专利名称：治疗和预防运动引起的心律失常的化合物和方法
相关申请本申请是2003年6月26日提交的美国专利申请系列第10/608,723号的部分继续申请，第10/608,723号专利申请是2002年11月5日提交的美国专利申请系列第10/288,606号的部分继续申请，第10/288,606号专利申请是2000年5月10日提交的美国专利申请系列第09/568,474号的继续申请，第09/568,474号专利申请即2002年12月3日颁发的现在的美国专利第6,489,125B1，在此通过引用将它们的内容并入本文。
政府利益的声明本发明是用以NIH资助No.PO1HL 67849-01的名义的政府支持完成的。因此，美国政府对本发明拥一定的权利。
背景技术：
在世界范围内，心力衰竭是死亡率和发病率的主要原因。在心力衰竭更严重的病例(纽约心脏协会第IV级)中，2年死亡率超过50％(Braunwald，E.B.，Heart Disease，第4版，(费城W.B.Saunders Co.，1992))。心律失常(心力衰竭的共同特征)导致了与该疾病相关的很多人死亡。尤其是，所有心脏病患者中大约50％死于致死性心律失常。心脏中的某些室性心律失常是迅速致死的——被称作“心源性猝死”(SCD)现象。然而，致死性室性心律失常也可发生在年轻、其他方面都健康的个体当中，他们不知道患有结构性心脏病。事实上，室性心律失常是其他方面都健康的个体猝死的最常见的原因。
儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)是心脏结构正常的个体的遗传性疾病。它以应激诱导的室性心动过速——一种可导致心源性猝死的致死性心律失常为特征。在CPVT患者中，身体劳累和/或应激诱发双向性和/或多形性室性心动过速，它在没有可检测的结构性心脏病的情况下导致SCD(Laitinen等人，Mutations of the cardiacryanodine receptor(RyR2)gene in familial polymorphic ventriculartachycardia.Circulation，103485-90，2001；Leenhardt等人，Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in childrena7-year follow-up of 21 patients.Circulation，911512-19，1995；Priori等人，Clinical and molecular characterization of patients withcatecholaminergic polymorphic ventricular tachyacardia.Circulation，10669-74，2002；Priori等人，Mutations in the cardiac ryanodinereceptor gene(hRyR2)underlie catecholaminergic polymorphicventricular tachyacardia.Circulation，103196-200，2001；Swan等人，Arrhythmic disorder mapped to chromosome lq42-q43 causesmalignant polymorphic ventricular tachycardia in structurallynormal hearts.J.Am.Coll.Cardiol.，342035-42，1999)。CPVT主要以常染色体显性方式遗传。CPVT患者在运动时具有室性心律失常，而休息时则不会出现心律失常。在CPVT患者中，染色体lq42-q43上的连锁研究和直接测序法已经证实了人类RyR2基因中的突变(Laitinen等人，Mutations of the cardiac ryanodine receptor(RyR2)gene infamilial polymorphic ventricular tachycardia.Circulation，103485-90，2001；Priori等人，Mutations in the cardiac ryanodine receptor gene(hRyR2)underlie catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia.Circulation，103196-200，2001；Swan等人，Arrhythmicdisorder mapped to chromosome lq42-q43 causes malignantpolymorphic ventricular tachycardia in structurally normal hearts.J.Am.Coll.Cardiol.，342035-42，1999)。
心力衰竭以心肌收缩功能的进行性下降为特征，这导致了重要器官血流灌注不足。心肌和其它横纹肌的收缩开始于钙(Ca2+)从肌质网(SR)释放到周围细胞质中时。兴奋-收缩(EC)偶联(即动作电位与肌细胞收缩的偶联)需要SR上的钙释放通道，包括里安娜碱受体(RyRs)。里安娜碱受体有三种类型，它们都是高度相关的Ca2+通道RyR1、RyR2和RyR3。RyR1发现于骨骼肌中，RyR2发现于心脏中，RyR3位于脑中。2型里安娜碱受体(RyR2)是心脏横纹肌中EC偶联和肌肉收缩所需的主要Ca2+-释放通道。
RyR2通道在SR的特化区域中被堆积为密集排布，该区域释放细胞内堆积的Ca2+，从而引发肌肉收缩(Marx等人，Coupled gatingbetween individual skeletal muscle Ca2+release channels(ryanodinereceptors).Science，281818-21，1998)。在EC偶联期间，心肌细胞膜在动作电位的零相去极化，激活电压门控Ca2+通道。依次地，在被称为Ca2+-诱导的Ca2+释放过程中，通过这些通道的Ca2+内流启动了Ca2+经由RyR2从SR的释放(Fabiato，A.，Calcium-induced release ofcalcium from the cardiac sarcoplasmic reticulum.Am.J.Physiol.，245C1-C14，1983；Nabauer等人，Regulation of calcium release is gated bycalcium current，not gating charge，in cardiac myocytes.Science，244800-03，1989)。RyR2-介导的、Ca2+-诱导的Ca2+释放然后激活收缩蛋白，该收缩蛋白负责心肌收缩。
RyR2是一种蛋白复合物，包括4个565,000道尔顿的RyR2多肽，缔合4个12,000道尔顿的FK506结合蛋白(FKBPs)，尤其是FKBP12.6蛋白。FKBP是广泛表达的顺式-反式肽酰-脯氨酰异构酶，执行多种细胞功能(Marks，A.R.，Cellular functions of immunophilins.Physiol.Rev.，76631-49，1996)。FKBP12蛋白与以下受体紧密结合，并调节其功能骨骼里安娜碱受体，RyR1(Brillantes等人，Stabilization of calcium release channel(ryanodine receptor)functionby FK506-binding protein.Cell，77513-23，1994；Jayaraman等人，FK506 binding protein associated with the calcium release channel(ryanodine receptor).J.Biol.Chem.，2679474-77，1992)；心脏里安娜碱受体，RyR2(Kaftan等人，Effects of rapamycin on ryanodinereceptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle.Circ.Res.，78990-97，1996)；相关的细胞内Ca2+-释放通道，被称为1型肌醇1，4，5-三磷酸受体(IP3R1)(Cameron等人，FKBP12binds the inositol1，4，5-trisphosphate receptor at leucine-proline(1400-1401)andanchors calcineurin to this FK506-like domain.J.Biol.Chem.，27227582-88，1997)；以及I型转化生长因子β(TGFβ)受体(TβRI)(Chen等人，Mechanism of TGFbeta receptor inhibition by FKBP 12.EMBOJ，163866-76，1997)。FKBP 12.6与RyR2通道结合(每个RyR2亚基1个分子)，稳定RyR2-通道功能(Brillantes等人，Stabilization ofcalcium release channel (ryanodine receptor)function byFK506-binding protein.Cell，77513-23，1994)，并促进相邻RyR2通道之间的偶联门控(Marx等人，Coupled gating between individualskeletal muscle Ca2+release channels(ryanodine receptors).Science，281818-21，1998)，从而防止了在心动周期静息相期间通道的异常激活。
衰竭的心脏(例如在心力衰竭患者中和在心力衰竭动物模型中)以不适应的响应为特征，它包括慢性肾上腺素能亢进性(hyperadrenergic)刺激(Bristow等人，Decreased catecholaminesensitivity and beta-adrenergic-receptor density in failing humanhearts.N.Engl.J.Med.，307205-11，1982)。该刺激在心力衰竭中的致病意义得到了治疗策略的支持，该策略降低了β-肾上腺素能刺激和左心室心肌壁应力，有效地逆转了心室改型(Barbone等人，Comparisonof right and left ventricular responses to left ventricular assist devicesupport in patients with severe heart failurea primary role ofmechanical unloading underlying reverse remodeling.Circulation，104670-75，2001；Eichhorn and Bristow，Medical therapy can improve thebiological properties of the chronically failing heart.A new era in thetreatment of heart failure.Circulation，942285-96，1996)。在心力衰竭中，慢性β-肾上腺素能刺激与心脏内β-肾上腺素能受体激活相关联，后者通过与G-蛋白偶联，激活腺苷酸环化酶，从而提高细胞内cAMP浓度。cAMP激活cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)，它已经显示出诱导RyR2的高度磷酸化(hyperphosphorylation)。
