专利名称：生物样本成分检测法以及其装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种正确检测荧光标记生物样本的的方法，特别是不会出现因意外杂质等引起的错误结果的方法，此外，涉及一种正确地测量扩增DNA等时的样本溶液的荧光的方法以及用于此方法的装置。
背景技术：
DNA、蛋白质等的分析技术在包括基因分析、基因诊断等医学、生物学领域十分重要。特别是最近，使用DNA微阵(或者称为DNA芯片等)、蛋白芯片等，进行检查分析的方法以及装置十分引人注目。微阵使用玻璃等基板，将其划分成多个(数百～数千万个)区域，在各个区域固定目标(通常，种类不同)DNA等的探针，使各个区域成为微小的反应区域。通过使检测体与其反应，检测体中的目标DNA、蛋白等与上述固定的探针结合并被捕捉，被定量测量。对于该DNA微阵的各个反应区域内所捕捉的目标DNA的荧光标识所发出的荧光强度的读取，使用通常被称为扫描器的显微镜(共聚焦荧光显微镜)这样的装置(例如，参照特开2002-310886号公报)。该装置将激光等激发光照射在阵列上，使用干涉滤光器等分光元件将产生的荧光与激发光分离，并由光检测器检测荧光强度，定量·定性比较捕捉的DNA、蛋白等。
就DNA等靶标核酸的检测·定量而言，已知除微阵之外，也使用微板、微管等，在扩增同时进行实时荧光检测(参照特开2002-189860号公报)。
在使用微阵进行荧光检测中，杂质的附着成为大问题。因为附着有杂质的部分的荧光强度不是正确的值，所以需要将其从测定值中删除。通常，微阵的点的大小为直径100微米左右，因为杂质的大小多小于等于数微米，所以通过在点内即使存在1个杂质也只将此部分的信号删除，能够根据剩余区域的荧光强度进行该点的荧光检测。微阵向更高密度化的方向发展，正在变得比点的直径还小。但是，当点变小时，其与杂质的大小的差异消失，以上述手段进行测定变得困难。关于基板的瑕疵也相同。
特开2002-310886号公报公开了并用来自样本的荧光和激发光的反射光测定样本性状的方法。
一般也采取使用容器一边进行扩增，一边进行荧光检测的方法。通常，将微板、微管等作为反应容器兼检测容器。此外WO03/059484号公报记述了在能够旋转的弹药筒状结构体中，具备捕捉血液等样本液中的DNA、病毒RNA等的捕捉部和将各种试剂分别保存的试剂保存部，以及通过由旋转产生的离心力进行试剂液输送的提取检测模块(以下，记为离心模块)。本模块为如果安置了血液等样本，能够在模块内进行全部反应以及检测，而对外部污染的可能性非常小的有效的装置。
但是，无论在上述哪个文献中都没有显示判断样本产生的荧光是否是在纯粹正常的状态下检测的。
发明内容
检测工序也在与反应相同的容器中进行的方法简单。很多情况，样本液中应该检测的目标成分(DNA、病毒RNA等)是微量的，在从样本液提取目标成分后，通常，使用PCR法或者恒温扩增法等方法扩增，通过荧光检测进行测定。提取后，在进行扩增反应时无论使用哪种方法都需要加热反应液。此时，因为由反应液的蒸发等引起的反应液的减少、因结露引起的水滴的形成，可能会对荧光测定给予不正确的结果。此外，由于不使用阀门而是通过离心力进行试剂液的输送，所以也可以想到，因液体的状态、模块的状态而无法将液体保存在规定的位置的情况。该情况需要正确地判定测定样本液的有无以及量和状态。
本发明的目的为提供解决上述问题，在杂质等附着，样本液减少、消失等异常状态时识别异常，不对目标样本的定量结果产生影响，且精度高的生物样本成分检测方法。
为解决上述课题，本发明提供以下的生物样本成分检测方法以及生物样本检测装置。
首先，本发明提供一种生物样本成分检测方法，其是在光检测区域捕捉生物样本成分，检测来自该光检测区域的荧光，定量测定该目标生物样本成分的生物样本成分检测方法，其特征在于，以用荧光体标识该生物样本成分以及实质上与该生物样本成分相同的成分，并将用于激发该荧光体的激发光照射在光检测区域，将从光检测区域发出的光至少分离为多个波段检测，该多个波段中的一个波段实质上是与激发光成分相同的波段，将与激发光成分相同的波段与预先确定的规定的强度范围进行比较，当为超过该强度范围的强度时，判定该光检测区域的荧光测定是否恰当。
