肌醇、胆碱、叶酸等；维生素辅酶和辅助因子，例如烟酰胺和黄素腺嘌呤二核苷酸以及它们相应的磷酸盐、辅酶A等；各种生理盐类和微量矿物盐，例如钠、钾、镁、钙、铜、锌和铁盐；基本氨基酸，尽管所有20种天然氨基酸以及/或其衍生物都是可选择包括的。基本营养培养基还包括例如pH缓冲液，例如磷酸缓冲液和N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(“HEPES”)缓冲液；简单的糖例如葡萄糖；渗透压增强剂，例如任何适合的葡聚糖、甘露糖等；以及可选择的各种各样的成分，例如别嘌呤醇、软骨素、辅羧酶、生理有机酸例如丙酮酸，以及可选的从自然来源的营养提取物，例如酵母维生素提取物。
在另一个实施方案中，维生素C(抗坏血酸)可以浓度为生理浓度或略高于生理浓度选择性包含在培养基中。
组合物的第二相是脂-水乳液，含有具有亲脂外层和亲水核心的脂质体或纳米级的微粒。一般来说，第二相包括能够形成和稳定亲脂外层的亲脂成分，包括例如胆固醇、磷脂酰胆碱、维生素E、鳕鱼肝油等。其它的成分包括基于脂类的能源，包括生理相容量的游离脂肪酸例如亚油酸、亚麻酸、油酸和功能等价物。
在另一个优选实施方案中，第二相还包括亲水性的支持性内分泌因子，例如氢化可的松、甲状腺素或其衍生物等。其它的支持性成分可以包括例如细胞生长因子如上皮和内皮生长因子，包括生理相容量的血管内皮生长因子，血小板衍生的内皮生长因子、上皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生的内皮生长因子等。此外，可选的其它被考虑包括在第二相中的因子包括细胞间信使例如前列腺素，例如前列腺素E1。优选情况下，也可以包括生理相容的表面活性剂和去污剂，例如一种或多种水溶性的表面活性剂，优选为分子量为几千道尔顿的两亲性嵌段共聚物，例如聚环氧丙烷-聚环氧乙烷嵌段共聚物表面活性剂(例如Pluronic F-68，来自BASF)和/或非离子性表面活性剂。适合的非离子性表面活性剂包括例如山梨糖醇酯的聚氧乙烯衍生物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯表面活性剂，商品名为TWEEN_(Atlas化学公司)。TWEEN 80_是特别优选的。本发明的两相组合物的核心部分优选不包含药物学上显著量的磷脂酸或糖，或溶血磷脂酸或糖。
本发明组合物的制备本发明的组合物一般通过一个两步的工艺来生产。第一步是准备被用做最终产物的建造嵌段的必需成分的特定组合。第一步的一个关键部分是制备第一相的预混料，也就是上面描述的基本营养培养基，在本文中命名为预混料I。该第一步的终结部分是制备第二相的预混料，在本文中命名为预混料II，其中所需的成分被预先混合、溶解和/或悬浮在水中。预混料II组合物然后通过微射流装置或类似这样的设备，在能够有效地提供精细分离的乳液例如纳米微粒级乳液的条件下进行加工，其中的纳米微粒具有前面提到的从大约100nm到大约200nm的平均直径。然后将在预混料II的基础上产生的乳液组合物与提供了各种微量营养物的预混料I以及其它成分混合，以完成本发明的组合物的生产。
预混合组合物的制备配方1下面的表1-4概述了在一个优选实施方案中发现的一些优选组分和组分的重量范围，含有在此命名为预混料I的第一相和含有由预混料II制成的纳米微粒的第二相。表中列出的成分是在所有加工完成后在1升最终组合物中发现的优选的量。在这些表中对成分进行分组是为了描述的方便，以便将成分按照在本文后面讨论的实施例中制备器官保存组合物的方式来分组。除非特别指明，在下面表中显示的所有量都是每升最终组合物中的克数，最终组合物是指包括了水相和乳相的组合物。
表1克/单位/升化学物描述范围
表2A克/单位/升化学物描述范围
表2B克/单位/升化学物描述 范围
表2C克/单位/升化学物描述 范围
表3克/单位/升化学物描述范围
表4克/单位/升化学物描述 范围