已经提出在心力衰竭中，RyR2的高度磷酸化是促成收缩功能抑制和心律失常发生的因素(Marks等人，Progression of heart failureisprotein kinase a hyperphosphorylation of the ryanodine receptor acontributing factor？Circulation，105272-75，2002；Marx等人，PKAphosphorylation dissociates FKBP 12.6 from the calcium releasechannel(ryanodine receptor)defective regulation in failing hearts.Cell，101365-76，2000)。与该假说一致，衰竭心脏中RyR2的PKA高度磷酸化已经在体内，既在动物模型中又在经受心脏移植的心力衰竭患者中得到了证实(Antos等人，Dilated cardiomyopathy and suddendeath resulting from constitutive activation of protein kinase A.Circ.Res.，89997-1004，2001；Marx等人，PKA phosphorylation dissociatesFKBP 12.6 from the calcium release channel(ryanodine receptor)defective regulation in failing hearts.Cell，101365-76，2000；Ono等人，Altered interaction of FKBP 12.6with ryanodine receptor as acause of abnormal Ca(2+)release in heart failure.Cardiovasc.Res.，48323-31，2000；Reiken等人，Beta-adrenergic receptor blockers restorecardiac calcium release channel(ryanodine receptor)structure andfunction in heart failure.Circulation，1042843-48，2001；Semsarian等人，The L-type calcium channel inhibitor diltiazem preventscardiomyopathy in a mouse model.J.Clin.Invest.，1091013-20，2002；Yano等人，Altered stoichiometry of FKBP 12.6 versusryanodine receptor as a cause of abnormal Ca(2+)leak throughryanodine receptor in heart failure.Circulation，1022131-36，2000)。
在衰竭的心脏中，RyR2通过PKA的高度磷酸化引起调控性FKBP 12.6亚基从RyR2通道分离(Marx等人，PKA phosphorylationdissociates FKBP 12.6 from the calcium release channel(ryanodinereceptor)defective regulation in failing hearts.Cell，101365-76，2000)。这引起了RyR2通道生物物理学性质的明显改变。这种改变通过以下事实得以证明由于对Ca2+依赖性激活的敏感性增加，开放概率(Po)增加(Brillantes等人，Stabilization of calcium release channel(ryanodine receptor)function by FK506-binding protein.Cell，77513-23，1994；Kaftan等人，Effects of rapamycin on ryanodinereceptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle.Circ.Res.，78990-97，1996)；通道去稳定化，导致亚传导状态；以及受损的通道偶联门控，导致有缺陷的EC偶联和心功能障碍(Marx等人，Coupledgating between individual skeletal muscle Ca2+ release channels(ryanodine receptors).Science，281818-21，1998)。因此，PKA-高度磷酸化的RyR2对低水平Ca2+刺激非常敏感，这证明它本身是通过高度磷酸化通道的SR Ca2+泄漏。
在结构正常的心脏中，类似现象也可能发生。特别地，已知运动和应激诱导儿茶酚胺类的释放，它激活心脏内的β-肾上腺素能受体。β-肾上腺素能受体的激活导致RyR2通道的高度磷酸化。而且，有证据表明，由β-肾上腺素能受体激活导致的RyR2的高度磷酸化致使突变型RyR2通道更有可能在心动周期的舒张期开放，增加了心律失常的可能性。
已知心律失常与结构正常心脏中的SR Ca2+泄漏有关。在这些情况下，诱导和维持室性心动过速的最普遍的机制是自主性异常。一种类型的自主性异常，称为触发性心律失常，与SR Ca2+的异常释放有关，后者启动了延迟的后去极化(DADs)(Fozzard，H.A.，Afterdepolarizations and triggered activity.Basic Res.Cardiol.，87105-13，1992；Wit and Rosen，Pathophysiologic mechanisms of cardiacarrhythmias.Am.Heart J.，106798-811，1983)。DADs，它可以触发致死性室性心律失常，是心肌细胞的异常去极化，它在心脏动作电位复极化之后发生。还没有完全阐明导致DADs的异常SR Ca2+释放的分子基础。然而已知DADs被里安娜碱阻断，证据是RyR2可在该异常Ca2+释放的发病机制中发挥关键作用(Marban等人，Mechanisms ofarrhythmogenic delayed and early afterdepolarizations in ferretventricular muscle.J.Clin.vest.，781185-92，1986；Song andBelardinelli，ATP promotes development of afterdepolarizations andtriggered activity in cardiac myocytes.Am.J.Physiol.，267H2005-11，1994)。
由上述内容看来，很明显，RyR2通道泄漏与很多病理状态有关——既在患病心脏中又在结构正常的心脏中。因此，修复RyR2泄漏的方法能够预防数百万患者的致死性心律失常。
JTV-519(4-[3-(4-苄基哌啶-1-基)丙酰基]-7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮单盐酸盐；也称为k201)，1，4-苯并噻氮衍生物，是新的钙离子通道调节剂。除了调节心肌细胞Ca2+水平以外，JTV-519还调节豚鼠心室细胞的Na+电流和内向整流器K+电流，并抑制豚鼠心房细胞的延迟整流器K+电流。研究已经显示，JTV-519对儿茶酚胺诱导的心肌损伤、心肌损伤诱导的肌纤维过度收缩、和缺血/再灌注损伤具有很强的心脏保护作用。在实验性肌纤维过度收缩模型中，JTV-519显示了比普萘洛尔、维拉帕米和地尔硫卓更大的心脏保护作用。实验数据也显示，JTV-519通过减少动物模型的细胞内Ca2+超负荷水平，有效地预防了心室缺血/再灌注。
发明概述本发明基于以下令人惊奇的发现，即RyR2是预防引起运动诱导的心源性猝死(SCD)的心律失常的靶。正如本文所描述的，发明人制造了具有7个不同CPVT突变的突变型RyR2通道，并研究了它们的功能。所有的7个突变型都具有功能缺陷，它导致该通道当在运动过程中受刺激时，变得易于泄漏(SR钙泄漏)。本发明人的研究首次鉴别了SR钙泄漏引起DAD的机制。值得注意的是，突变型CPVT通道缺陷使得该通道看起来像末期心力衰竭患者心脏中的泄漏通道，末期心力衰竭是以致死性心律失常的高发病率为特征的疾病。因此，本发明人在本文中证明了CPVT中的VT机制与心力衰竭中的VT机制是相同的。
发明人还在本文中公开了药物JTV-519(k201)，1，4-苯并噻氮家族化合物的一员，修复了RyR2通道的泄漏。正如发明人在本文中所显示的，JTV-519增强了FKBP 12.6对PKA-磷酸化RyR2和对突变型RyR2的结合，否则它们对FKBP 12.6具有减弱的亲和力或不与之结合。JTV-519的这种作用修复了RyR2的泄漏，后者触发致死性心律失常(心源性死亡)，并在心力衰竭中促成心肌功能障碍。另外，发明人还开发了JTV-519的新合成法，以及该药物的放射标记形式。
因此，一方面，本发明提供了通过对患者施用有效预防所述患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量的JTV-519，在所述患者中限制或预防RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的方法，所述患者是运动引起的心律失常的候选者。还提供了JTV-519在限制或预防为运动引起的心律失常候选者的患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的方法中的应用。
另一方面，本发明提供了通过对患者施用有效治疗或预防所述患者中运动引起的心律失常的量的JTV-519，治疗或预防所述患者中运动引起的心律失常的方法。还提供了JTV-519在治疗或预防患者中运动引起的心律失常的方法中的应用。
又一方面，本发明提供了通过对患者施用有效预防所述患者中运动引起的心源性猝死的量的JTV-519，预防所述患者中运动引起的心源性猝死的方法。还提供了JTV-519在预防患者中运动引起的心源性猝死的方法中的应用。
再一方面，本发明提供了鉴定用于预防运动引起的心源性猝死的物质的方法，通过(a)获得或产生包含RyR2的细胞的培养物；(b)使细胞与候选物质接触；(c)将细胞暴露于一种或多种已知增加细胞内RyR2磷酸化的条件下；并且(d)测定该物质是否预防了细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低。该方法还可包括以下步骤(e)测定该物质是否对细胞内RyR2相关的生物学事件有影响。还提供的是用该方法鉴定的物质，通过对患者施用有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量的该物质，预防患者中运动引起的心源性猝死的方法。
还一方面，本发明提供了鉴定用于预防运动引起的心源性猝死的物质的方法，通过(a)获得或产生包含RyR2的动物；(b)对所述动物施用候选物质；(c)将动物暴露于一种或多种已知增加细胞内RyR2磷酸化的条件下；并且(d)测定该物质是否增加了动物中FKBP 12.6和RyR2之间的结合。该方法还可包括以下步骤(e)测定该物质是否对动物中RyR2相关的生物学事件有影响。还提供的是用该方法鉴定的物质，通过对患者施用有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量的该物质，预防患者中运动引起的心源性猝死的方法。