而且，提供在上述生物样本成分检测方法中，以上述光检测区域实质上为在平面状的基板上形成的反应区域为特征的生物样本成分检测方法。此外，提供在上述生物样本成分检测方法中，以在该光检测区域内，进行扩增反应后或者在进行扩增反应的同时连续进行光检测为特征的生物样本成分检测方法。而且，提供在上述生物样本成分检测方法中，以将生物样本负载于DNA芯片、DNA微阵以及蛋白芯片的任意一种为特征的生物样本成分检测方法。而且，提供在上述生物样本成分检测方法中，以将生物样本负载在微孔板的孔中为特征的生物样本成分检测方法。
本发明提供的生物样本成分检测装置，其特征在于，具备配置在旋转圆盘上的光检测区域；将多种液体分别保存的多个试剂保存部；具有能够通过离心力使该液体移动的具有流路的弹药筒(カ一トリツジ)状结构体；检测该液体发出的荧光以及从其周边发出的散射光的光测定部；和根据该光测定部的信号判定该光检测区域的荧光测定是否恰当的装置。
通过荧光检测测定目标生物样本成分。在荧光检测中具备将用于激发荧光体的激发光照射在微阵(DNA，蛋白)或者微板、微管、离心模块的规定的光检测部的装置，和将从光检测区域发出的光至少分离为多个波段检测的单元，该多个波段中的一个波段实质上是与激发光成分相同的波段，检测激发光成分的光强度，与预先确定的规定的强度(阈值)进行比较。预先已确定的规定的强度是以样本容器以及样本液正常时的激发光成分的光强度测定的结果为基础乘以安全系数而设定的值，是通常不超过的值。
测定强度为超过阈值的强度时，则判定该光检测区域的荧光测定不恰当。此外，在上述光检测区域，可以在进行扩增反应之后测定，也可以一边进行扩增反应，一边进行实时荧光检测，进行上述判定。扩增反应的各种方式都能够适用。优选的是在恒温下进行的方式，其简单，容易实施。
作为本发明其他实施方式的生物样本分析装置，其特征在于，具备能够控制旋转的旋转圆盘；配置在该旋转圆盘上的光检测区域；配置在旋转圆盘上的保存试剂的试剂保存部；配置在该旋转圆盘上的通过离心力能够将上述试剂向上述光检测区域移动的流路；检测从该光检测区域发出的光的光测定部；和根据该光测定部的信号显示该光检测区域中的上述样本的状态的显示装置。
此外，上述显示装置在上述光检测装置中有结露产生时，能够显示样本的测定状态为异常状态的意旨。而且，上述显示装置在上述光检测装置中样本比规定值减少时，也能够显示样本的测定状态为异常状态的意旨。此外，上述显示装置在上述光检测装置中样本偏心时，能够显示样本的测定状态为异常状态的意旨。
本发明通过在荧光测定侧检测激发波长成分的强度，能够判定样本的异常，能够进行高精度的荧光检测。
图1a是表示在本发明使用的分析装置的离心圆盘的结构的立体图。
图1b是表示设置在图1a圆盘上的离心模块的结构的平面图。
图2a是使用了实施方式1的生物样本成分检测法的分析装置的外观立体图。
图2b是图2a的分析装置的侧剖图。
图3是图2a，图2b的分析装置的控制框图。
图4表示光学检测系统的例子的部分剖面概略图。
图5是实施方式1的向离心模块的光照射状态的放大图。
图6是表示实施方式1的荧光测定的切换滤光器的特性的图。
图7是实施方式1的分析装置的分析操作顺序图。
图8是实施方式1的荧光检测工序顺序图。
图9是说明实施方式1的使用离心模块的试剂液等的移动工序的流程图。
图10a是表示实施方式1的正常情况的光检测结果的图。
图10b是表示实施方式1的测定值异常时的光检测结果的示例图。
图10c是表示实施方式1的测定值为其他异常时的光检测结果的示例图。
图11是实施方式2的光学检测部的结构图。
图12是实施方式2的检测工序流程图。
图13是实施方式3的光学检测部的结构图。
图14是实施方式3的光检测部件的构成图。
图15是实施方式3的另外一个例子使用的光检测部件的图。
图16是实施方式4的光学测部的构成图。
图17是实施方式4的光检测部件的构成图。
图18是表示实施方式4的光检测结果的示例图。
图19是实施方式5的荧光测定装置的结构图。
图20是实施方式5的荧光测定装置的其他的主要部位的结构图。
图21是实施方式1的测定显示画面的例子。
图22是实施方式6的光学检测部的概略结构图。
图23是实施方式6的光学部件以及检测部件的结构图。
具体实施例方式
实施例1首先，对在本发明中使用的离心模块的操作进行说明。在图1a以及图1b中表示在本发明中使用的离心型化学分析模块的重点结构。图1b表示具有规定的分析流路结构的组合模中的一个组合模或者离心模块13中的一个离心模块，在实际分析时，将多个图1所示的模块13例如4至12个通过嵌合设置在图1a所示的托盘12上。离心模块13，例如为PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)制。离心模块13可以是一次性的。