表1-4陈述的成分的量是以总体积1升为基础的。在这里举例的1升批体积是在预混料I和预混料II混合后、预混料II已经加工成微米级或纳米级乳液后的终体积。技术人员将认识到描述的工艺可以根据需要容易地放大或缩小以适应较小的或较大的批次规模。
在制备本发明的组合物中使用的所有化学物质都是基本上纯的，可以从大量的生物化学试剂供应商获得。优选情况下，它们是USP级或相当级别的。技术人员将认识到所用的化学物质可以选择性地用被证实具有同样纯度和活性的基本上相当的化学物质代替。
表5分析天平； 顶部加样的大天平；磁力搅拌板； 各种混合容器；WFI级水*；吸管和其它标准实验室器具；以及微射流加工装置，型号HC-5000-Microfluidics公司*注射用水，优选为USP级。
其它各种各样的试剂包括5N NaOH和5N HCl，用于pH滴定，以及95％纯度的乙醇。
制造预混料I的方法预混料I是通过以能够有效产生均一透亮的水性组合物、同时避免不需要的反应或不溶性复合物形成的次序将成分溶解或分散而制备的。出于这个原因，预混料I的成分在优选情况下直到所有的成分都完全溶解或分散在水中才混合到一起。在优选情况下，象本文举例的那样，列在表1、2A-2C和表3中的成分分别被加工成3种不同的起始溶液，尽管技术人员将会意识到这些基本成分可以通过对示例的方案进行改变而选择性地制备。基于单独的表1、2A-2C和表3成分的起始溶液然后被混合制备成预混料I，它构成了非乳液的基本营养培养基。
制造预混料II的方法预混料II包括了本发明组合物中形成乳液的成分。概括来说，它们包括了获得的乳液微粒的亲水层，例如希望将其释放到将按照本发明进行处理的器官、组织或细胞的细胞内的成分。预混料II也包括了形成获得的乳液微粒的亲脂层的成分，例如允许与活细胞膜融合释放出亲水核心内含物的亲脂性外层，亲水核心内含物包括了支持性的内分泌因子、帮助乳化的适当试剂、例如润湿剂和/或嵌段共聚物去污剂、以及疏水相成分，例如胆固醇和/或含磷的脂类。在优选情况下，它们被列于上面的表4中，按照下面实施例的描述混合。
II、微射流压力为5000psi或以上的高压匀浆技术在本领域中被称为“微射流”。该工艺被用来制造具有均匀的大小分布的脂质体或纳米微粒，平均直径优选从大约100nm到大约300nm，更优选为从大约100nm到大约200nm。在本发明的另一方面，微粒的平均直径小于200nm。除了微射流，其它的标准乳化方法也可以选择使用，例如超声、阀匀浆(Thornberg，E.和Lundh，G.(1978)J.Food Sci.431553)和刀片搅拌等。合意的是，将水溶性的表面活性剂，优选为分子量为几千道尔顿的两亲性嵌段共聚物，例如聚环氧丙烷-聚环氧乙烷嵌段共聚物表面活性剂(例如Pluronic F-68，可以从BASF购买)和/或TWEEN 80，加入到水性溶液中，以便稳定包被的微粒，防止它们在形成时聚集。如果使用超声方法的话，表面活性剂也可以增强超声的效果。
本文举例的用于微射流的优选装置是微射流器No.HC5000V(Microfluidics Corp.，Newton，Massachusetts)，使用由密封的空气压缩机例如来自Sullair Solutions(Michigan City，Indiana)的No.ES-6供应的压缩空气。上述的装置利用高压和高剪切力的匀浆作用处理和乳化预混料II成分，提供所需大小范围内的纳米微粒。
简单来说，预混料II成分使用微射流器通过高压匀浆作用进行处理。预混料II以连续的方式被加入到微射流器的贮备池中，被迫通过特定设计的空化或相互作用腔，在其中通过高剪切压力和空化力形成高度分散的乳液。通过多个循环，平均液滴或脂质体大小、分布以及成分的组合产生了所需的最终产物，例如优选的纳米微粒。
微射流器No.HC5000V操作的其它详细情况在制造商的操作手册中提供，可以从Microfluidics Corporation获得，目录号85.0112，在此以其全文引为参考。