又一方面，本发明提供了合成JTV-519和包括以下结构的1，4-苯并噻氮中间体和衍生物的方法 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，和其中R可以位于2、3、4或5位； 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，和其中R可以位于2、3、4或5位； 其中R1＝n-MeO、n-MeS或n-烷基，并且n＝6、7、8或9；其中R2＝烷基；以及其中R3＝烷基。
还一方面，本发明提供了合成放射标记的JTV-519的方法。
由以下说明看来，本发明的其它方面将是显而易见的。
附图的简要说明
图1证明，JTV-519预防FKBP 12.6+/-小鼠中运动引起的室性心律失常。(A)未经处理的FKBP 12.6+/-小鼠、经JTV-519处理的FKBP12.6+/-小鼠和经JTV-519处理的FKBP 12.6-/-小鼠的典型动态心电图。心率或任何所测量的ECG参数没有显著区别。(B)上面的描记图持续性多形性室性心动过速的例子，在进行运动试验和用1.0mg/kg肾上腺素注射的未经处理的FKBP 12.6+/-小鼠中记录。中间的描记图用相同方案处理后的经JTV-519处理的FKBP 12.6+/-小鼠心电图；没有检测到心律失常。下面的描记图经JTV-519处理的FKBP 12.6-/-小鼠的运动引起的室性心动过速(VT)。虚线表示VT的16.31秒，它没有在图中显示。‘P’表示P-波，它表示室性心动过速后的窦性节律。(C)显示分别用或不用JTV-519处理的FKBP 12.6+/-和FKBP 12.6-/-小鼠的心源性猝死(左边)、持续性室性心动过速(＞10次搏动，中间)和非持续性室性心动过速(3-10次异常搏动，右边)的定量条形图。应当注意的是，JTV-519的处理完全预防了运动和肾上腺素引起的经JTV-519处理的FKBP 12.6+/-小鼠的心律失常(n＝9)，与未经处理的FKBP 12.6+/-小鼠(n＝10)或经JTV-519处理的FKBP 12.6-/-小鼠(n＝5)相比，这提示JTV-519通过使FKBP 12.6与RyR2重新结合，预防了FKBP 12.6+/-小鼠的心律失常和猝死。
图2显示，JTV-519通过提高FKBP 12.6+/-小鼠的FKBP 12.6对RyR2的亲和力，预防了运动引起的心源性猝死(SCD)。(A-B)使用RyR2-5029抗体，使心脏里安娜碱受体(RyR2)免疫沉淀。所显示的是免疫印迹(A)和条形图(B)，它们代表在休息情况下和运动之后，在分别缺乏或存在JTV-519下，野生型(FKBP 12.6+/+)小鼠、FKBP 12.6+/-小鼠和FKBP 12.6-/-小鼠中，RyR2、PKA-磷酸化的RyR2(RyR2-pSer2809抗体)和FKBP 12.6的定量。在休息情况下，FKBP12.6+/-小鼠中的～70％FKBP 12.6与RyR2结合。在运动试验之后，FKBP 12.6+/-小鼠中与RyR2复合物结合的FKBP 12.6的量戏剧性地减少了，但这可以用JTV-519处理来恢复。(C)从运动试验和肾上腺素注射之后获得的心脏中分离RyR2单通道。所显示的是从经和未经JTV-519预处理的FKBP 12.6+/-小鼠获得的通道，和经JTV-519预处理后的FKBP 12.6-/-小鼠获得的通道。应当注意的是，RyR2-通道功能在经JTV-519处理的运动的FKBP 12.6+/-小鼠中被正常化。来自JTV-519处理后的运动的FKBP 12.6-/-小鼠的典型单通道显示，JTV-519的作用需要心脏中的FKBP 12.6。虚线表示不完全的通道孔，或‘亚传导’孔，表示FKBP 12.6-耗竭的RyR2通道。左边的描记图代表5.0秒，而右边的描记图代表500毫秒。在图中，Po＝开放概率；To＝平均开放时间；Tc＝平均闭合时间；以及c＝通道的关闭状态。(D)显示单RyR2通道平均开放概率的概括条形图(参见以上)。JTV-519戏剧性地减少了在舒张钙浓度(150nM)下，运动试验后FKBP12.6+/-小鼠RyR2的开放概率。
图3图解说明了通过增加的FKBP 12.6对PKA-磷酸化RyR2通道的结合亲和力，JTV-519-正常化的RyR2-通道门控。(A，B)如前所述制备犬心脏SR膜(A)和重组表达的RyR2通道(B)(Kaftan等人，Effects of rapamycin on ryanodine receptor/Ca(2+)-release channelsfrom cardiac musele.Circ.Res.，78990-97，1996)。(A)用PKA催化亚基(40U；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，在存在或不存在PKA抑制剂PKI5-24的情况下，在磷酸化缓冲液(8mM MgCl2、10mMEGTA和50mM Tris/PIPES；pH 6.8)中，使里安娜碱受体(RyR2)磷酸化。样品在100,000×g下离心10分钟，并在咪唑缓冲液(10mM咪唑；pH 7)中洗涤三次。在不存在或存在各种浓度JTV-519的情况下，将重组表达的FKBP 12.6(最终浓度＝250nM)加入样品。60分钟的培养以后，样品在100,000×g下离心10分钟，并在咪唑缓冲液中洗涤两次。样品加热到95℃，使用SDS-PAGE进大小分级。如前所述(Jayaraman等人，FK506binding protein associated with the calciumrelease channel(ryanodine receptor).J.Biol.Chem.，2679474-77，1992)，用抗-FKBP 12.6抗体(1∶1,000)和抗-RyR2-5029抗体(1∶3,000)进行SR微粒体的免疫印迹。附图证明，JTV-519能够使FKBP 12.6结合到(A)PKA-磷酸化的RyR2(在100nM下部分结合；在1000nM下完全结合)，或(B)RyR2-S2809D突变型通道，它是组成上的PKA-磷酸化RyR2通道。(C-E)显示PKA磷酸化以后RyR2的开放概率增加(D)的单通道研究，与存在特异PKA抑制剂PKI5-24的情况下的PKA磷酸化(C)相比。在JTV-519的存在下，在用FKBP 12.6培养的PKA-磷酸化RyR2中，单通道功能被正常化(E)。通道孔上调，虚线表示完全孔的水平(4pA)，字母‘c’表示关闭状态。显示通道处于压缩(5秒，上面的描记图)和扩张(500毫秒，下面的描记图)时间尺度下，记录是在0mV下。幅度组织图(右边)显示在未经JTV-519和FKBP 12.6处理的PKA-磷酸化RyR2中，增加的活性和亚传导孔。(F)作为胞浆[Ca2+]的函数的开放概率的标准化散点图。在JTV-519的存在下，用FKBP 12.6对PKA-磷酸化RyR2进行的培养使RyR2活化的Ca2+-依赖性向右边位移，使其与非磷酸化通道的Ca2+-依赖性类似。
发明的详细描述如以上所讨论的，儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)是心脏结构正常个体的遗传性疾病。它以应激引起的室性心动过速，一种可引起心源性猝死(SCD)的致死性心律失常为特征。位于肌质网(SR)上的RyR2通道突变已经与CPVT相关联。为了确定构成CPVT中致死性心律失常基础的分子机制，发明人研究了CPVT-相关的突变型RyR2通道(例如S2246L、R2474S、N4104K、R4497C)。
所有CPVT个体都有运动引起的心律失常。本发明人先前指出，运动引起的心律失常和猝死(在CPVT患者中)由FKBP 12.6对RyR2的亲和力降低引起。在本文中，发明人已经证明，作为3′，5′-一磷酸腺苷(cAMP)-依赖的蛋白激酶(PKA)磷酸化的结果，运动激活RyR2。突变型RyR2通道，在基础条件下它的平面脂双层具有正常功能，与野生型通道相比，对PKA磷酸化的激活更敏感——显示出增加的活性(开放概率)和延长的开放状态。另外，PKA-磷酸化的突变型RyR2通道抵抗Mg2+(该通道的生理学抑制剂)的抑制，并显示出对FKBP 12.6的结合降低(它在关闭状态下稳定通道)。这些发现表明，在运动过程中，当RyR2被PKA-磷酸化时，突变型CPVT通道更有可能在心动周期的舒张期(心脏舒张期)开放，增加由SR Ca2+泄漏触发的心律失常的可能性。由于心力衰竭是世界范围内死亡的主要原因，修复RyR2泄漏的方法能够预防世界范围内数百万患者的致死性心律失常。
发明人在本文中进一步证明了，JTV-519(一种苯并噻氮衍生物)预防了杂合FKBP 12.6基因小鼠的致死性室性心律失常。通过增加FKBP 12.6对PKA-磷酸化RyR2的亲和力，JTV-519减少了从运动后死亡的FKBP 12.6+/-小鼠中分离的RyR2的开放概率。而且，通过增加FKBP 12.6的结合亲和力，JTV-519使CPVT-相关的突变型RyR2通道门控正常化。这些数据表明，通过增加FKBP 12.6-RyR2的结合亲和力，JTV-519可预防致死性室性心律失常。
新的治疗和预防方法根据先前所述，本发明提供了限制或预防患者细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的方法。当用于本文中时，“FKBP 12.6”既包括“FKBP 12.6蛋白”又包括“FKBP 12.6类似物”。除非文中另外指明，“蛋白”将包括蛋白质、蛋白质结构域、多肽或肽，及其任何片段。“FKBP 12.6类似物”是具有FKBP 12.6生物活性的FKBP 12.6蛋白的功能变异体，它与FKBP 12.6蛋白具有60％或更多(优选70％或更多)的氨基酸序列同源性。当用于本文中时，术语“FKBP 12.6生物活性”指的是蛋白或肽表明与非磷酸化或非高度磷酸化RyR2物理缔合或结合的能力(即大于阴性对照背景结合的大约2倍、或更优选大约5倍的结合)的活性，在本文所述的试验条件下，尽管亲和力可能与FKBP12.6的亲和力不同。
另外，当用于本文中时，“RyR2”既包括“RyR2蛋白”又包括“RyR2类似物”。“RyR2类似物”是具有RyR2生物活性的RyR2蛋白的功能变异体，它与RyR2蛋白具有60％或更多(优选70％或更多)的氨基酸序列同源性。本发明的RyR2可能是非磷酸化的、磷酸化的或高度磷酸化的。当用于本文中时，术语“RyR2生物活性”指的是蛋白或肽表明与FKBP 12.6物理缔合或结合的能力(即大于阴性对照背景结合的大约2倍、或更优选大约5倍的结合)的活性，在本文所述的试验条件下，尽管亲和力可能与RyR2的亲和力不同。
如以上所述，心脏里安娜碱受体，RyR2，是一种蛋白复合物，包括4个565,000道尔顿的RyR2蛋白，缔合4个12,000道尔顿的FKBP12.6蛋白。FK506结合蛋白(FKBPs)是广泛表达的顺式-反式肽酰-脯氨酰异构酶，执行多种细胞功能。FKBP 12.6蛋白与RyR2紧密结合，并调节其功能。FKBP 12.6与RyR2通道结合(每个RyR2亚基1个分子)，稳定RyR2-通道的功能，并促进相邻RyR2通道之间的偶联门控，从而预防了在心动周期静息相期间通道的异常激活。因此，当用于本文中时，术语“RyR2-结合的FKBP 12.6”包括与RyR2蛋白亚基缔合的FKBP 12.6蛋白分子，或与RyR2四聚物结合的FKBP 12.6四聚物。
