利用抗－robo1抗体诊断和治疗癌症的制作方法

专利名称：利用抗－robo1抗体诊断和治疗癌症的制作方法
交叉引用本发明涉及用于诊断和治疗癌症的方法和用于监测肝炎恶化的方法，以及涉及细胞生长抑制剂和抗癌剂。
背景技术：
在果蝇的遗传筛选研究中，ROBO1已鉴定为调节轴突中线交叉的分子，并且在后来的研究中已报道作为用于裂隙蛋白(Slit protein)的受体而起作用(Kidd等，Cell，92，205-215，1998，Wang等，Cell，96，771-784，1999，Kidd等，Cell，96，785-794，1999，Brose等，96，795-806，1999)。此外，关于ROBO1和癌症之间的关系，在肺癌中，其中人ROBO1基因所在的染色体区域3p12为高度缺陷型的，而在乳腺癌和肾癌中，表达受到ROBO1启动子区域甲基化等等的抑制，显示肿瘤抑制基因可能性(Dallol等，Oncogene，21，3020-3028，2000)。实际上，气管上皮细胞增生已通过缺失位于ROBO1N-末端的第一个免疫球蛋白区域而在小鼠中观察到，其类似于肺癌患者中确定的ROBO1基因的最小缺陷(Xian J等，PNAS，98，15062-15066，2001)。此外，还报道ROBO1在癌新血管中表达，以及，其，在癌细胞侧面上作为ROBO1的配体的Slit2提高的表达诱导癌的新血管形成，逆向指导癌的生长(Wang等，Cancer Cell，4，19-29，2003)。
其间，根据作为ROBO1配体的Slit2基因表达也在许多癌症类型中受甲基化等等抑制的事实，以及通过强迫Slit2表达或通过提高Slit2在肺癌细胞、乳腺癌细胞和大肠癌细胞中观察到生长抑制作用以及凋亡诱导作用的事实，Slit2，其为ROBO1的配体，也认为是肿瘤抑制基因(Dallol等，Cancer Research，62，5874-5880，2002，Dallol等，CancerResearch，63，1054-1058，2003)。然而，在该报告中，实际上Slit2的细胞生长抑制作用通过哪个受体发生并不清楚，使得ROBO1和癌症之间的关系也不完全清楚。
在作为日本死亡主要原因的癌症死亡当中，原发肝细胞癌，2001年在男性中占据第三位(13％)而在女性中占据第四位(9.0％)，是一种具有预后不良的癌症类型(摘自″Population Dynamics Statistics″，Statistics and Information Department，Minster′s Secretariat，Ministry ofHealth，Labour[A3]和Welfare)。由于病毒感染慢性患者每年都在增长以及其中许多病例引起肝硬化，和随后引起肝细胞癌，对在从肝硬化至肝细胞癌的阶段早期的诊断方法以及对肝细胞癌的治疗存在非常强的需求，并且认为没有突破性的解决方法，则在未来的10至15年中死亡数量将有递增的趋势。
关于肝细胞癌诊断方法，在基于如GOP/GTP、碱性磷酸酶、白蛋白等等或肿瘤标志物AFP(α-甲胎蛋白)的血清值生化数据的综合评价以及诊断图象，如有必要，通过针刺活检取得少量组织碎片后，基于病理判断证实该诊断。目前，肿瘤标志物尤其用于肝细胞癌的诊断，并且虽然其中最常用的甲胎蛋白(AFP)的阳性率对肝细胞癌患者为6至7％，其有时对慢性肝病患者或怀孕女性也是阳性的。此外，虽然肝癌肿瘤标志物PIVKA-II的阳性率稍低于50％，对肝细胞癌的特异性认为高于AFP，使得目前实际上主要为这两种检查。不论那种情况，由于假阳性或双阴性情况的存在，期待具有高特异性的肿瘤标志物的存在。
通过针刺活检收集的样品的组织学检查为证实肝脏疾病诊断的重要检查。尤其，由于所收集的量可能是有限的，需要有更明确的诊断技术。期待开发针对肝癌-特异性表达的抗原的抗体，如允许不只是鉴定病理特征，而且从非-癌组织早期鉴定肝细胞癌。