本发明的第二个配方(配方2)是基于在下面表6-10中发现的物质。制备它们的指南在下面和实施例中提供。
表6
表6的制备说明1、称量1并混合溶解在WFI水中2、称量2并溶解在95％乙醇中3、在WFI水中制备1000X浓度的成分34、将第一组和第二组混合，向该溶液中每升最终批体积加入1ml第三组溶液表7A
表7B
表7的制备说明1、称量所有的化学物质，混合溶解在WFI水中。
2、加入到表6的溶液中。
表7C
表8的制备说明1、称量所有的化学物质，混合溶解在WFI水中。
2、加入到表6的溶液中。
表8
表8的制备说明1、称量第一组，溶解在少量5NAOH和WFI水中2、称量其余的成分，混合溶解在WFI水中3、将第一组加入到第二步的溶液中，混合4、将该溶液加入到表6的溶液中表9
表9的制备说明1、按照与前面描述的用于配方I预混料II相同的微射流步骤处理表9中的成分。
2、混合加入到表6的溶液中。
表10
表10的制备说明1、称量化学物质，在WFI水中溶解直到完全溶解。
2、将溶液加入到表6的溶液中。
3、用WFI水添加到最终批体积，混合用5N NaOH或5N HCl将pH调整到7.0-7.2。
实施例下面的实施例用于提供对本发明的进一步评判。这些实施例不意味着以任何方式限制本发明的有效范围。在每种制备溶液的情况下，包含的每种成分的量是所引用的相应表中范围的中点。
实施例1预混料I的制备溶液1的制备使用适当的天平制备上面表1中列出的每种成分的10000X浓溶液(使用所显示范围的中点)。每种包含的成分的量是表中表示范围的中点。为方便起见，预先制备了如下几种这些成分的储存液，然后将适当量的储存溶液混合成溶液I。
100000X浓度的硫酸铜储存溶液称出0.130克硫酸铜，在1000ml WFI级水中混合。如果需要，混合滴加5N HCl直到完全溶解。混合直到溶解，储存在-20℃。
10000X浓度的硫酸铁、硝酸铁和硫酸锌储存溶液储存溶液通过称出5.0克硫酸铁、0.5克硝酸铁和4.3克硫酸锌，加入到1000ml WFI级水中制成。如果需要降低pH以帮助溶解，可以通过滴加5N HCl直到完全溶解。溶液储存在-20℃。每升批量(最终产品的终体积)使用0.1ml。
100000X浓度的生物素储存溶液生物素储存溶液通过称出0.040克生物素到5ml WFI级水中制成。如果需要，边混合边滴加5N HCl直到完全溶解。定量到1000ml，储存在-20℃。最终溶液中每升使用0.01ml。
1000X的维生素B-12和胸苷储存溶液储存溶液通过称出0.670克维生素B-12和0.370克胸苷到10000mlWFI级水中制成，混合直到完全溶解，储存在-20℃。最终溶液中每升使用1ml。
一旦制备了所有的储存浓溶液，将它们以与其浓度相应的体积加入到溶液2中，例如1000x＝1ml/L等。然后将其它成分加到1000ml WFI级水中，在磁力搅拌板上混合直到完全溶解。得到的溶液如下所述以每升最终批体积(最终产品)0.1ml的比例加入到溶液2中。
溶液2的制备使用适当的天平称出表2A、2B和2C中列出的每种成分(使用所显示范围的中点)，加入到大约50％最终批体积量的WFI级水中，”对于1升最终批体积来说，溶液2被制备到大约500mlWFI级水中。将其混合直到完全溶解。
溶液3的制备使用适当的天平称出表3中列出的每种成分(使用所显示范围的中点)，加入到含有大约5％总批体积量的WFI级水的适当大小的混合容器中。在混合时滴加5N NaOH，直到混合物变得澄清，表明溶解完全。
然后制备预混料I取溶液I，以每升最终批体积(最终产品)0.1ml的比例与溶液2混合，形成混合的(1+2)溶液。然后将全批的溶液3与(1+2)溶液混合产生预混料I，它可以立即使用，也可以储存起来。
实施例2预混料II的制备预混料II成分的量使用前面表4中显示范围的中点。为方便起见，预先制备了几种预混料II成分的储存液，然后使用适当的体积制备成预混料II。储存溶液如下。