根据本发明的方法，患者细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的“降低”指的是患者细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的可检测的降低、减少或缩减。当通过施用JTV-519(如下所述)，这样患者细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平高于不存在JTV-519时的水平，该降低以任何方式被停止、妨碍、阻碍、阻断或减少时，患者细胞内的这种降低就被限制或阻止了。
患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平可通过标准试验和技术来检测，包括很容易从已知技术测定的那些试验和技术(例如免疫学技术、杂交分析、免疫沉淀、蛋白印迹分析、荧光显像技术和/或放射检测等)，以及本文公开的任何试验和检测方法。例如，可使用本领域中已知的标准方法从患者细胞中分离和纯化蛋白，包括但并不限于如果需要的话从细胞中提取(例如用使蛋白增溶的洗涤剂)，接着进行柱，色谱法(例如FTLC和HPLC)亲和提纯，免疫沉淀(用抗体)，和沉淀(例如用异丙醇和诸如Trizol试剂)。蛋白的分离和纯化可接着进行电泳(例如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上)。患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低，或其限制或阻止，可通过比较施用JTV-519之前检测的RyR2-结合的FKBP 12.6的量(根据下述方法)和在施用JTV-519之后的适当时间检测的量来确定。
在本发明的方法中，患者细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低可被限制或阻止，例如，通过抑制患者细胞内FKBP 12.6和RyR2的解离；通过增加患者细胞内FKBP 12.6和RyR2之间的结合；或通过稳定患者细胞内的RyR2-FKBP 12.6复合物。当用于本文中时，术语“抑制解离”包括阻断、降低、抑制、限制或预防患者细胞内FKBP12.6亚基从RyR2分子的物理解离或分离，和阻断、降低、抑制、限制或预防患者细胞内RyR2分子从FKBP 12.6亚基的物理解离或分离。当用于本文中时，术语“增加结合”包括增强、增加或提高患者细胞内磷酸化RyR2与FKBP 12.6物理结合的能力(例如大于阴性对照背景结合的大约2倍、或更优选大约5倍的结合)，并增强、增加或提高患者细胞内FKBP 12.6与磷酸化RyR2物理结合的能力(例如大于阴性对照背景结合的大约2倍、或更优选大约5倍的结合)。另外，在本发明方法中，患者细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低可被限制或阻止，通过直接降低患者细胞内磷酸化RyR2水平，或通过间接降低细胞内磷酸化RyR2水平(例如通过以酶(例如PKA)或另一种调节或调整细胞内磷酸化RyR2功能或水平的内源性分子为目标)。优选地，在本发明方法中，细胞内磷酸化RyR2水平被降低了至少10％。更优选地，磷酸化RyR2水平被降低了至少20％。
根据本发明的方法，患者、尤其是患者细胞内RyR2-结合的FKBP12.6水平的降低可被限制或阻止。本发明的患者可为任何动物，包括两栖动物、禽类、鱼、哺乳动物和有袋类动物，但优选是哺乳动物(例如，人；家畜，如猫、狗、猴、小鼠或大鼠；或商业动物，如奶牛或猪)。另外，本发明患者是运动引起的心律失常的候选者。运动引起的心律失常是一种心脏病症(例如心室纤维性颤动或室性心动过速，包括导致心源性猝死的任何心脏病)，它在患者进行身体运动过程中/之后发生。运动引起的心律失常“候选者”是已知有、或认为有、或怀疑有在身体运动过程中/之后发生心律失常危险的对象。运动引起的心律失常候选者的例子包括但并不限于，已知患有儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)的动物/人；怀疑患有CPVT的动物/人；以及已知有、或认为有、或怀疑有在身体运动过程中/之后发生心律失常危险的，以及将要去运动、目前正在运动、或刚完成运动的动物/人。正如以上所讨论的，CPVT是心脏结构正常的个体中的遗传性疾病。它以应激-引起的室性心动过速——一种可引起心源性猝死的致死性心律失常为特征。在CPVT患者中，身体劳累和/或应激诱导双向性和/或多形性室性心动过速，后者在没有可检测的结构性心脏病的情况下导致心源性猝死(SCD)。CPVT个体在进行运动时有室性心律失常，但在休息时不发生心律失常。
在本发明方法中，患者细胞优选是横纹肌细胞。横纹肌是这样的一种肌肉，其中收缩性肌原纤维的重复单位(肌小节)的所有细胞都按顺序(in registry)排列，形成在光学显微镜水平下可观察到的横纹或斜纹。横纹肌细胞的例子包括但并不限于，随意(骨骼)肌细胞和心肌细胞。在优选实施方案中，本发明方法所用的细胞是人心肌细胞。当用于本文中时，术语“心肌细胞”包括心肌纤维，例如在心脏心肌层中发现的那些。心肌纤维由邻接的心肌细胞，或闰盘处首尾相连的心肌细胞的链组成。这些闰盘具有两种类型的细胞连接扩展的桥粒，其沿着它们的横向部分延伸；以及间隙连接，它们大部分位于它们的纵向部分。
在本发明方法中，患者细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低受对患者给予JTV-519的限制或阻止；这也可以通过允许患者细胞和JTV-519之间的接触来实现。JTV-519(4-[3-(4-苄基哌啶-1-基)丙酰基]-7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮单盐酸盐)；也称为k201，是1，4-苯并噻氮衍生物和钙离子通道调节剂。除了调节心肌细胞Ca2+水平以外，JTV-519还调节豚鼠心室细胞的Na+电流和内向整流器K+电流，并抑制豚鼠心房细胞的延迟整流器K+电流。FK506和雷帕霉素是可用于设计其它化合物的药物，该其它化合物稳定为运动引起的心律失常的候选者的患者细胞内的RyR2-FKBP 12.6结合。FK506和雷帕霉素都使FKBP 12.6从RyR2解离。设计和/或筛选与这些药物结构相关、但具有相反作用的化合物是可能的。
在本发明方法中，JTV-519可以治疗组合物的方式对患者进行给药，该组合物包含JTV-519和药学可接受的载体。药学可接受的载体必须是“可接受的”，意思是与组合物的其它成分是相容的，并且对其接受者是无害的。本文采用的药学可接受的载体选自用作药物制剂的物质的各种有机或无机物质，并且它可以镇痛药、缓冲剂、粘合剂、崩解剂、稀释剂、乳化剂、赋形剂、填充剂、助流剂、增溶剂、稳定剂、助悬剂、等张剂、载体和增粘剂的形式掺入。如果需要的话，药物添加剂，例如抗氧化剂、芳香剂、着色剂、香味改进剂、防腐剂和增甜剂也可加入。药学可接受载体的例子包括羧甲基纤维素、微晶纤维素、甘油、阿拉伯胶、乳糖、硬脂酸镁、甲基纤维素、粉末、盐水、海藻酸钠、蔗糖、淀粉、滑石粉和水，除了别的以外。
本发明的药物制剂可用药学领域熟知的方法制备。例如，JTV-519可与载体或稀释剂联合制成混悬剂或溶液。任选地，也可加入一种或多种附加成分(例如缓冲液、调味剂和表面活性剂等)。载体的选择将取决于给药途径。
通过使患者体内的靶细胞(例如心肌细胞)与JTV-519接触，可将JTV-519对患者进行给药。使用用于导入和施用蛋白、核酸和其它药物的已知技术，可将JTV-519与患者细胞接触(例如导入)。将细胞与JTV-519接触(即用JTV-519处理细胞)的方法的例子包括但并不限于吸收、电穿孔、浸渍、注射、导入、脂质体传递、转染、传输、载体和其它药物递送载体和方法。当靶细胞位于患者的特定部分时，希望通过注射或通过其它方法(例如通过将JTV-519导入血液或另一种体液)将JTV-519直接导入细胞。靶细胞可被包含于患者的心脏组织中，并可通过已知技术很容易确定的标准检测方法在患者心脏组织中检测到，其实例包括但并不限于免疫学技术(例如免疫组织化学染色)、荧光显像技术和显微镜技术。
另外，可通过已知方法将本发明的JTV-519对人类患者或动物患者给药，包括但并不限于口服给药、胃肠外给药和透皮给药。优选地，通过筋膜上、囊内、颅内、皮内、鞘内、肌内、眼眶内、腹膜内、脊柱内、胸骨内、血管内、静脉内、实质、皮下或舌下注射，或通过导管，胃肠外施用JTV-519。在一个实施方案中，经由插入患者心脏的导管，通过靶向传递给心肌细胞的方式，将该物质对患者进行给药。
对于口服给药来说，JTV-519制剂可以胶囊、片剂、散剂、颗粒剂或混悬剂的形式呈现。制剂可具有常规添加剂，例如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉。制剂也可与粘合剂，例如微晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶一起存在。另外，制剂可与崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠一起存在。制剂也可与无水磷酸氢钙或淀粉羟乙酸钠一起存在。最后，制剂可与润滑剂，例如滑石粉或硬脂酸镁一起存在。
对于胃肠外给药(即通过消化道以外的途径注射给药)来说，JTV-519可与无菌水溶液联合，优选该水溶液与患者血液等渗。该制剂可如下制备将固体活性成分溶于包含生理学相容物质，例如氯化钠和甘氨酸等，并且具有与生理条件相容的缓冲pH的水中，以便制备水溶液，然后将所述溶液灭菌。制剂可存在于单位容器或多剂量容器，例如密封安瓿或小瓶中。制剂可通过任何注射方式传递，包括但并不限于，筋膜上、囊内、颅内、皮内、鞘内、肌内、眼眶内、腹膜内、脊柱内、胸骨内、血管内、静脉内、实质、皮下或舌下，或通过插入患者心脏的导管。
对于透皮给药来说，JTV-519可与皮肤吸收促进剂，例如丙二醇、聚乙二醇、异丙醇、乙醇、油酸和N-甲基吡咯烷酮等联合，它们增加皮肤对JTV-519的渗透性，允许JTV-519渗透通过皮肤进入血流。JTV-519/促进剂组合物也还可与聚合物质，例如乙基纤维素、羟丙基纤维素、乙烯/醋酸乙烯酯和聚乙烯吡咯烷酮等联合，以提供凝胶形式的组合物，其可溶于溶剂，例如二氯甲烷，蒸发至所需的粘度，然后应用到背衬材料以提供贴剂。
根据本发明的方法，JTV-519可以有效限制或预防患者，优选患者细胞中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量对患者进行给药(JTV-519可与患者细胞接触)。本领域技术人员基于已知方法，包括在体内建立的滴定曲线分析和本文公开的方法和测定法，可很容易地确定该量。JTV-519有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的合适的量可为约5mg/kg/天到约20mg/kg/天，和/或可为足以达到约300ng/ml到约1000ng/ml的血浆水平的量。优选地，JTV-519的量从约10mg/kg/天到约20mg/kg/天。