图1b中，将各种试剂保存在微型容器207、208、209、210、211中，其上面用树脂薄膜封闭。操作人员将全血分注在全血容器200中，在使圆盘旋转时由于离心力全血移动到外周侧，根据密度差分离为血球成分201和血浆成分202。
毛细管203从保存血浆成分的容器202分支出来，暂时形成返回内周侧的结构。因此，血浆无法超过毛细管。
停止旋转时，由于毛细流动血浆完全注满毛细管203。再次使圆盘转动时，血浆从毛细管流出。因为毛细管的出口较之入口(从血浆容器分支的部分)位于外周，所以通过虹吸效果毛细管的血浆全部流出。此时，当在第1试剂容器207的封闭薄膜上开通气孔时，试剂从容器207流出与血浆混合。可以在打算供给试剂的时刻，在使圆盘旋转之前的即刻开通气孔。
第1试剂与血浆充分反应后停止圆盘旋转，并在第2试剂容器208的薄膜上开孔。再次使圆盘旋转，试剂流入反应容器将反应容器内的液体赶出，经由结合过滤器204流入回收容器205。结合过滤器204由玻璃纤维构成，核酸被捕捉在玻璃表面。进而，使第3、第4试剂从容器208、209流出，洗净附着在玻璃纤维上的核酸。通过结合过滤器204的液体流入回收容器205，从回收容器下游的虹吸管流出。将包含核酸的洗提液保存在回收容器205中。将使用过的试剂、洗净液从回收容器送入废弃液容器206中。
图2a中表示使用本发明的生物样本成分检测法的分析装置的整体图。图2a为外观立体图，图2b为其侧剖图，图3为其控制方框图。分析装置10具备离心用发动机11；托盘12，其通过发动机11维持在可旋转状态；和离心模块13，其被定位于托盘12内部并被保持，通过离心发动机11的旋转能够在托盘12的内部进行提取·反应。此外，具有圆盘压盖14，旋转时其用于稳定地保持离心模块13；圆盘定位用检测器15，用于正确地控制离心模块13的位置，即托盘12的旋转位置；和穿孔部件16，配置了用于控制离心模块13内的液体输送的穿孔针。而且，具备用于光检测的光学检测光照射·受光部17和光学检测部件18，以及进行数据的分析显示等的控制器PC19。此外，还需要托盘内的位置确定用指示器、用于托盘12温度调节的加热器等温调部件、控制电路和电源电路等，但在图2a，图2b内省略。
根据图3中表示的控制方框图，图2a、图2b的装置。首先，通过在控制器PC301中输入测定条件，分析开始，根据分析装置10内的控制CPU302进行各种控制。在控制部中有发动机控制部303、光检测控制部306、穿孔控制部305和温度控制部304。发动机控制部303控制发动机、转速传感器、定位传感器和异常检测传感器(发动机温度、转速异常等)，根据CPU302的指示使发动机以指定的转速、加速·减速时间旋转，通过离心力进行离心模块13内液体的输送。
图3中的穿孔控制部305控制用于推出收纳在穿孔部件16内的多个穿孔针的发动机。通过推出指定位置的针，在离心模块13内指定的试剂口的树脂薄膜上开孔，通过离心力输送该试剂液。此外，在该动作之前需要通过发动机控制部确定托盘12、离心模块13的位置，在该位置确定后进行上述操作。
温度控制部304调节离心模块13或者托盘12的温度，通过众所周知的方法控制紧贴离心模块的加热器4和温度传感器(没有图示)、设置在收纳托盘12的旋转槽内的加热器以及冷却器和温度传感器。光检测控制部控制光源、光检测器、滤光器切换用发动机、滤光器识别传感器、遮蔽用光阀和异常检测用传感器(光源灯关闭等)数据输送部，测定发光强度。
图4是光学检测部的整体结构图。图5是向离心模块进行照射的光照射部的放大图。在图4中表示了离心模块的光检测区域3(提取/测定瓶)、光学检测光照射接收光部17和光学检测部件18的一部分(离心模块参照WO03/059484号公报)。在图5中，离心模块13的光检测区域3(提取/测定瓶)下部用透明的凹状材料覆盖，上部用透明薄膜2覆盖，形成适当容量空间，而成为光测定用小室的结构。在该空间中保存测定试剂液5进行光检测。在测定试剂液5中，例如混合有提取的RNA与用于扩增检测的试剂。
用于扩增的试剂，使用众所周知的NASBA法的全套试剂。用于检测的探针，使用众所周知的在寡聚核苷酸上结合荧光报告色素与荧光淬灭色素，被调整为通过杂交产生荧光发光的探针。在此状态，通过外部加热器4调节，使反应液为41℃，进行荧光测定。即使不同的扩增法也能够同样地执行。此时，试剂的种类、温度等依据各种扩增法设定。