10000X的内分泌因子储存溶液该储存溶液的制备通过称出0.052克HGF、0.050克三碘-L-甲状腺素、0.050克VEGF以及0.030克EGF到1000ml WFI级水中，混合直到完全溶解。批体积按照X 0.1ml来计算，在第四步/处理4中加入到溶液中。储存在-20℃。最终溶液中每升使用0.1ml。
1000X的氢化可的松储存溶液该储存溶液的制备通过称出0.95克氢化可的松到10ml 95％乙醇中，混合直到完全溶解。批体积按照X 1ml来计算，在下面的第二步中加入到溶液中。储存在2-8℃。最终溶液中每升使用1ml。
1000X的前列腺素E1储存溶液(“PGE1”)制备通过称出0.034克PGE1到1000ml WFI级水中，混合直到完全溶解。批体积按照X 1ml来计算，在下面的第四步中加入到溶液中。储存在-20℃。最终溶液中每升使用1ml。
100000X的PDGF储存溶液该储存溶液的制备通过称出0.095克PDGF到1000ml WFI级水中，混合直到完全溶解。批体积按照X 0.01ml来计算，在下面的第四步中加入到溶液中。储存在-20℃。最终溶液中每升使用0.01ml。
然后通过下述步骤用成分制备成预混料II(按照前面表4中显示的范围的中点计算)(1)Pluronic F-68溶液的制备是通过称出1克Pluronic F-68，加入到少于50％总批体积的(对于1升最终产品的批量，就是少于500ml)WFI级水中。将它在低热(低于100℃)下混合大约1小时。混合持续到完全溶解。得到的水性组合物在使用前冷却到大约35-40℃。
(2)量出10ml 95％乙醇，加到玻璃混合容器中，放置在磁力搅拌板上。按照表4(取范围的中点)称出磷脂酰胆碱，加入到该溶液中，然后混合1小时。
(3)按照表4显示的范围的中点称量胆固醇、亚油酸、亚麻酸、维生素E、TWEEN 80、鳕鱼肝油、氢化可的松和油酸。优选情况下，它们可以首先被制备成10000X的浓溶液或储存溶液以达到所需的工作浓度。将它们加入到步骤2的溶液中，混合1小时。
(4)将步骤2和3的溶液加入到步骤1的溶液中，混合1小时。得到的组合物表现为不透明和云雾状。
(5)按照指示范围的中点称出肝细胞生长因子(“HGF”)、三碘-L-甲状腺素、前列腺素E1、血管内皮生长因子(“VEGF”)、上皮生长因子(“EGF”)、血小板衍生的内皮生长因子(“PDGF”)。在优选情况下，它们被制备成这些化学物质的工作储存溶液。
(6)步骤5的成分加入到第4步的溶液中，混合1小时，产生预混料II液态组合物。
实施例3配方I通过微射流形成基于胆固醇的纳米微粒从前面实施例1和2中的预混料I和预混料II组合物如下制备配方I。
(1)打开空气压缩机，将线压力调整到120PSI@100CFM。这将自动用压缩空气填充微射流器的压力仓。
(2)将微射流器的压力调整到5000PSI。
(3)将实施例2中制备的预混料II加到机器的储存槽中，将微射流器的控制转到全开的设置。
(4)将预混料II通过活化空化仓，排进收集容器中。
(5)当所有的预混料II被处理和收集后，一个循环完成。
(6)重复步骤(1)-(5)四次，并且/或直到流进收集容器的处理的液体组合物具有澄清的表观。
(7)然后将液体组合物然后通过0.2微米的膜过滤器进行除菌过滤，在使用前储存在4-8℃。
(8)然后将上面步骤(7)的产品与前面实施例1中制备的预混料I缓慢混合，以避免产生泡沫和化学成分的分解。预混料的最终配比是大约1∶1。
(9)用WFI级水将最终的溶液定容到所需的批体积，基于表1-4，最终批体积是1升，pH被调整到7.2+/-0.2。
然后将最终的本发明的组合物通过0.2微米的膜除菌过滤到无菌的容器中保存。它的表观是不含任何颗粒物质的不透明的乳白溶液。囊泡的大小对纳米微粒分散相的光学外观有极大的影响。微粒越小，溶液的外观越透明。
实施例4与VIASPAN_的器官保存比较相对于以前的“金标”VIASPAN_(Barr Laboratories，Inc.)的保存性质，实施例3中制备的配方I对于肾脏保存的效果被证实并进行了评估。