在肝脏疾病诊断和监测的现状中转变至炎症、纤维化以及恶性转化经由多种标志物的检查和活检的检查而诊断。在许多肝癌患者中，从病毒感染转变至肝炎、慢性肝炎、肝硬化并且随后至肝癌。因此，允许进行肝脏疾病诊断和监测的方法的发展不仅在保健经济中，而且在减轻患者负担和获得准确的医疗指导中是有用的。
关于肝细胞癌的治疗，许多医疗设施主要集中在三种治疗上外科切除，经导管动脉栓塞术治疗和经皮乙醇注射治疗。各种方法都有利弊，并且即使选择经导管动脉栓塞术治疗，其具有相对广泛的应用范围和存活率的优点，目前认为完全治愈的比率在10％的水平，使得这种情况下对新治疗有着巨大需求。
虽然对肝细胞癌还没有临床场所的应用实例，在乳腺癌或淋巴瘤等等中，经由针对癌特异性肿瘤抗原的单克隆抗体的靶向治疗，响应速率已通过不同于化疗剂常规治疗的作用机理而得到提高。关于这些抗体药物的作用机理，利用经效应细胞的抗体依赖的细胞毒性(ADCC)或经补体的补体-依赖的细胞毒性(CDC)，以及通过该抗体本身功能的激动剂作用，或该抗体的中和能力。目前，由于分子治疗已在临床场所中开始应用，认为在将来对应用这些分子治疗以及针对靶向肿瘤特异性表达的分子的肝癌细胞的抗体药物治疗的期望是巨大的。
下列为相关的现有技术文献WO99/20764；WO98/48051；WO01/46697；WO03/29488；WO01/00828；WO01/57207；WO01/92581；WO02/04514；WO02/14500；WO02/29103。
概要本发明的目的为提供用于诊断和治疗癌症的新方法，以及新的细胞生长抑制剂和抗癌剂，并且此外提供用于诊断和监测肝脏疾病的方法。
本发明人发现ROBO1在癌细胞如肝细胞癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌、胃癌、脑肿瘤、大肠癌等等中高表达。此外，他们发现当测量抗-ROBO1抗体的补体-依赖的细胞毒性(CDC)时，该抗-ROBO1抗体具有针对表达ROBO1的细胞的CDC活性。其间，他们发现血液中ROBO1的浓度随着肝脏疾病的恶化而提高。根据上述观察，本发明人发现抗-ROBO1抗体在ROBO1的表达提高的癌症，首先为肝细胞癌的诊断、预防和治疗中的有效性，并且此外发现用于诊断和监测肝脏疾病的方法，而完成本发明。
本发明提供了以ROBO1蛋白的检测为特征的癌症诊断方法。在本发明的方法中，优选检测ROBO1蛋白的胞外区。此外，本发明的方法优选利用识别ROBO1蛋白的抗体进行。优选在本发明的中，检测血液、血清或血浆中的ROBO1蛋白或分离自细胞的ROBO1蛋白。
在另一个方面，本发明提供癌症的诊断方法，包括下列步骤(a)从受试者收集样品的步骤和(b)检测包含在所收集样品中的ROBO1蛋白的步骤。
在另一个方面，本发明提供用于诊断癌症的试剂盒，包含结合ROBO1蛋白的抗体。优选，癌症为肝细胞癌。此外优选在本发明的试剂盒中，抗体为结合ROBO1蛋白胞外区的抗体。
在另一个方面，本发明提供包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的药物组合物。此外，本发明提供包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的细胞生长抑制剂。此外，本发明提供包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的抗癌剂。优选，结合ROBO1的抗体为具有细胞毒性的抗体。此外，优选癌症为肝细胞癌。
此外在另一个方面，本发明提供用于治疗由异常的细胞生长引起的疾病的方法，包括将包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的药物组合物施予需要治疗的患者。此外本发明提供用于治疗癌症的方法，包括将包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的药物组合物施予需要治疗的患者。优选，癌症为肝细胞癌。