光学检测光照射接收光部17设置在离心模块的近旁，接收向离心模块的照射的光与荧光等，光学部件18包含除此之外的光源、分光、光检测等，进行目标光强度的测定，两者由光纤连接。将激光源或者水银灯等激发光源20的光通过透镜21、激发光照明用单色化滤光器22、分色镜部件23和物镜25导入光纤26(NA＝0.22，芯径400μm)。光纤26的另一端设置在光学检测光照射接收光部17上，通过透镜28将光聚集在光检测区域(提取/测定瓶)3。将透镜28、光纤26位置可调地固定在托架27上，此外，托架整体具有XYZ移动功能，使其能够向光检测区域(提取/测定瓶)3的位置正确地进行光照射。
由光检测区域(提取/测定瓶)3内的测定样本液5产生的荧光(包含散射光、反射光等)通过透镜28进行聚光，并经由光纤26导入光学检测部件18。
荧光等再次由物镜25进行分光，由分色镜模块23、荧光测定用切换滤光器24筛选需要的光成分，通过透镜29进行聚光，由检测器进行检测。此次，作为检测器使用分光器30和CCD线形传感器(line sensor)31。计量每个波长分割的光强度，将该数据经由控制部件32发送给控制器PC19进行处理。
图6是荧光测定用切换滤光器6的一个例子。通常，一般使荧光测定用切换滤光器为具有尽可能不透过激发光那样特性的滤光器，(例如激发波长透过率小于等于0.0001％，荧光波段透过率大于等于80％)。在图4、图5中，通过线形传感器同时进行分光，检测激发波长成分与荧光波长成分。因此，如图6，为透过一部分激发光成分，使激发波长透过率为0.1％左右，荧光波段透过率为大于等于80％的特性。一般从荧光体发出的荧光强度(因为荧光体浓度低于1nM左右)非常弱，散射光强度与其相比十分大，所以在此种状态下强度比大无法由同一检测器进行测定。此外，现有的滤光器将散射光成分滤掉，无法监视散射光强度。因此，希望使用如同现有滤光器6那样的滤光器进行设定，以使应该观测的荧光的强度与标准的散射光强度为大体相同的强度等级。
图7为分析装置的操作顺序的流程图。基本上通过与专利文献1相同的方法进行。首先，在离心模块的规定位置注入检测体，安装在托盘上。以规定的转速、旋转时间旋转·停止圆盘，分离血浆。其后，通过按规定的顺序分别导入需要的试剂(包含洗净液)，提取病毒RNA等目标成分。为了将1号试剂导入1号模块，通过发动机使托盘旋转，调整1号模块的位置，在1号试剂的位置将封装薄膜穿孔。将该操作分模块进行。
其后，以规定的转速、旋转时间旋转·停止圆盘，使1号试剂移动并混合。通过进行与需要的试剂数相等次数的此操作，在光检测区域(提取/测定瓶)提取目标成分。其后，以同样的操作注入并混合扩增用试剂1(初始剂)，转移到扩增检测工序。首先，将光检测区域(提取/测定瓶)部加热到65℃，然后进行冷却降到小于等于40℃。定位，并将扩增用试剂2(酶液)储藏部的薄膜穿孔，该操作分模块进行。以规定的转速、旋转时间旋转·停止圆盘，混合酶液等，通过加热到41℃并维持此温度，引起扩增反应。在荧光检测工序中测定此扩增状态。
图8为分析装置的检测工序顺序的流程图。按指定的光计量时间间隔t1反复进行测定，测定经过的时间。设总的测定时间为t0。通常t0设定为60分至90分左右，t1设定为0.5分左右。调整1号模块的位置，测定荧光。在本实施方式中，假设2种作为荧光检测对象的荧光体(例如FAM、ROX)，表示激发波长分别为2种(例如，480nm和590nm)的情况。通过滤光器BOX切换器33切换为BOX-A34a和BOX-B34b。
BOX-A34a和BOX-B34b各自具备激发光照明用单色光化滤光器22a以及22b，分色镜模块23a以及23b，和荧光测定用切换滤光器24a以及24b，能够以不同的激发波长进行荧光测定。因此，通过滤光器BOX切换器33切换为BOX-A34a进行光检测，然后切换为BOX-B34b进行光检测。这些操作分模块进行。以t1时间间隔，总共持续t0时间的该动作。
图9是使用图1b中表示的一个离心模块，说明试剂液的移动状态的图。说明扩增工序中的液体移动·反映状态。该图只图示了说明部分，其他的部分则被省略。在光检测区域(提取/测定瓶)部，通过提取工序正在提取目标成分。此外，试剂A，试剂B瓶中分别封装有扩增反应检测用试剂(图9(a))。使用穿孔部件在试剂A的封装薄膜上开孔(图9(b))。通过旋转，由于离心力试剂A内的试剂移动到光检测区域(提取/测定瓶)部，并被混合(图9(d))。将光检测区域(提取/测定瓶)部加热到65℃，保持5分钟然后冷却到小于等于40℃。