材料和方法对一个1-2周岁之间的远系繁殖的雄性猎狗进行双侧肾脏切除手术，然后在通常的麻醉状态下立即进行安乐死。
左侧肾脏用VIASPAN_冲洗，右侧肾脏用配方I冲洗。每个肾脏被冲洗到流出的液体透明，是100％的冲洗溶液，并且没有血液或其它废物的痕迹为止。每个肾脏用每公斤重量50ml的溶液冲洗。在用溶液冲洗之后，马上对每个分别的肾脏进行活组织检查。所有的活组织检查都取肾脏外皮质中具有较大曲率的楔形物。
然后将每个肾脏放置在含有与冲洗使用的相同溶液(VIASPAN_或配方I)的容器中。每个容器被放置在冷冻盒中，只在活组织检查时才打开。
随后的活组织检查在浸泡到VIASPAN_或本发明的研究溶液后1、4、8和24小时时进行。保存在10％福尔马林中的肾脏的活组织切片被送到Charles River实验室公司的病理学联合分部进行组织病理学评估。
结果不同时间点的活组织切片的显微镜评估的结果显示在如下的表6中
表6肾脏活组织切片的组织病理学评估
所有的活组织样品都由肾皮质衍生的组织组成。此外，在右肾的8和24小时活组织样品中出现了中等程度的灌注造成的人为现象，例如Bowman’s空间和肾小管膨胀。右肾4小时的活组织样品中也出现了灌注造成的人为现象，但是不如前述的来自同样肾脏的样品那样严重。在某些活组织样品中注意到的小量的退化和炎症变化是无关紧要的。在左肾4和8小时的样品中肾小囊中出现了小量急性炎症。
概述对于来自两个肾的样品来说，从本底到1小时的样品保存是相同的。对于4、8和24小时时间点来说，从右肾(用本发明的组合物保存)取得的活组织样品保存得更好。
实施例5使用预混料I的配方II的制备溶液1的制备称取抗坏血酸、过氧化氢酶、SOD、L-半胱氨酸、牛磺酸和甲硫氨酸，混合溶解在WFI水中。接下来，将维生素E和巯基乙醇溶解在95％乙醇中。制备1000X浓度的成分硫酸锌、硒和硫酸铜溶液。将前两组物质混合，向该溶液中每升最终批体积中加入1ml浓溶液。在溶液中加入每升25克葡聚糖70和HAS。每种使用的成分按照表6种列出的范围的中点计算。
溶液2的制备使用适当的天平，称量出表7A、7B和7C中列出的每种成分(按照显示范围的中点计算)，按照在相应表下面发现的说明进行混合。
溶液3的制备使用适当的天平，称量出表8中列出的每种成分(使用显示范围的中点)，按照在表下面发现的说明进行混合。
然后制备预混料I取溶液I，以每升最终批体积(最终产品)0.1ml的比例与溶液2混合，形成混合的(1+2)溶液。然后将全批的溶液3与(1+2)溶液混合产生预混料I。
实施例6预混料II的制备重复实施例2的过程，只是用表9中的成分代替表4中的成分。
实施例7配方II通过微射流形成基于胆固醇的纳米微粒配方II按照实施例3中的方法从上面实施例4-6中的预混料I和预混料II组合物制备。
实施例8对使用配方II进行肾脏保存的评估在本研究中，实施例7中的溶液(组合物)、在此命名为配方II，与VIASPAN在2-8℃的静态的保存环境中，使用新鲜的羊肾比较了在收获后的+/-时间中的局部缺血性损伤。从新鲜屠宰的羊取出肾脏，马上放置在冰上。回到实验室后，将它们无菌解剖，除去所有的脂肪组织，分离出肾动脉。两个肾脏在0时称重。肾脏在颜色、质地和密度方面表现正常。每个肾脏被冲洗直到流出的液体透明，是100％的冲洗溶液，并且没有血液或其它废物的痕迹为止。在用溶液冲洗之后，马上对每个分别的肾脏进行活组织检查(T＝0)。所有的活组织检查都取肾脏外皮质中具有较大曲率的楔形物。然后将每个肾脏(A和B)放置在含有与冲洗使用的相同溶液(VIASPAN(肾脏A)或配方II(肾脏B))的容器中。每个容器被放置在冷冻盒中，只在活组织检查时才打开。随后的活组织检查在浸泡到VIASPAN_或本发明的研究溶液后12、24、36、48、60、72和96小时时进行。在进行组织病理学评估前，肾脏的活组织切片被保存在10％福尔马林中。