在本发明的一个实施方案中，患者还没有发生运动引起的心律失常。在这种情况下，JTV-519有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量可为JTV-519有效预防患者中运动引起的心律失常的量。心律失常是心脏电活动的紊乱，它表现为心率或心节律异常。当用于本文中时，JTV-519“有效预防运动引起的心律失常的量”包括JTV-519有效预防运动引起的心律失常的临床损伤或症状(例如心悸、晕厥、心室纤维性颤动、室性心动过速和心源性猝死)发生的量。JTV-519有效预防患者中运动引起的心律失常的量将根据各个病例的特定因素，包括运动引起的心律失常类型、患者体重、患者病况的严重程度和JTV-519的给药方式而变化。本领域技术人员基于已知方法，它包括临床试验，和本文公开的方法，有效可很容易地确定该量。在优选实施方案中，JTV-519有效预防运动引起的心律失常的量是JTV-519有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量。在另一个优选实施方案中，JTV-519预防患者中运动引起的心律失常和运动引起的心源性猝死。
由于JTV-519稳定RyR2-结合的FKBP 12.6，和在RyR2的动态PKA磷酸化和去磷酸化中维持和恢复平衡的能力，它也适用于治疗已经开始经历运动引起的心律失常临床症状的患者。如果在患者中足够早地观察到了心律失常症状，JTV-519可有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平的进一步降低。
因此，在本发明的又一个实施方案中，患者一直运动，或正在运动，并且已经发生了运动引起的心律失常。在这种情况下，JTV-519有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量可为JTV-519有效治疗患者中运动引起的心律失常的量。当用于本文中时，JTV-519“有效治疗运动引起的心律失常”的量包括JTV-519有效减轻或改善运动引起的心律失常的临床损伤或症状(例如心悸、晕厥、心室纤维性颤动、室性心动过速和心源性猝死)的量。JTV-519有效治疗患者中运动引起的心律失常的量将根据各个病例的特定因素，包括运动引起的心律失常类型、患者体重、患者病况的严重程度和JTV-519的给药方式而变化。本领域技术人员基于已知方法，它包括临床试验，和本文公开的方法，可很容易地确定该量。在优选实施方案中，JTV-519治疗患者中运动引起的心律失常。
本发明还提供了治疗患者中运动引起的心律失常的方法。该方法包括以有效治疗患者中运动引起的心律失常的量对患者施用JTV-519。JTV-519有效治疗患者中运动引起的心律失常的合适的量可为约5mg/kg/天到约20mg/kg/天，和/或可为足以达到约300ng/ml到约1000ng/ml的血浆水平的量。本发明还提供了预防患者中运动引起的心律失常的方法。该方法包括以有效预防患者中运动引起的心律失常的量对患者施用JTV-519。JTV-519有效预防患者中运动引起的心律失常的合适的量可为约5mg/kg/天到约20mg/kg/天，和/或可为足以达到约300ng/ml到约1000ng/ml的血浆水平的量。另外，本发明提供了预防患者中运动引起的心源性猝死的方法。该方法包括以有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量对患者施用JTV-519。JTV-519有铲预防患者中运动引起的心源性猝死的合适的量可为约5mg/kg/天到约20mg/kg/天，和/或可为足以达到约300ng/ml到约1000ng/ml的血浆水平的量。
在上述方法的各种实施方案中，患者中运动引起的心律失常与VT有关。在优选实施方案中，VT是CPVT。在这些方法的其它实施方案中，患者是引起的心律失常的候选者，包括运动引起的心源性猝死的候选者。
由上述方法看来，本发明还提供了JTV-519在限制或预防为运动引起的心律失常的候选者的患者中RyR2-结合的FKBP 12.6的水平降低的方法中的应用。本发明还提供了JTV-519在治疗或预防患者中运动引起的心律失常的方法中的应用。此外，本发明提供了JTV-519在预防患者中运动引起的心源性猝死的方法中的应用。
正如以上所讨论的和本文所显示的，发明人的数据显示，心脏里安娜碱受体RyR2在丝氨酸2809上的蛋白激酶A(PKA)磷酸化，通过释放FK506结合蛋白FKBP 12.6，激活了通道。在衰竭的心脏中(包括心力衰竭的人心脏和动物模型)，RyR2是PKA-高度磷酸化的，形成结合FKBP 12.6的量减少和对钙引起的激活敏感性提高的有缺陷的通道。这种改变的纯粹结果就是RyR2通道是“泄漏的”。这些通道泄漏可以导致细胞内钙储备的耗竭，以达到肌质网(SR)内不再有足够的钙来给肌肉收缩提供强刺激的程度。这导致心肌虚弱收缩。作为通道泄漏的又一个后果，RyR2通道在被称为“舒张期”的心脏周期静息相期间释放钙。舒张期期间钙的释放可以触发引起心源性猝死(SCD)的致死性心律失常(例如室性心动过速和心室纤维性颤动)。
发明人还已经显示，用机械泵装置(被称为左心室辅助装置(LVAD)，它将心脏置于休息状态并恢复正常功能)治疗心力衰竭，与RyR2的PKA高度磷酸化减少和通道功能正常化有关。此外，发明人还已经显示，用β-肾上腺素能阻断剂(β阻断剂)治疗狗(它具有起搏引起的心力衰竭)逆转了RyR2的PKA高度磷酸化。β阻断剂抑制激活PKA的通路。从发明人的工作结果可得出的结论是，RyR2的PKA高度磷酸化增加了通道活性，导致由于通道的特定触发器(激活剂)而有更多钙释放到细胞内。
如本文进一步公开的，发明人已经确定，运动引起的心源性猝死与RyR2蛋白(尤其是CPVT-相关的RyR2突变体蛋白)的磷酸化增加，以及RyR2-结合的FKBP 12.6的水平降低有关。利用该机制来设计预防运动引起的心源性猝死的有效药物是有可能的。具有限制或预防RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低能力的候选物质可能，作为该限制或预防活性的结果，对RyR2-相关的生物学事件有效果，从而预防运动引起的心源性猝死。
因此，本发明还提供了鉴定用于预防运动引起的心源性猝死物质的方法。该方法包括以下步骤(a)获得或产生包含RyR2的细胞的培养物；(b)使细胞与候选物质接触；(c)将细胞暴露于一种或多种已知增加细胞内RyR2磷酸化的条件下；并且(d)测定该物质是否限制或预防了细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低。当用于本文中时，“物质”应当包括蛋白质、多肽、肽、核酸(包括DNA或RNA)、抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、分子、化合物、抗生素、药物及其任何组合。限制或预防RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的物质可为天然的或合成的，并且可为与RyR2和/或FKBP 12.6有反应性的物质(即对它们有亲和力、与之结合或直接对抗的物质)。如进一步用于本文中的，“包含RyR2”的细胞是其中RyR2、或其衍生物或同系物是天然表达的或天然产生的细胞(优选心肌细胞)。已知增加细胞内RyR2磷酸化的条件包括但并不限于PKA。
在本发明方法中，细胞可与候选物质通过实现药物/物质和细胞之间接触的任何标准方法接触，包括本文所述的任何导入和给药方式。细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平可通过已知方法测定或检测，包括本领域技术人员已知或本文描述的任何方法、分子操作和测定法。在本发明的一个实施方案中，该物质限制或阻止了细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低。
如本文公开的，RyR2已经参与了横纹肌细胞内的很多生物学事件。例如，已经显示RyR2通道在心肌细胞内的EC偶联和收缩中挥发着重要作用。因此，设计用于限制或预防细胞尤其是心肌细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的预防性药物，显然适用于调节很多RyR2-相关的生物学事件，包括EC偶联和收缩。因此，一旦本发明的候选物质已经被筛选，并且已经确定对RyR2-结合的FKBP 12.6的降低水平具有适当的限制或阻止作用，可评价它对细胞尤其是心肌细胞内EC偶联和收缩的影响。预期本发明的预防剂将对预防运动引起的心源性猝死有用。
因此，本发明方法还可包括以下步骤(e)使候选物质与包含RyR2的细胞的培养物接触；以及(f)测定该物质是否对细胞内RyR2相关的生物学事件有影响。当用于本文中时，“RyR2相关的生物学事件”包括其中涉及RyR2水平或活性的生化或生理过程。如本文公开的，RyR2相关的生物学事件的例子包括但并不限于心肌细胞内EC偶联和收缩。根据本发明的方法，候选物质可在体内与一种或多种细胞(优选心肌细胞)接触。例如，细胞培养物可与包含候选物质的制备物一起培养。然后，候选物质对RyR2相关的生物学事件的作用可通过本领域中已知的任何生物学试验或方法来评价，包括免疫印迹法、单通道记录和本文公开的任何其它方法。
本发明还涉及经上述鉴定方法鉴定的物质，以及包含该物质和药学可接受载体的药物组合物。该物质适用于预防患者中运动引起的心源性猝死，和用于治疗或预防其它RyR2-相关的病况。当用于本文中时，“RyR2-相关的病症”是其中涉及RyR2水平或活性的病况、疾病或障碍，并且包括RyR2-相关的生物学事件。可通过对患者施用有效治疗或预防患者中RyR2-相关的病况的量的物质，来治疗或预防患者中RyR2-相关的病况。本领域技术人员可很容易地确定该量。在一个实施方案中，本发明通过以有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量对患者施用该物质，提供了预防患者中运动引起的心源性猝死的方法。
本发明还提供了鉴定用于预防运动引起的心源性猝死的物质的体内方法。该方法可包括以下步骤(a)获得或产生包含RyR2的动物；(b)对所述动物施用候选物质；(c)将动物暴露于一种或多种已知增加细胞内RyR2磷酸化的条件下；并且(d)测定该物质是否限制或预防动物中RyR2结合的FKBP 12.6水平的降低。该方法还可包括以下步骤(e)将该物质对包含RyR2的动物施用；以及(f)测定该物质是否对动物中RyR2相关的生物学事件有影响。还提供的是用该方法鉴定的物质；包含该物质的药物组合物；以及通过对患者施用有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量的该物质，预防患者中运动引起的心源性猝死的方法。
发明人的工作已经证明，阻断PKA活化的化合物将预期会降低RyR2通道的活化，引起钙较少释放到细胞内。在FKBP 12.6结合位点与RyR2通道结合、但当通道被PKA磷酸化时并不阻断通道的化合物，将也预期会降低通道响应PKA激活或激活RyR2通道的其它触发器的活性。这样的化合物也将导致较少的钙释放到细胞内。由这些发现看来，本发明还提供了鉴定由于其阻断或抑制了RyR2活化而适用于预防运动引起的心源性猝死的物质的其它测定法。