通过穿孔部件在试剂B的薄膜上开孔。通过旋转，由于离心力试剂B内的试剂移动到光检测区域(提取/测定瓶)部，并被混合(图9(i))。通过将光检测区域(提取/测定瓶)部加热到41℃并维持在该温度，能够引起扩增反应。
图10a，图10b以及图10c是通过以上的操作得到的光检测结果的例子。荧光报告色素使用FAM寡聚核苷酸。使用通透470～490nm的滤光器作为激发光的单色化滤光器，使用特别定制的滤光器(也可以由GG495色玻璃滤光器代替)作为荧光测定用切换滤光器。利用CCD线形传感器31能够检测350～700nm的光，但是在本实施方式中取用470～490nm带(激发光波长成分)的强度以及530～540nm带(荧光体荧光波长成分)的强度作为数据。
图10a(a)表示维持在41℃之后，每0.5分钟得到的信号强度的测定结果的图。按经过时间的顺序，依(离心模块号，检测波长，经过时间(每0.5分钟的次数))＝(1，1，0)，(1，2，0)，(2，1，0)，(2，2，0)，…，(5，1，1)，(5，2，1)，(6，1，1)，(6，2，1)，….的序号得到检测信号强度。
图10a(b)是只提取任意离心模块的信号的图，表示时间变化。I(λ11，λ12，t)表示荧光波长成分的强度，I(λ11，λ11，t)表示激发光波长成分的强度。图10b(a)是正常检测时的变化，随着时间的推移扩增反应开始，荧光增大。此时，激发光波长成分的强度几乎没有变化，也无超过阈值的情况。大约进行10次正常状态下的激发光波长成分的强度检测，将它们的平均值±6σ作为阈值。因为该值根据测定系统会有所变动，所以在改变条件时需要预先确定该值。
图10b(a)，(b)，(c)表示测定值异常时的光检测结果的经时变化。图10b(a)与通过加热试剂液而产生如同在图10b(b)的右侧表示的现象，并在容器内部或者容器壁产生气泡时的效果相当，或者与成为散射体的灰尘进入容器时的效果相当。荧光波长成分没有什么变化，但是激发光波长成分的强度处于波动，处于超过阈值的状态。图10b(b)是气泡等散射体变得极多的情况，荧光波长成分也异常地变化。图10b(c)为另外一个异常例。如同在图10b(c)右侧所示，为光检测区域(提取/测定瓶)部内的测定溶液的局部存在状态已经变化时的1个变化例。
如此，能够根据激发光波长成分的强度探测测定溶液中的散射体的形成。这些反应，反应本身无论哪个都相同，为原有的结果相同的反应，但是像以前那样，在只测定目标荧光体的波长成分时，如图10b(a)、(b)、(c)的I(λ11，λ12，t)图所示，有时得到强度即核酸浓度不相同的结果。通过同时监视激发光波长成分的强度，能够探测反应液的异常，防止出现错误的结果，和提高检测精度。
此外，形成水滴时，反应液体量减少，而引起反应试剂浓度上升。此时，这有可能成为阻碍扩增反应的重要因素。在本例中，也可以探测这样的异常。此外，即使在离心模块装置中存在变形，瑕疵等不好的状况时，由于因瑕疵而激发光波长成分的强度变大，因而能够同样地进行探测。
本例使用的探针为1种，但即使是多种探针也能够同样地实现。特别在激发波长为1种，目标荧光体为多个时，能够通过几乎相同的结构实现。在图10c(a)中为其他的异常例。散射光强度I(λ11，λ11，t)如图所示处于波动，其影响荧光强度I(λ11，λ12，t)，随着I(λ11，λ11，t)变大I(λ11，λ12，t)增大。因为I(λ11，λ11，t)对I(λ11，λ12，t)的影响大体一定，所以通过修正该影响，能够像图10c(b)那样只计算除去I(λ11，λ11，t)的影响后的荧光强度的部分，能够进行正确的测定。
图21是测定中的控制器PC19的测定画面的概略图。是设置6个离心模块测定后的一个例子。对每个离心模块划分窗口，将关于荧光强度变化的光检测结果的时间波形(与图10a(b)，图10b，图10c(a)相同的波形)以及每个离心模块的温度控制状态等测定结果实时地显示在(A)区域。(显示波形的种类由用户选择)在各个显示窗口的下部(B)具有各种信息显示窗口，显示模块号码、控制温度和实际温度等。此外，关于装置整体的状态，在其他的窗口显示经过时间、样本信息、转速和步骤数等信息。显示窗口内的显示数据除了显示如图中的荧光强度结果之外，还能够切换显示模块的温度经过(控制结果)的历史等。在如图10b(a)-(c)所示的结果的情况下，在相应的模块显示窗口内显示表示异常状态的「测定异常」「试剂液异常」等警告消息。此外，在全部模块异常时，显示是中断测定还是继续测定的消息窗口，具有由用户进行判断的功能。此外，在与图10c(a)相当的情况下，「执行补正？」的消息盒闪动，催促用户进行判断。此外，也将关于装置全体的信息在(C)区域显示。