在另一个方面，本发明提供通过将表达ROBO1的细胞与结合ROBO1的抗体接触而诱导引入表达ROBO1的细胞的细胞损伤的方法。此外，本发明提供通过将表达ROBO1的细胞与结合ROBO1的抗体接触而抑制表达ROBO1的细胞的生长的方法。优选，结合ROBO1的抗体为具有细胞毒性的抗体。此外优选，表达ROBO1的细胞为癌细胞。
此外在另一个方面，本发明提供结合ROBO1并且具有针对表达ROBO1的细胞的细胞毒性的抗体。
此外在另一个方面，本发明提供用于监测肝炎恶化的试剂盒，包含抗-ROBO1抗体。优选该抗-ROBO1抗体为特异性识别ROBO1的抗体。优选本发明的试剂盒预测从肝炎或肝硬化至肝癌的转变。在优选的方面，本发明的试剂盒包含固定于支持物上的第一抗-ROBO1抗体和用标记物标记的第二抗-ROBO1抗体。
此外在另一个方面，本发明提供用于监测肝炎恶化的方法，其测量检验样品中的ROBO1。优选，检验样品中的ROBO1利用抗-ROBO1抗体测量。优选该抗-ROBO1抗体为特异性识别ROBO1的抗体。此外优选检验样品为血液、血清或血浆。优选本发明的监测方法预测从肝炎或肝硬化至肝癌的转变。在优选的方面，本发明的监测方法利用固定于支持物上的第一抗-ROBO1抗体和用标记物标记的第二抗-ROBO1抗体进行。


图1显示利用基因芯片U133的ROBO1基因表达分析的结果。图1a正常组织/非-癌部位中的ROBO1基因表达分析；图1b临床样品中的ROBO1基因表达分析；图1c-癌细胞系中的基因表达分析；
图2显示利用基因芯片U95的ROBO1基因表达分析的结果。
图3显示通过全长ROBO1基因的瞬时表达的COS7细胞和HEK293细胞裂解物Western分析的结果，以及其培养物上清的Western分析的结果；图4显示在肝癌细胞系裂解物中利用抗-ROBO1单克隆抗体A7241A的Western分析结果；图5显示对肝细胞癌石蜡制备物利用抗-ROBO1单克隆抗体A7241A的免疫组织染色分析的结果；图6显示对患者血清中可溶的ROBO1利用抗-ROBO1单克隆抗体A7261A的Western分析结果；图7显示在强制表达全长ROBO1基因的HEK293细胞裂解物中利用sROBO1免疫的兔血清的Western分析结果；图8显示在强制表达全长ROBO1基因的HEK293细胞裂解物中利用sROBO1免疫的兔血清的FACS分析结果；图9显示在HepG2细胞裂解物中利用sROBO1免疫的兔血清的FACS分析结果；图10显示利用兔抗-sROBO1抗体的酶免疫分析的ROBO1测量的标准曲线；图11显示ROBO1浓度和肝脏疾病严重程度之间的相互关系；图12显示肝脏疾病患者ROBO1浓度的变化；图13显示抗-ROBO1抗血清针对表达ROBO1-的HEK293细胞的CDC活性的测量结果；图14显示抗-ROBO1单克隆抗体针对表达ROBO1的HEK293细胞的CDC活性的测量结果；图15显示抗-ROBO1单克隆抗体针对表达ROBO1的Alexander细胞的CDC活性的测量结果；和图16显示抗-ROBO1单克隆抗体针对表达ROBO1的HEK293细胞的ADCC活性的测量结果。
详细说明本发明的方法通过ROBO1蛋白的检测表征。ROBO1(Roundabout1)为轴突指导受体蛋白，其氨基酸序列和编码其的基因序列已以变体1的GenBank ID NM_002941(SEQ.ID9和10)和变体2的GenBankID NM_133631(SEQ.ID11和12)公开。本发明中，ROBO1蛋白用来包括全长蛋白质和其片段。片段为包含ROBO1蛋白质任何区域的多肽，并且可能不具有天然ROBO1蛋白的功能。片段的实例不受限制，并且可引用包含ROBO1蛋白胞外区的片段。ROBO1蛋白的胞外区相当于SEQ.ID11氨基酸序列中的1-859位。此外，跨膜区域相当于SEQ.ID11氨基酸序列中的860-880位(Sundaresan，等，Molecular andCellular Neuroscience 11，29-35，1998)。