结果在两个肾脏之间有明显的组织学差异。在VIASPAN处理的肾脏中，保存后12-96小时逐渐出现了自溶性变化(由赖氨酸引起的细胞破坏)。用本发明的配方II处理的肾脏直到保存后36小时才出现组织学变化。从前面的描述可以看出，本发明的溶液与在低于体温的保存技术中的现有工艺相比，提供了显著的优点。
实施例9配方III.含有血红素的纳米微粒无基质的血红蛋白从商业来源获得或从密集红细胞使用现有的方法分离，例如美国专利No.5674528中描述的方法，在此引为参考，标定到50％的浓度(w/v)。
在200ml无基质的血红蛋白中加入β-NAD(1mM，133mg)，D-葡萄糖(100mM，3.6g)、ATP-Na(1mM，110mg)、六水氯化镁(1mM，40mg)、磷酸氢二钾(9mM，247mg)、磷酸氢二钠(11mM，310mg)和肌醇六磷酸(3mM，396mg)，将混合物搅拌直到试剂完全混合形成补充血红蛋白溶液。
将具有90％氢化率的纯化的磷脂酰胆碱、胆固醇、肉豆蔻酸和维生素E按照7∶7∶2∶0.28的摩尔比例混合，取45克混合均匀的粉末加入到45ml WFI水中，将混合物加热到从60℃到大约80℃的范围内以进行膨胀。将前面的补充血红蛋白溶液加入到获得的脂类物质中，将混合物搅拌15秒。获得的脂-SFH混合溶液用微射流器5000(Microfluidics Co.)进行处理，处理在冰浴中进行，压力为12000psi。
获得的包封的血红蛋白与盐水和葡聚糖溶液(3％w/v)混合，得到的悬浮液在4℃下于10000rpm(13000g)离心30分钟。然后回收带有包封的血红蛋白的脂质体或纳米微粒。通过倾析或抽吸将含有残余的游离的未包封的血红蛋白和/或残余的起始脂类成分的上清液除去。重复上述的清洗过程，直到看不到游离的血红蛋白为止。得到的产品通过膜过滤器过滤，孔径大小从0.2到0.45微米，视所需的产品微粒的大小范围而定。滤液被浓缩，例如通过中空纤维类型的浓缩透析器进行超滤，产生600ml纯化的包封了血红蛋白的脂质体或纳米微粒悬浮液，血红蛋白的浓度为大约5％(w/v)。
获得的脂质体或纳米微粒与预混料I进行混合，以大约10份到大约500份乳液与预混料I混合成1000份的总体积的比例以提供配方III。
然后将配方III以所需的比例与配方I混合，提供具有携带氧功能的器官保存组合物。
实施例10细胞培养基在本实施例中，测试了被命名为配方I的实施例3中的组合物，以证明它作为细胞培养基的能力。人类肾脏细胞被放置在含有足够量配方I的容器中，使用这种材料作为细胞培养基在4℃和37℃验证细胞的生长和生存能力。72小时后，证实了活的细胞可以生长出健康的细胞种群，显示出正常的形态和生存能力。
所有前述的美国专利和出版的文件的内容在此引为参考。
权利要求
1.用于维持细胞生存能力的两相组合物，含有含有基本营养培养基的第一相；以及含有包含了外部亲脂外壳和内部亲水核心的纳米微粒的第二相，其中a)第一相含有生理相容浓度的水溶性或可分散的营养物，以及生理盐类；b)第二相的纳米微粒含有脂类、脂肪酸、甾醇和游离脂肪酸；以及c)两相组合物的渗透压至少为大约300mOsM/kg。
2.权利要求1的两相组合物，其中的两相组合物具有范围从大约385-425mOsM/kg的渗透压。
3.权利要求1的两相组合物，其中的两相组合物的pH从大约7.2到大约7.4。
4.权利要求1的两相组合物，其中的纳米微粒的平均直径从大约100nm到大约300nm。
5.权利要求4的两相组合物，其中的纳米微粒的平均直径从大约100nm到大约200nm。
6.权利要求1的两相组合物，还含有细胞生长因子。
7.权利要求6的两相组合物，其中该细胞生长因子从下面的组中选择上皮和内皮生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生的内皮生长因子、上皮生长因子、肝细胞生长因子，以及它们的混合物。权利要求1的两相组合物是配方I。
8.权利要求1的两相组合物，含有大约等量的第一相和第二相。