另外，除了画面显示之外在用打印机打印结果时，在测定清单的相应试剂行中，追加输出「试剂液异常」等注释。在与图10c(a)相当的情况下，在附加「强度补正完成」的注释后，输出基于补正后的强度的结果。
实施例2图11为使用生物样本成分检测法的分析装置的另外的光学检测部39的结构图。荧光检测的方法与图4基本相同。作为光检测器使用光电倍增管40代替分光器和线形传感器来检测光强度，用AD转换器41放大光电倍增管的信号并进行AD转换，发送给控制部件32。为了用荧光测定用切换滤光器24a以及24b进行荧光分光，该滤光器使用具有通常用于荧光检测的特性的，具有尽可能不通透激发光之类特性的滤光器。在实施例1中表示的散射光等的检测，由另外的光学系统进行。如图所示，其方式为在离心模块的上部设置发光二级管(LED)42作为光源，用透镜43聚集该光，用透镜44聚集散射光等，用光电二极管进行检测发送给控制部件23。
因为未必需要散射光监测器严密地进行位置调整，所以通过从上面直接检测，能够得到大范围的观测区域，能够探测大范围的异常。此外，因为未必需要与激发波长相同，所以能够容易地设定为容易测定的波长。因为也不需要分光，所以调整简单，能够像上述那样简便地进行构筑。此外，如果形成通过另外的光学系统进行散射光测定和目标成分的光检测的结构，不仅仅是荧光，例如也可转为用光学发光进行测定，应用范围扩大。
图12是本实施例中的检测工序过程的流程图。相对于实施例1的过程，追加了与LED的光照射相关联的部分。因为存在2种光学系统，为了各自的光不相互影响，在用光电倍增管进行测定之前追加截断LED光的工序，在LED测定之前追加截断来自光源20的光的工序。
实施例3图13是与使用生物样本成分检测法的分析装置相关的另外的光学检测部的结构图。在使用2种荧光体时，设置独立检测各自荧光体的光检测部件。光检测部件46经由光纤47、透镜48，照射·检测某个离心模块内的光检测区域(提取/测定瓶)部。另外的光检测部件49经由光纤50、透镜51，照射·检测另外的离心模块内的光检测区域(提取/测定瓶)部。图14、图15表示光检测部件46、49的结构图。光检测部件46对应荧光体FAM，使用中心波长475nm的蓝色LED作为激发光源60。
将LED光经由透镜61、激发光照明用单色化滤光器62、分色镜模块63、和物镜65导入光纤47(NA＝0.22，芯径400um)中。由光纤接收到的荧光等再次由物镜65进行分光，由分色镜模块63、荧光测定用切换滤光器64筛选需要的光成分，由透镜66进行聚光，使用分光器67和CCD线形传感器68。计量每个波长分割的光强度，将该数据发送给控制部件32。
在光检测部件49，对应荧光体ROX，使用中心波长550nm的绿色LED作为激发光源70。将LED光经由透镜71、激发光照明用单色化滤光器72、分色镜模块73、和物镜75导入光纤50(NA＝0.22，芯径400um)中。由光纤接收到的荧光等再次由物镜75进行分光，由分色镜模块73、荧光测定用切换滤光器74筛选需要的光成分，由透镜76进行聚光，使用分光器77和CCD线形传感器78。计量每个波长分割的光强度，将该数据发送给控制部件32。
与实施例1相同地进行散射光的测定。在本例的情况下，在检测多个荧光体时，能够减少因切换滤光器而产生的时间损失，能够进行S/N好的测定。此外，因为不需要切换滤光器，所以能够进行一边使离心模块的托盘12以一定的速度旋转，一边在返回到规定的位置时进行光检测的连续测定，与反复进行旋转和停止的方式相比，操作容易，能够进行机械性稳定的测定。
实施例4对不通过光的散射，而是通过光的吸收测定溶液状态的方式进行说明。在扩增反应检测用的试剂中添加与荧光标识不同的，对荧光检测没有影响的色素溶液，与上述相同地执行扩增反应并进行测定。图16为使用生物样本成分检测法的分析装置的另外的光学检测部的结构图。是使用1种荧光体时的结构图。光检测部件39使用与实施例2相同结构的光检测部件。