本发明中，在肝细胞癌中发现ROBO1的表达以非常高的频率在基因水平和蛋白质水平得到促进。此外，根据临床样品和其他癌种类癌细胞系的分析，表达得到促进的可能性不仅在肝细胞癌中，而且在肺癌、乳腺癌、子宫癌、胃癌、脑肿瘤、大肠癌等等中呈现。另外，显示利用ROBO1的特异性单克隆抗体的免疫组织诊断是可能的。另外，发现ROBO1在体内发生脱落(shedding)排出，以及可溶的ROBO1(sROBO1)存在于癌症患者的血液中。也就是说，sROBO1可用作为癌症的血清诊断标志物。
ROBO1的检测虽然本发明中检测的ROBO1蛋白优选为人ROBO1蛋白，任何ROBO1都是可以的，而没有限制，如犬ROBO1、猫ROBO1、小鼠ROBO1和仓鼠ROBO1。
本发明中，检测包括定量或非-定量检测，并且例如非-定量检测的实例包括仅关于ROBO1蛋白是否存在的测量，关于给定量或更多量的ROBO1蛋白是否存在的测量，ROBO1蛋白量与其他样品(例如，对照样品等)的量相比的测量等等，而定量检测的实例包括ROBO1蛋白浓度的测量，ROBO1蛋白量的测量等等。
虽然检验样品不受特别限制，只要其为可能包含ROBO1蛋白的样品，但优选收集自活生物体如哺乳动物的样品，并且更优选收集自人的样品。具体的检验样品实例包括例如，血液、间质组织液体、血浆、血管外液体、脑脊液、滑膜液、胸膜液、血清、淋巴、唾液、尿等等，优选血液、血清或血浆。另外，本发明的检验样品也包括获自例如细胞培养液的检验样品的样品，这些细胞收集自活生物体。
所诊断的癌症并不特别受限制且可以是任何癌症，并且具体地可引用肝癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌、乳腺癌、肾癌、脑肿瘤、子宫癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤等等。优选肝癌，尤其优选肝细胞癌。
本发明中，当在检验样品中检测ROBO1蛋白时，如果测定检验样品中检测的ROBO1蛋白的量与阴性对照或健康受试者相比很大，该受试者确定为患有癌症或具有发展癌症的高可能性。
另外，肝脏疾病的恶化可通过测量肝脏疾病患者的ROBO1蛋白浓度而监测。
通过由细胞释放并且存在于血液中的ROBO1蛋白的检测表征的诊断方法可引用作为本发明诊断方法的优选方式。尤其优选包含存在于血液中的ROBO1蛋白胞外区的片段的检测。
虽然用于检测检验样品中包含的ROBO1蛋白的方法并无特别的限制，优选通过利用抗-ROBO1抗体的免疫方法的检测。免疫方法的实例包括例如，放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法、发光免疫测定法、免疫沉淀方法、免疫比浊法、蛋白质印迹、免疫染色、免疫扩散法等等，优选酶免疫测定法，并且尤其优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)(例如，夹心ELISA)。上述免疫方法，如ELISA，可由本领域技术人员根据熟知的方法进行。
例如，通过将抗-ROBO1抗体固定于支持物上，添加检验样品至此，进行温育以使抗-ROBO1抗体和ROBO1蛋白结合，随后进行洗涤，并且检测通过抗-ROBO1抗体结合至支持物的ROBO1蛋白而检测检验样品中ROBO1蛋白的方法可用作利用抗-ROBO1抗体的常规检测方法。
本发明中用于固定抗-ROBO1抗体的支持物的实例可包括例如，不溶的多糖如琼脂糖和纤维素，合成树脂如硅树脂、聚苯乙烯树脂、聚丙烯酰胺树脂、尼龙树脂和聚碳酸酯树脂，以及不溶的支持物如玻璃。这些支持物可以如珠或平板的形式利用。在珠的情况下，可利用用此珠填充的柱等。在平板的情况下，可利用多孔平板(96-孔多孔平板等)，生物传感器芯片等等。关于抗-ROBO1抗体与支持物的结合，通过通常利用如化学键或物理吸附方法的结合是可能的。市场上可买到的支持物可用于所有这些支持物。