9.权利要求1的两相组合物，其中的核心含有从下列组中选择的游离脂肪酸油酸、亚油酸、棕榈酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、月桂酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和其组合。
10.权利要求1的两相组合物，其中的纳米微粒的颗粒大小为大约100nm到大约200nm。
11.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
12.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
13.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
14.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
15.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
16.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
17.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
18.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
19.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
20.权利要求1的两相组合物，含有克/单位/升范围
21.权利要求1的两相组合物，含有
22.权利要求1的两相组合物，含有
23.权利要求1的两相组合物，其中该亲水内核含有的溶液或悬浮液包括能够结合和释放氧的部分。
24.权利要求10的两相组合物，其中能够结合和释放氧的部分是血红素蛋白。
25.权利要求1的两相组合物，其中该亲水内核含有生物活性部分。
26.权利要求25的两相组合物，其中的该生物活性部分从下面的组中选择化学治疗试剂、蛋白、肽、多肽、酶及其混合物。
27.权利要求25的两相组合物，其中的该生物活性部分是ranpirnase。
26.三相组合物，包含与含有纳米微粒的成分混合的权利要求1的两相组合物，该纳米微粒具有外部亲脂的外壳和内部亲水的核心，所述核心包含的溶液或悬浮液含有能够结合和释放氧的部分。
27.权利要求26的三相组合物，其中能够结合和释放氧的部分是血红素蛋白。
28.包含与含有纳米微粒的成分混合的权利要求1的组合物的三相组合物，该纳米微粒具有外部亲脂的外壳和含有生物活性部分的亲水的内部核心。
29.制备权利要求1的两相组合物的方法，包括在足够使最终制备的两相组合物具有至少大约300mOsM/kg渗透压的条件下将液态的第一相和液态的第二相组合，其中第一相包含的基本营养培养基含有生理相容浓度的水溶性或可分散的营养物和生理盐类，第二相包含的纳米微粒含有外部亲脂外壳和内部亲水核心。
30.保存哺乳动物细胞或组织的方法，包括将该细胞或组织放置在足够量的权利要求1的组合物中。
31.离体保存哺乳动物器官的方法，包括将器官放置在有效量的权利要求1的组合物中。
32.权利要求31的方法，其中该器官从下面的组中选择肾脏、心脏、肝脏、肺脏、皮肤、动脉及其功能性部分。
全文摘要
本发明涉及纳米微粒成分，当器官、组织和细胞与正常的生理支持分开时用于维持它们的生存能力。此外还公开了含有纳米微粒成分的组合物以及在体内和离体保存器官例如肾脏的方法。
文档编号G01N33/50GK1784142SQ200480012571
公开日2006年6月7日 申请日期2004年5月7日 优先权日2003年5月9日
发明者约瑟夫·费希尔, 简·贝克, 罗伯特·G·L·绍尔 申请人:生命血液医学公司