经由光纤26、透镜28，照射某个离心模块13内的光检测区域(提取/测定瓶)部，与实施例2相同地进行荧光检测。而且，准备另外的光源部件80，透镜82、光纤83和光检测部件84，获得在另外的位置的离心模块内的光检测区域(提取/测定瓶)部的信息。图17为光检测部件的结构图。光源部件80通过透镜86和单色滤光器87以及微缝88对灯85的光进行分光，形成细光束，照射在离心模块内的光检测区域(提取/测定瓶)部内的测定溶液中，用透镜82将该透过光进行聚光，经由光纤导入光检测区域84。进而，经由透镜89、ND滤光器90由光检测器检测透过光强度，进行AD转化发送给控制部件。
单色滤光器的波长希望是显示添加的色素吸收极大的波长，但只要是有吸收的波长就不特别地限定。因此，如果由于蒸发等原因液量减少或是液体移动，透过光强度增大。此外，如果出现气泡，因散射透过光强度减弱。如此，通过监视透过光强度的变化能够把握液体的状态，探测异常。
表示通过上面的操作得到光检测结果的例子。图18为提取任意离心模块的信号的图，表示时间变化。I(λ11，λ12，t)表示目标荧光波长成分，I(λ31，λ31，t)表示测定溶液的透过光强度。图18(b)为正常检测时的变化，随着时间的推移发生扩增反应，荧光增大。此时，透过光强度几乎没有发生变化。与此相反，图18(a)表示测定值异常时的光检测结果的时间经过。
表示在扩增反应期间透过光强度增大，测定溶液移动，液体的厚度发生变化的情况。其结果是，荧光强度可看到，并且趋于减小。如此，通过同时监视透过光强度，能够探测反应液的异常，防止出现错误的结果，提高检测精度。特别是能够直接监视·定量液量，进行正确的判断。图18(c)为说明图18(b)的异常状态的图，表示由于离心力，瓶内的液体为像左图那样偏移的状态，但在测定期间落到了瓶的底部，使得测定条件改变的情况。
实施例5对测定DNA微阵的荧光的情况进行说明。图19表示本实施例的荧光测定装置的结构图。与第1实施例相同，将激光光源或水银灯等激发光源11的光经由透镜112，激发光照明用单色化滤光器113，分色镜模块114和物镜115，照射保持在XYZ载物台上的DNA微阵114。产生的荧光再次由物镜115进行聚光，经由分色镜模块114和荧光测定用切换滤光器116射入分光器117。
进入分光器117的光发生分光，由CCD线形传感器118进行检测，将该强度发送给数据处理部件119进行处理。DNA微阵141的扫描在XYZ载物台进行。也可不扫描激发光。此外，也能够通过二维照相机进行检测。此时，荧光测定用切换滤光器116、分光器117、CCD线形传感器118部分如图20那样进行变更。变更为激发波长成分检测用滤光器142、保持荧光体波长成分测定用滤光器143的滤光器转换器144和二维冷CCD相机145，用2种滤光器交互检测被均一照亮(未图示)的DNA微阵141的图像，可对每个像素判定激发光波长成分的强度。
在本实施例中，例如在微阵的基板上存在瑕疵时，得到和实施例1相同的效果。此外，在使用微阵的荧光测定中存在杂质附着成为大问题的情况。由于附着了杂质的部分的荧光强度不是正确的值，因此一般将该部分的信号从测定值中删除。由于附着了杂质的部分的信号强度的分布和无杂质的部分的信号强度的分布存在统计意义上的区别，所以能够删除。
但是，当微阵的点小到10微米左右时，点内的像素数量减少以至无法区别信号。即使在这时，本实施例也能够根据激发光波长成分的强度判断异常像素，提高测定精度。
实施例6对在多个位置检测判定测定溶液的状态的方式进行说明。与实施例4同样地在扩增反应检测用试剂中添加与荧光标识不同的、对荧光测定没有影响的色素溶液。散射的检测也能够同样地执行。
图22为分析装置的另外的光学检测部的结构图。用于荧光检测的光检测部件39使用与实施例4相同结构的光检测部件。经由光纤26、透镜28照射在某个离心模块13内的光检测区域(提取/测定瓶)部，与实施例4同样地进行荧光检测。
而且，为了探测离心模块的光检测区域部3内的试剂液5的状态，设置光源部件150以及光检测部件151。图中为光学部件的配置关系，使得在荧光检测时的离心模块的附近的离心模块的位置进行探测。由于旋转托盘12按顺序测定全部的离心模块，因此无论在哪个位置进行测定都没有问题。由于可以使离心模块的号码与荧光强度的测定结果、试剂液的状态探测结果相对应，因此无论在哪个位置进行测定都没有关系。
在图23中表示光源部件150和探测部件151的结构图。光源部件150由灯152、针孔153，透镜154、单色滤光器155和节流156构成，形成分光为离心模块的光检测区域部3的大小的或者比该大小稍宽的单色光，照射在光检测区域部3。
由探测部件151接收通过光检测区域部的测定溶液5等液体的光。即，由节流157、单色滤光器158、平面传感器159检测该透过光，进行AD转换发送给控制部件。