抗-ROBO1抗体和ROBO1蛋白的结合通常在缓冲溶液中进行。例如，磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液溶液、柠檬酸缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液等等用作缓冲溶液。另外，关于温育条件，在经常使用的条件例如4℃至室温下进行1小时至24小时的温育。温育后的洗涤可以是任意的，只要其不阻止ROBO1蛋白和抗-ROBO1抗体的结合，并且例如使用含有表面活性剂如Tween20等的缓冲溶液。
在本发明的ROBO1蛋白检测方法中，除检验样品外可设立对照样品，检验样品中需要ROBO1蛋白的检测。对照样品的实例包括不含有ROBO1蛋白的阴性对照样品以及包含ROBO1蛋白的阳性对照样品等。在这种情况下，可通过与从不含ROBO1蛋白的阴性对照样品获得的结果以及从含有ROBO1蛋白的阳性对照样品获得的结果作比较而在检验样品中检测ROBO1蛋白。另外，可制备具有浓度变化梯度的一系列对照样品，获得作为数值的每一对照样品的检测结果，构建标准曲线，并且基于标准曲线，根据检验样品的数值定量检测检验样品中含有的ROBO1蛋白。
利用用标记物标记的抗-ROBO1抗体的方法可用作检测通过抗-ROBO1抗体结合至支持物的ROBO1蛋白的优选方式。例如，检验样品与固定在支持物上的抗-ROBO1抗体接触，并且洗涤后利用特异性识别ROBO1蛋白的标记的抗体进行检测。
抗-ROBO1抗体的标记可通过通常已知的方法进行。本领域技术人员熟知的标记物质可用作标记物，如荧光染料、酶、辅酶、化学发光物质和放射性物质，并且具体的实例包括放射性同位素(32P、14C、125I、3H、131I等等)、荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形酮、萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根过氧化酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、微过氧化物酶、生物素等等。当利用生物素作为标记物时，添加生物素化的抗体后，优选进一步添加与酶如碱性磷酸酶偶联的亲和素亲和素蛋白。众所周知的方法可用于标记物和抗-ROBO1抗体的结合，如戊二醛方法、马来酰亚胺方法、吡啶基二硫化物方法和高碘酸方法。
具体地，含有抗-ROBO1抗体的溶液添加至支持物如平板以将抗-ROBO1抗体固定在支持物上。洗涤平板后，其用例如BSA、明胶、白蛋白等封闭以阻止蛋白质的非特异性结合。再次洗涤平板，将检验样品添加至该平板。温育后，洗涤该平板，并且添加标记的抗-ROBO1抗体。在充分温育后，洗涤平板并且检测保留在平板上的标记的抗-ROBO1抗体。检测可通过本领域技术人员熟知的方法进行，并且例如在通过放射性物质标记的情况下，检测可通过液体闪烁或RIA方法进行。在通过酶标记的情况下，添加底物并且可利用光度计检测到该底物的酶催化修饰例如颜色。具体的底物实例包括2，2-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、1，2-苯二胺(邻苯二胺)、3，3’，5，5’-四甲苯(TMB)等等。在荧光物质的情况下检测可利用分光荧光计。
利用生物素-标记的抗-ROBO1抗体和亲和素蛋白的方法可用作本发明ROBO1蛋白检测方法的特别优选的方式。
具体地，含有抗-ROBO1抗体的溶液添加至支持物如平板以将抗-ROBO1抗体固定在支持物上。洗涤平板后，用例如BSA、胶质、白蛋白等封闭以阻止蛋白质的非特异性结合。再次洗涤平板，检验样品添加至该平板。温育后，洗涤该平板，并且添加生物素化的抗-ROBO1抗体。充分温育后，洗涤平板，并且添加与酶如碱性磷酸酶或过氧化物酶偶联的亲和素蛋白。温育后，洗涤平板，添加对应于偶联至亲和素蛋白的酶的底物，并且用作为指示的该底物的酶催化修饰等检测ROBO1蛋白。