举例来说，使用钙敏感的荧光染料(例如Fluo-3和Fura-2等)，本发明的鉴别测定可筛选通过RyR2通道释放到细胞内的钙。细胞可装载所选择的荧光染料，然后用RyR2激活剂刺激，以确定加入细胞的化合物是否减弱了钙依赖的荧光信号(Brillantes等人，Stabilizationof calcium release channel(ryanodine receptor)function byFK506-binding protein.Cell，77513-23，1994；Gillo等人，Calciumentry during induced differentiation in murine erythroleukemia cells.Blood，81783-92，1993；Jayaraman等人，Regulation of the inositol1，4，5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation.Science，2721492-94，1996)。如上所述，钙依赖的荧光信号可用光电倍增管监测，并用适当的软件进行分析(Brillantes等人，Stabilization of calciumrelease channel(ryanodine receptor)function by FK506-bindingprotein.Cell，77513-23，1994；Gillo等人，Calcium entry duringinduced differentiation in murine erythroleukemia cells.Blood，81783-92，1993；Jayaraman等人，Regulation of the inositol1，4，5-trisphosphate receptor by tyrosine phosphorylation.Science，2721492-94，1996)。该测定可以很容易地自动进行，以使用多孔盘筛选大量化合物。
为了鉴定抑制RyR2-介导的细胞内钙释放的PKA-依赖性激活的化合物，测定法可包括在异源表达系统，例如Sf9、HEK293或CHO细胞中表达重组RyR2通道(Brillantes等人，Stabilization of calciumrelease channel(ryanodine receptor)function by FK506-bindingprotein.Cell，77513-23，1994)。RyR2也能够与β-肾上腺素能受体共同表达。这能够允许评估化合物响应β-肾上腺素能受体激动剂的加入，对RyR2激活的影响。
也可测定与心力衰竭程度相关的RyR2的PKA磷酸化水平，然后将其用于确定设计用于阻断RyR2通道PKA磷酸化的化合物的效能。该测定可基于对RyR2蛋白特异的抗体的使用。例如，RyR2-通道蛋白可被免疫沉淀，然后用PKA和[γ32P]-ATP反向磷酸化(back-phosphorylated)。然后使用磷光计测定转移到RyR2蛋白上的放射性[32P]标记的量(Marx等人，PKA phosphorylation dissociatesFKBP 12.6 from the calcium release channel(ryanodine receptor)defective regulation in failing hearts.Cell，101365-76，2000)。
本发明的另一种测定法包括使用磷表位特异性抗体，该抗体检测Ser 2809上的PKA磷酸化。用该抗体进行的免疫印迹法可以用于评价对心能衰竭和心律失常的治疗效能。另外，RyR2S2809A和RyR2S2809D嵌入(knock in)小鼠可用于评价对心力衰竭和心律失常的治疗效能。这种小鼠还提供了如下证据，即通过显示RyR2S2809A突变抑制了心力衰竭和心律失常，以及RyR2 S2809D突变恶化了心力衰竭和心律失常，证明了RyR2的PKA高度磷酸化是促成心力衰竭和心律失常的因素。
化学合成的新途径在生物活性分子包括JTV-519的制备中，1，4-苯并噻氮衍生物是重要的构建块。发明人已经开发了制备1，4-苯并噻氮中间体化合物，例如7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮的新方法。发明人的方法利用了很容易获得且便宜的原料，提供了关键1，4-苯并噻氮中间体的高产率。
在20世纪90年代早期，Kaneko等人(美国专利第5,416,066号；WO 92/12148；JP4230681)公开了，通过将7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮(1，4-苯并噻氮中间体)与丙烯酰氯反应，然后将所得产物与4-苄基哌啶反应，可以制备JTV-519。
制备7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-14-苯并噻氮和类似化合物的两种方法先前已经在文献中报道过了。由Kaneko等人(美国专利第5,416,066号)公开的第一种方法包括由2，5-二羟苯甲酸开始的六步合成路径。在该方法中，2，5-二羟苯甲酸选择性地与硫酸二甲酯甲基化。然后所得化合物与二甲基硫代氨基甲酰氯反应20h，然后经受高温(270℃)9h。该步的产物与甲醇钠在甲醇中回流20h。然后将回流步骤的产物与2-氯乙胺在碱性条件和高温下反应，生成环化酰胺。用LiAlH4还原环化酰胺生成7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮(1，4-苯并噻氮中间体)。
制备7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮的第二种方法由Hitoshi公开在日本专利(JP 10045706)中。该方法由2-溴-5-甲氧基苯甲醛开始。溴化物被NaSMe取代，所得产物用氯氧化，接着在水中回流，生成二硫化物二醛。用2-氯乙胺处理该二醛，所得产物用还原剂例如NaBH4还原。将所得化合物环化生成7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮。
刚开始，发明人试图用上述方法制备1，4-苯并噻氮中间体，7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮。然而，他们发现由Kaneko等人(美国专利第5,416,066号)描述的第一种方法包括了高温且反应时间长的合成步骤。另外，发明人发现第三个硫醇化中间体中的硫代基很容易被空气氧化成二硫化物，使得它不可能合成后来的环化产物。发明人还确定Hitoshi(JP 10045706)描述的方法使用了Cl2，因此，不得不使用制备第一个中间体的另一种专利方法，它不需要用NaSMe取代溴化物。
为了克服上述问题，发明人开发了从容易获得且便宜的原料制备7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮的新方法。发明人的方法简化了分离和纯化步骤，可以用于制备不同的1，4-苯并噻氮中间体，包括7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮和具有下式所示通式结构的其它化合物 R1＝n-MeO、n-MeS、n-烷基，n＝6、7、8、9R2＝烷基R3＝烷基该方法也可用于制备JTV-519。
相应地，由上述内容看来，本发明提供了合成具有下式结构的化合物的方法 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，并且其中R可以位于2、3、4或5位，所述方法包括以下步骤(a)在任选催化剂的存在下，用还原剂处理具有下式结构的化合物
其中R如上定义，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(b)用重氮化试剂和二硫化物处理步骤(a)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(c)用氯化物和氯乙胺处理步骤(b)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(d)在四氢叶酸(tetrahydrolate)的存在下，用还原剂和碱处理步骤(c)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；以及(e)用还原剂处理步骤(d)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义。
根据本发明方法，步骤(a)中的还原剂可为H2。另外，步骤(b)中的重氮化试剂可为NaNO2，步骤(b)中的二硫化物可为Na2S2。此外，步骤(c)中的氯化物可为SOCl2。步骤(d)中的还原剂可为三甲基膦(PMe3)，而步骤(d)中的碱是三乙胺。在另一个实施方案中，步骤(e)中的还原剂是LiAIH4。
本发明还提供了合成具有下式结构的化合物的方法 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，并且其中R可以位于2、3、4或5位，所述方法包括以下步骤(a)处理具有下式结构的化合物 其中R如上定义，用3-溴丙酰氯和具有下式结构的化合物 形成具有下式结构的化合物 其中R如上定义。
举例来说，具有下式结构的化合物
其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，并且其中R可以位于2、3、4或5位，可如下合成 R＝OR′、SR′、NR′、烷基、卤化物；R′＝烷基、芳基、HR可以位于2、3、4或5位本发明的方法还提供了合成具有下式结构的化合物的方法 所述方法包括以下步骤(a)在任选催化剂的存在下，用还原剂处理具有下式结构的化合物
形成具有下式结构的化合物 (b)用重氮化试剂和二硫化物处理步骤(a)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (c)用氯化物和氯乙胺处理步骤(b)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (d)在四氢叶酸的存在下，用还原剂和碱处理步骤(c)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (e)用还原剂处理步骤(d)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 本发明的方法还提供了合成具有下式结构的化合物的方法
所述方法包括以下步骤(a)处理具有下式结构的化合物 用3-溴丙酰氯和具有下式结构的化合物 生成具有下式结构的化合物 举例来说，并如实施例7和如下方案1中所示，可从2-硝基-5-甲氧基苯甲酸如下制备7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮。使用H2连同Pd/C作为催化剂，还原2-硝基-5-甲氧基苯甲酸的硝基，生成2-氨基-5-甲氧基苯甲酸。可用NaNO2使2-氨基-5-甲氧基苯甲酸重氮化，然后用Na2S2处理，生成稳定的二硫化物。不经进一步纯化，可用SOCl2处理稳定的二硫化物，然后与2-氯乙胺在Et3N的存在下反应，生成酰胺。然后，如下酰胺化合物可经由单-罐操作转化为环化化合物。还原试剂(例如三甲基膦或三苯基膦)和碱(例如三乙胺)可加到酰胺化合物的THF(四氢叶酸)溶液中。然后所得的反应混合物回流3h。还原剂(三甲基膦或三苯基膦)将二硫化物(S-S)裂解为它的一硫化物(-S)，其就地与氯化物进行分子内环化，生成环化酰胺。然后可用LiAlH4还原环化酰胺生成1，4-苯并噻氮中间体，7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮。通过将7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮与3-溴丙酰氯反应，然后将所得化合物与4-苄基哌啶反应，可从7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮制备JTV-519。