单色滤光器的波长希望是添加的色素吸收极大时的波长，但只要是存在吸收的波长就无特别地限定。如果蒸发等原因致使液量减少或是液体移动，则透过光强度增大。此外，如果出现气泡，则散射致使透过光强度减弱。如此，通过监视透过光的强度变化能够把握液体的状态，探测异常。
通过本结构，可以检测光检测区域部3内任意位置的光强度，了解该位置的透过率，推断液量。因此，能够判定光检测区域部3内的液体的分布，判定液体的偏移，以及由液体的蒸发引起的液量减少。液量减少时，如同在实施例1中记述的那样，通过在控制器PC的测定画面上显示『「液量异常」等』警告消息，能够探测反应液的异常，防止出现错误的结果，提高检测精度。特别是能够直接监视·定量液量。
此外，关于液体的偏移也进行同样的显示，由此能够防止出现错误结果。
此外，光源部件150和探测部件151的结构除了上述的结构之外，进行如下配置也能够实现用滤光器将面发光光线单色化，照射在离心模块的光检测区域部进行成像，将光检测区域部的像通过滤光器在平面传感器上成像并进行检测。而且，取代平面传感器，在成像位置配置线形传感器或者多个光检测器也能够实现。
此外，通过在多个位置检测散射光以及散射光的角度依存，来取代在多个位置接收透过光，能够判断液体的减少、结露的状态，防止出现错误结果。
权利要求
1.生物样本成分检测法，其是在光检测区域捕捉生物样本成分，检测来自该光检测区域的荧光，定量该目标生物样本成分的生物样本成分检测法，其特征在于，用荧光体标识该生物样本成分或者实质上与该生物样本成分相同的成分，将用于激发该荧光体的激发光照射在光检测区域，将从光检测区域发出的光至少分离为多个波段进行检测，该多个波段中的一个波段实际上是与激发光成分相同的波段，将与激发光成分相同的波段的光强度与预先确定的规定的强度范围进行比较，当为超过该强度范围的强度时，判定该光检测区域的荧光测定是否恰当。
2.根据权利要求1所述的生物样本成分检测法，其特征在于，上述光检测区域实质上为在平面状的基板面上形成的反应区域。
3.根据权利要求1所述的生物样本成分检测法，其特征在于，在该光检测区域内，在进行扩增反应之后或者在进行扩增反应的同时进行光检测。
4.根据权利要求1所述的生物样本成分检测法，其特征在于，将生物样本负载于DNA芯片、DNA微阵以及蛋白芯片中的任意种上。
5.根据权利要求1所述的生物样本成分检测法，其特征在于，将生物样本负载于微孔板的孔中。
6.生物样本成分检测装置，其特征在于，具备配置在旋转圆盘上的光检测区域；将多种液体分别保存的多个试剂保存部；具有通过离心力能够使该液体移动的流路的弹药筒状结构体；检测该液体发出的荧光以及从其周边发出的散射光的光测定部；以及根据该光测定部的信号判定该光检测区域的荧光测定是否恰当的装置。
7.根据权利要求6所述的生物样本成分检测装置，其特征在于，所述光检测区域是微孔板的孔。
8.生物样本分析装置，其特征在于，具备能够控制旋转的旋转圆盘；配置在该旋转圆盘上的光检测区域；配置在旋转圆盘上的保存试剂的试剂保存部；配置在该旋转圆盘上的通过离心力能够将上述试剂向上述光检测区域移动的流路；检测从该光检测区域发出的光的光测定部；以及根据该光测定部的信号显示该光检测区域中的上述样本的状态的显示装置。
9.根据权利要求8所述的生物样本分析装置，其特征在于，所述显示装置，当在上述光检测区域产生有结露时，显示试剂的测定状态为异常状态的意旨。
10.根据权利要求8所述的生物样本分析装置，其特征在于，所述显示装置，当在上述光检测区域试剂比规定值减少时，显示试剂的测定状态为异常状态的意旨。
11.根据权利要求8所述的生物样本分析装置，其特征在于，所述显示装置，当在上述光检测区域试剂偏移时，显示试剂的测定状态为异常状态的意旨。
全文摘要
在生物样本成分检测中，判定杂质的附着、试剂液的减少等异常状态，提供高精度的检测法。具有将从光检测区域发出的光至少分离为多个波段进行检测的单元，该多个波段中的一个波段实质上是与激发光成分相同的波段，检测激发光成分的光强度，与预先确定的规定的强度(阈值)进行比较。能够判定试剂的异常，实现高精度的荧光测定。
文档编号G01N37/00GK1680802SQ200510063538
公开日2005年10月12日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月9日
发明者高桥智 申请人:株式会社日立高新技术