利用一种或多种特异性识别ROBO1蛋白的一抗以及一种或多种特异性识别一抗的二抗的方法可用作本发明ROBO1蛋白检测方法的另一种方式。
例如，检验样品与固定在支持物上的一种或多种抗-ROBO1抗体接触，温育后洗涤，并且用一抗-ROBO1抗体以及特异性识别该一抗的一种或多种二抗检测洗涤后结合的ROBO1蛋白。在这种情况下，二抗优选用标记物标记。
利用凝集反应的检测方法可用作本发明ROBO1蛋白检测方法的另一种方式。在所述的方法中，可利用带有致敏的抗-ROBO1抗体的载体检测ROBO1。任何载体可用作使该抗体致敏的载体，只要其不溶，不引起非特异性的反应，并且是稳定的。例如，可利用乳胶颗粒、皂土、火棉胶、高岭土、固定的绵羊红细胞等等，优选利用乳胶颗粒。例如，聚苯乙烯胶乳颗粒、苯乙烯-丁二烯共聚物乳胶颗粒、聚乙烯基甲苯乳胶颗粒等等可用作乳胶颗粒，优选利用聚苯乙烯胶乳颗粒。致敏的颗粒与样品混合并且搅拌规定的持续时间。由于样品中含有的抗-ROBO1抗体浓度越高颗粒的凝集程度越大，可通过直接观察凝集而检测ROBO1。另外，通过用分光光度计等测量由凝集引起的混浊的检测也是可能的。
利用例如使用表面胞质团共振现象的生物传感器的方法可用作本发明ROBO1蛋白检测方法的另一种方式。利用表面胞质团共振现象的生物传感器可利用少量蛋白并且未标记，以表面胞质团共振信号实时观察蛋白质之间的相互作用。例如，ROBO1蛋白和抗-ROBO1抗体的结合可利用生物传感器如BIAcore(由Amersham Biosciences制造)检测。具体地，检验样品与传感器芯片接触，其中已固定抗-ROBO1抗体，并且结合抗-ROBO1抗体的ROBO1蛋白可以作为共振信号的变化而检测。
本发明的检测方法还可以利用各种自动检测装置而自动化，其允许一次进行大量样品的检测。
本发明的另一个目的是提供检测检验样品中ROBO1蛋白用于癌症诊断的的诊断药物或试剂盒；而该诊断药物或试剂盒包含至少一种抗-ROBO1抗体。如果该诊断药物或试剂盒以EIA方法如ELISA方法为基础，可包括使抗体固相的载体，并且该抗体可预结合至载体。如果该诊断药物或试剂盒以利用载体如乳胶的凝集方法为基础，则可包括带有吸附的抗体的载体。另外，该试剂盒可适当包含封闭溶液、反应溶液、反应终止溶液、处理样品的试剂等等。
抗-ROBO1抗体的制备只要用于本发明的抗-ROBO1抗体特异性结合ROBO1蛋白就可以，而不管其来源、类型(单克隆的、多克隆的)和其形态。具体地，可利用熟知的抗体如小鼠抗体、大鼠抗体、人抗体、嵌合抗体和人源化抗体。虽然抗体可以是多克隆抗体，优选单克隆抗体。
用于本发明的抗-ROBO1抗体可利用众所周知的方法制备为多克隆或单克隆抗体。尤其是，源自哺乳动物的单克隆抗体优选作为用于本发明的抗-ROBO1抗体。源自哺乳动物的单克隆抗体包括通过杂交瘤产生的，以及通过经遗传工程方法用含有抗体基因的表达载体转化的宿主产生的。
产生单克隆抗体的杂交瘤基本上可利用熟知的技术以下列方式制备。即，可通过利用ROBO1作为致敏性抗原，按照常规免疫方法免疫此，通过常规的细胞融合方法用众所周知的亲本细胞融合获得的免疫细胞，并且通过常规的筛选法筛选产生单克隆抗体的细胞而制备。
具体地，只要如下制备单克隆抗体就可以。首先，通过表达以GenBank登录号BF059159(NM_133631)公开的ROBO1基因/氨基酸序列而获得用作致敏性抗原以获得抗体的ROBO1。即，在将编码ROBO1的基因序列插入熟知的表达载体系统并且转化合适的宿主细胞后，通过众所周知的方法从该宿主细胞内或从培养物上清内纯化目的人ROBO1蛋白。此外，也可纯化和利用天然的ROBO1。
然后，纯化的ROBO1蛋白用作致敏性抗原。或者，来自ROBO1的部分肽也可用作致敏性抗原。在这种情况下，部分肽可根据人ROBO1的氨基酸序列通过化学合成获得，或其也可以通过将部分ROBO1基因整合入表达载体并且表达而获得；此外，其也可以通过用蛋白酶分解天然的ROBO1而获得。用作部分肽的ROBO1的区域和大小不受限制。