举例来说，如实施例8和如下方案2中所示，可如下制备放射标记的JTV-519。可使用BBr3在苯环处使JTV-519脱甲基化。然后在碱(例如NaH)的存在下，用放射标记的甲基化剂(例如3H-硫酸二甲酯)使所得酚化合物再次甲基化，可生成3H-标记的JTV-519。
本发明还提供了包含放射标记的JTV-519的组合物。可使用本领域中已知的各种不同放射性标记物中的一种，完成JTV-519的标记。本发明的放射性标记物可为，例如，放射性同位素。放射性同位素可为放射可检测辐射的任意同位素，包括但并不限于35S、32P、125I、3H或14C。放射性同位素放射的放射性可以通过本领域中熟知的技术检测。例如，来自放射性同位素的γ射线可使用γ显像技术，尤其是闪烁照相技术检测。
将本发明描述于以下实施例中，提出该实施例是用于帮助理解本发明，不应当解释为如下文权利要求中所定义的那样其以任何方式限制本发明的范围。
实施例实施例1——FKBP 12.6-缺陷小鼠如之前所述，生产FKBP 12.6-缺陷小鼠(Wehrens等人，FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel(ryanodinereceptor)function linked to exercise-induced sudden cardiac death.Cell，113829-40，2003)。简单地说，使用全长鼠cDNA探针，从DBA/1lacJ文库中分离对于人FK506结合蛋白12.6(FKBP 12.6)的鼠直源物(orthologue)的小鼠基因组λ-噬菌体克隆。通过用PGK-新可选标记替代3.5kb的鼠基因组DNA，设计靶向载体，以删除外显子3和4，它包含鼠FKBP 12.6的全部编码序列(Bennett等人，Identification and characterization of the murine FK506 bindingprotein(FKBP)12.6gene.Mamm.Genome，91069-71，1998)。将5.0-kb的5′片段和1.9-kb的3′片段克隆到pJNS2——具有PGK-新和PGK-TK盒的主链载体中。使用已建立的方案生长和转染DBA/lacJ胚胎干(ES)细胞。首先用Southern分析筛选靶ES细胞，用PCR分析5个阳性ES细胞系，以证实同源重组。将雄性嵌合体培育到DBA/1lacJ雌性中，并通过褐色包被颜色鉴定种系子代。使用5′Southern分析对种系子代进行基因型分析。杂交阳性FKBP 12.6+/-雄性和雌性，子代以大约25％的频率形成FKBP 12.6-/-小鼠。FKBP 12.6-/-小鼠是多产的。
用FKBP 12.6-/-小鼠进行的所有研究都使用年龄和性别相配的FKBP 12.6+/+小鼠作为对照。在以下背景下饲养的FKBP 12.6-/-小鼠之间没有观察到区别DBA/C57BL6混合的、纯DBA和纯C57BL6。
实施例2——小鼠的遥测记录和运动试验根据哥伦比亚大学公共机构动物管理和使用委员会(InstitutionalAnimal Care and Use Committee of Columbia University)批准的实验设计，饲养和研究FKBP 12.6+/+和FKBP 12.6-/-小鼠。使用2.5％异氟烷吸入麻醉使小鼠麻醉。在腹膜内植入(Data Sciences International，St.Paul，MN)＞7日后获得能走动动物的ECG无线电遥测记录(Wehrens等人，FKBP 12.6deficiency and defective calcium release channel(ryanodine receptor)function linked to exercise-induced suddencardiac death.Cell，113829-40，2003)。为了进行应激试验，使小鼠在倾斜跑台上运动，直至筋疲力尽，然后向腹膜内注射肾上腺素(0.5-2.0mg/kg)(Wehrens等人，FKBP 12.6 deficiency and defective calciumrelease channel(ryanodine receptor)function linked toexercise-induced sudden cardiac death.Cell，113829-40，2003)。经过4h，平均能走动动物的静息心率。
实施例3——野生型和RyR2-S2809D突变型的表达如之前所述，进行RyR2上的PKA靶位(RyR2-S2809D)的诱变(Wehrens等人，FKBP 12.6deficiency and defective calcium releasechannel(ryanodine receptor)function linked to exercise-inducedsudden cardiac death.Cell，113829-40，2003)。使用Ca2+磷酸盐沉淀，用20μg RyR2野生型(WT)或突变型cDNA，并用5μg FKBP 12.6cDNA共转染HEK293细胞。如之前所述制备包含RyR2通道的小囊泡(Wehrens等人，FKBP 12.6 deficiency and defective calcium releasechannel(ryanodine receptor)function linked to exercise-inducedsudden cardiac death.Cell，113829-40，2003)。
实施例4—RyR2 PKA磷酸化和FKBP 12.6结合如之前所述，制备心脏SR膜(Marx等人，PKA phosphorylationdissociates FKBP 12.6 from the calcium release channel(ryanodinereceptor)defective regulation in failing hearts.Cell，101365-76，2000；Kaftan等人，Effects of rapamycin on ryanodinereceptor/Ca(2+)-release channels from cardiac muscle.Circ.Res.，78990-97，1996)。使用来自Promega(Madison，WI)的TNTTM快速配对转录/转译系统产生35S-标记的FKBP 12.6。使用[3H]里安娜碱结合来定量RyR2水平。将100μg微粒体稀释在100μl 10-mM的咪唑缓冲液(pH 6.8)中，在37℃下用250-nM(终浓度)[35S]-FKBP 12.6培养60分钟，然后500μl冰冷的咪唑缓冲液猝灭。样品在100,000g下离心10分钟，在咪唑缓冲液中洗涤3次。用沉淀粒的液体闪烁计数来测定结合[35S]-FKBP 12.6的量。
实施例5——免疫印迹如上所述，在室温下进行微粒体(50μg)的免疫印迹法1h，用抗-FKBP12/12.6(1∶1,000)、抗-RyR(5029；1∶3,000)(Jayaraman等人，FK506 binding protein associated with the calcium release channel(ryanodine receptor).J.Biol.Chem.，2679474-77，1992)，或抗-磷RyR2(P2809；15,000)(Reiken等人，Beta-blockers restore calciumrelease channel function and improve cardiac muscle performance inhuman heart failure.Circulation，1072459-66，2003)。P2809-磷表位特异性抗-RyR2抗体是亲和力-纯的多克隆兔抗体，是使用肽CRTRRI-(pS)-QTSQ由Zymed实验室(旧金山，CA)定做的，它响应Ser2809处的RyR2PKA-磷酸化。用HRP-标记的抗-兔IgG(1∶5,000稀释度；Transduction Laboratories，Lexington，KY)培养以后，使用ECL(Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)使印迹显像。
实施例6-单通道记录如之前所述，在0mV的电压钳条件下，获得来自小鼠心脏的天然RyR2或重组RyR2的单通道记录(Marx等人，PKA phosphorylationdissociates FKBP 12.6 from the calcium release channel(ryanodinereceptor)defective regulation in failing hearts.Cell，101365-76，2000)。用于通道记录的对称溶液是反隔室-HEPES，250mmol/L；Ba(OH)2，53mmol/L(在某些实验中，用Ca(OH)2代替Ba(OH)2)；pH7.35；以及顺隔室-HEPES，250mmol/L；Tris-碱，125mmol/L；EGTA，1.0mmol/L；以及CaCl2，0.5mmol/L；pH 7.35。除非另外说明，在顺隔室中存在150-nM[Ca2+]和1.0-mM [Mg2+]下进行单通道记录。将里安娜碱(5mM)应用于顺隔室以证实所有通道的同一性。使用Fetchan软件(Axon Instruments，Union City，CA)，从数字化电流记录中分析数据。所有数据都表示成平均数±SE。使用非配对Student′s t检验进行实验之间平均值的统计对比。认为p＜0.05的值是统计学显著的。
JTV-519对RyR2通道的影响列在图1-3和表1(如下)中。如图3中所证明，单通道研究显示，PKA磷酸化(D)以后，RyR2的开放概率增加了，与在特异PKA抑制剂PKI5-24(C)存在下的PKA磷酸化相比。在JTV-519(E)的存在下，在用FKBP 12.6培养的PKA-磷酸化RyR2中，单通道功能被正常化了。幅度组织图(右边)显示在PKA-磷酸化RyR2中增加的活性和亚传导孔，但用JTV-519和FKBP 12.6处理以后就没有了。图3F显示在JTV-519的存在下，用FKBP 12.6培养PKA-磷酸化RyR2将RyR2激活的Ca2+-依赖性向右位移，使它类似于非磷酸化通道的Ca2+-依赖性。
表1运动前、运动过程中、运动后和注射肾上腺素的动态ECG数据。
用JTV-519处理的(n＝8)或对照(n＝6)FKBP 12.6+/-小鼠，和用JTV-519处理的(n＝5)FKBP 12.6-/-小鼠的动态ECG数据总结。SCL＝窦性周期长度；HR＝心率；ms＝毫秒；bpm＝每分钟心搏次数；FKBP 12.6+/-＝FKBP 12.6杂合小鼠；FKBP 12.6-/-＝FKBP 12.6缺陷小鼠。
实施例7——1，4-苯并噻氮中间体和JTV-519的合成对于体内实验来说，发明人需要克数量的JTV-519。然而，经由报道的1，4-苯并噻氮中间体，7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮(以下方案1中的化合物6)制备该化合物的最初尝试没有成功。该中间体的硫代基团很容易被空气氧化成二硫化物，这使得环化产物(5)的合成不可能。为了克服这一问题，发明人开发了从容易获得且便宜的2-硝基-5-甲氧基苯甲酸(1)开始的新方法。该方法描述于以下方案1中。
使用H2连同Pd/C作为催化剂，还原化合物(1)的硝基，以定量产率生成2-氨基-5-甲氧基苯甲酸(2)。用NaNO2使化合物(2)重氮化，然后用Na2S2处理，得到80％产率的稳定的二硫化物(3)。不经进一步纯化，用SOCl2处理稳定的二硫化物(3)，然后与2-氯乙胺在Et3N的存在下反应，生成90％产率的酰胺(4)。用三甲基膦和Et3N的THF溶液回流，化合物(4)经由单-罐操作转化为环化化合物(5)。然后用LiAlH4还原环化酰胺(5)生成7-甲氧基-2，3，4，5-四氢-1，4-苯并噻氮(6)。
方案1 将化合物(6)与3-溴丙酰氯反应，然后使4-苄基哌啶与所得产物反应，制备JTV-519。用1H NMR确立JTV-519的结构。
实施例8——放射标记的JTV-519的合成发明人合成放射标记的JTV-519的新方法描述在以下方案2中。为了制备放射标记的JTV-519，使用BBr3使JTV-519在苯环上脱甲基化，生成酚化合物(21)。在碱(NaH)的存在下，用放射标记的甲基化剂(3H-硫酸二甲酯)使酚化合物(21)再次甲基化，生成3H-标记的JTV-519(方案2)。
方案2 虽然出于清楚和理解的目的，已经相当详细地描述了上述发明，然而本领域技术人员通过阅读公开内容将可以理解，在不背离本发明在所附权利要求书中的准确范围的情况下，可以作出形式和细节的各种改变。
权利要求
1.限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的方法，它包括对患者施用有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量的JTV-519，所述患者是运动引起的心律失常的候选者。
2.权利要求1的方法，其中通过降低患者中磷酸化RyR2水平，限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低。
3.权利要求1的方法，其中所述患者是人。
4.权利要求1的方法，其中所述患者患有儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)。
5.权利要求1的方法，其中JTV-519有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量是JTV-519有效治疗或预防患者中运动引起的心律失常的量。
6.权利要求5的方法，其中JTV-519治疗或预防患者中运动引起的心律失常。
7.权利要求1的方法，其中JTV-519有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量是JTV-519有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量。
8.权利要求7的方法，其中JTV-519预防患者中运动引起的心源性猝死。
9.权利要求1的方法，其中JTV-519有效限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的量是约5mg/kg/天到约20mg/kg/天。
10.JTV-519在限制或预防患者中RyR2-结合的FKBP 12.6水平降低的方法中的应用，所述患者是运动引起的心律失常的候选者。
11.治疗或预防患者中运动引起的心律失常的方法，它包括以有效治疗或预防患者中运动引起的心律失常的量对所述患者施用JTV-519。
12.权利要求11的方法，其中所述心律失常与儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)有关。
13.权利要求11的方法，其中所述患者是运动引起的心源性猝死的候选者。
14.权利要求11的方法，其中JTV-519有效治疗或预防患者中运动引起的心律失常的量是约5mg/kg/天到约20mg/kg/天。
15.JTV-519在治疗或预防患者中运动引起的心律失常的方法中的应用。
16.预防患者中运动引起的心源性猝死的方法，它包括以有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量对所述患者施用JTV-519。
17.权利要求16的方法，其中所述运动引起的心源性猝死与儿茶酚胺能多形性室性心动过速(CPVT)有关。
18.权利要求16的方法，其中JTV-519有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量是约5mg/kg/天到约20mg/kg/天。
19.鉴定用于预防运动引起的心源性猝死的物质的方法，它包括以下步骤(a)获得或产生包含RyR2的细胞的培养物；(b)使所述细胞与候选物质接触；(c)将所述细胞暴露于一种或多种已知增加细胞内RyR2磷酸化的条件下；并且(d)测定该物质是否限制或预防细胞内RyR2-结合的FKBP 12.6水平的降低。
20.权利要求19的方法，它还包括以下步骤(e)测定该物质是否对细胞内RyR2相关的生物学事件有影响。
21.用权利要求19的方法鉴定的物质。
22.预防患者中运动引起的心源性猝死的方法，它包括以有效预防患者中运动引起的心源性猝死的量对患者施用权利要求21的物质。
23.鉴定用于预防运动引起的心源性猝死物质的方法，它包括以下步骤(a)获得或产生包含RyR2的动物；(b)对所述动物施用候选物质；(c)将所述动物暴露于一种或多种已知增加细胞内RyR2磷酸化的条件下；并且(d)测定该物质是否限制或预防动物中FKBP 12.6结合RyR2水平的降低。
24.权利要求23的方法，它还包括以下步骤(e)测定该物质是否对动物中RyR2相关的生物学事件有影响。
25.用权利要求23的方法鉴定的物质。
26.合成具有下式结构的化合物的方法 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，并且其中R可以位于2、3、4或5位，所述方法包括以下步骤(a)用重氮化试剂和二硫化物处理具有下式结构的化合物 其中R如上定义，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(b)用氯化物和氯乙胺处理步骤(a)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(c)在四氢叶酸的存在下，用还原剂和碱处理步骤(b)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(d)用还原剂处理步骤(c)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义。
27.权利要求26的方法，其中步骤(a)中的重氮化试剂是NaNO2。
28.权利要求26的方法，其中步骤(a)中的二硫化物是Na2S2。
29.权利要求26的方法，其中步骤(b)中的氯化物是SOCl2。
30.权利要求26的方法，其中步骤(c)中的还原剂是三甲基膦(PMe3)。
31.权利要求26的方法，其中步骤(c)中的碱是三乙胺。
32.权利要求26的方法，其中步骤(d)中的还原剂是是LiAlH4。
33.权利要求26的方法，其中具有下式结构的步骤(a)中的化合物 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，并且其中R可以位于2、3、4或5位，是通过包括以下步骤的方法合成的(e)在任选催化剂的存在下，用还原剂处理具有下式结构的化合物 其中R如上定义，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义。
34.权利要求33的方法，其中步骤(e)中的还原剂是H2。
35.合成具有下式结构的化合物的方法 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，并且其中R可以位于2、3、4或5位，所述方法包括以下步骤(a)用重氮化试剂和二硫化物处理具有下式结构的化合物 其中R如上定义，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(b)用氯化物和氯乙胺处理步骤(a)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(c)在四氢叶酸的存在下，用还原剂和碱处理步骤(b)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(d)用还原剂处理步骤(c)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义；(e)用3-溴丙酰氯和具有下式结构的化合物处理步骤(d)中生成的化合物 生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义。
36.权利要求35的方法，其中具有下式结构的步骤(a)中的化合物 其中R＝OR′、SR′、NR′、烷基或卤化物，并且R′＝烷基、芳基或H，并且其中R可以位于2、3、4或5位，是通过包括以下步骤的方法合成(f)在任选催化剂的存在下，用还原剂处理具有下式结构的化合物 生成具有下式结构的化合物 其中R如上定义。
37.合成具有下式结构的化合物的方法 所述方法包括以下步骤(a)用重氮化试剂和二硫化物处理具有下式结构的化合物 生成具有下式结构的化合物 (b)用氯化物和氯乙胺处理步骤(a)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (c)在四氢叶酸的存在下，用还原剂和碱处理步骤(b)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (d)用还原剂处理步骤(c)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物
38.权利要求37的方法，其中具有下式结构的步骤(a)中的化合物 是通过包括以下步骤的方法合成的(e)在任选催化剂的存在下，用还原剂处理具有下式结构的化合物 生成具有下式结构的化合物
39.合成具有下式结构的化合物的方法 所述方法包括以下步骤(a)用重氮化试剂和二硫化物处理具有下式结构的化合物 生成具有下式结构的化合物 (b)用氯化物和氯乙胺处理步骤(a)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (c)在四氢叶酸的存在下，用还原剂和碱处理步骤(b)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (d)用还原剂处理步骤(c)中生成的化合物，生成具有下式结构的化合物 (e)用3-溴丙酰氯和具有下式结构的化合物处理步骤(d)中生成的化合物 生成具有下式结构的化合物
40.权利要求39的方法，其中具有下式结构的步骤(a)中的化合物 是通过包括以下步骤的方法合成的(f)在任选催化剂的存在下，用还原剂处理具有下式结构的化合物 生成具有下式结构的化合物
全文摘要
本发明提供了限制或预防患者中RyR2－结合的FKBP 12.6水平降低的方法，治疗或预防患者中运动引起的心律失常的方法，和预防患者中运动引起的心源性猝死的方法。还提供了JTV－519在这些方法中的应用。本发明还提供了鉴定用于预防运动引起的心源性猝死的物质的方法，以及用该方法鉴定的物质。还提供了通过施用这些物质，预防运动引起的心源性猝死的方法。另外，本发明提供了合成JTV－519、放射标记的JTV－519、以及1，4－苯并噻氮中间体和衍生物的方法。
文档编号G01N33/53GK1886122SQ200480034608
公开日2006年12月27日 申请日期2004年10月4日 优先权日2003年10月7日
发明者A·R·马克思, D·W·兰德里, S·X·邓, Z·Z·程 申请人:纽约市哥伦比亚大学理事会