虽然用致敏性抗原免疫的哺乳动物并不特别受限制，优选考虑和用于细胞融合的亲本细胞相容性的选择，并且通常使用啮齿类例如，小鼠、大鼠和仓鼠，或兔、猴等等。
致敏性抗原免疫动物按照众所周知的方法进行。例如，常规方法通过将致敏性抗原经腹膜内或皮下注射入哺乳动物而进行免疫。具体地，作为所需要的，合适量的常规佐剂，例如弗氏完全佐剂与稀释至合适量并且用PBS(磷酸缓冲盐水)、生理盐水等悬浮的致敏性抗原混合，并且在乳化后每4至21天数次给予哺乳动物。另外，用致敏性抗原免疫期间也可利用合适的载体。如果具有特别小分子的部分肽用作致敏性抗原，则免疫之前与载体蛋白如白蛋白和钥孔血蓝素偶联为合乎需要的。
以这种方法免疫哺乳动物并且证实血清中所想要的抗体水平提高后，从哺乳动物收集免疫细胞并且经过细胞融合，优选的免疫细胞尤其是脾细胞。
哺乳动物骨髓瘤细胞用作亲本细胞，其为待与上述免疫细胞融合的另一参与者。对于该骨髓瘤细胞，最佳利用多种众所周知的细胞系例如，P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)等等。
上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合可基本上按照众所周知的方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等等进行。
更具体地，上述细胞融合例如在常规营养培养溶液中存在细胞融合促进剂时进行。例如聚乙二醇(PEG)、日本血细胞凝集病毒(HVJ)等等用作融合促进剂，并且此外依照要求也可添加佐剂如二甲亚砜并且用于提高融合效率。
所用的免疫细胞和骨髓瘤细胞比例可任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞免疫细胞优选为1至10倍。可利用用于细胞融合的培养液，例如RPMI1640培养液和MEM培养液，其最适用于骨髓瘤细胞系的生长，此外可利用用于这类细胞培养物的常规培养液；另外也可结合利用血清液替换物如胎牛血清(FCS)。
关于细胞融合，规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，并且以通常30至60％(w/v)的浓度添加预热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量范围1000至6000)以及随后混合以形成目的融合细胞(杂交瘤)。然后，通过重复连续添加合适培养液的操作以及通过离心除去上清，除去杂交瘤生长不想要的细胞融合剂等。
以这种方法获得的杂交瘤通过在常规选择培养液中培养而选择，例如HAT培养液(包含次黄嘌呤、氨基喋呤和脱氧胸腺嘧啶核苷的培养液)。上述HAT培养液中的培养持续足以使除了杂交瘤外的细胞(未融合的细胞)死亡(通常，几天至几个星期)的一段时间。随后，进行常规的极限稀释法，并且进行筛选和单克隆化产生目的抗体的杂交瘤。
要注意的是识别ROBO1的抗体的制备也可利用国际公开WO03/104453中所述的方法制备。
对于目的抗体的筛选和单克隆化，进行以熟知的抗原抗体反应为基础的筛选法就可以了。例如，抗原可结合至载体，如由聚苯乙烯制成的珠或市场上可买到的96-孔微量滴定板，并且与杂交瘤培养物上清反应，并且在洗涤载体后酶标记的二抗等可进行反应以确定与致敏性抗原反应的目的抗体是否包含在培养物上清中。产生目的抗体的杂交瘤可通过极限稀释法等克隆。在这种情况下，利用用于免疫的抗原作为抗原就足够了。
此外，除了将抗原免疫非人动物并且获得上述杂交瘤外，还可能在体外使人淋巴细胞对ROBO1致敏，将致敏淋巴细胞与具有永久分裂能力的人源骨髓瘤细胞融合，并且获得具有结合ROBO1的活性的所需人抗体(参考日本专利公开No.H1-59878)。此外，用作抗原的ROBO1可给予具有人抗体基因库整体的转基因动物以获得产生抗-ROBO1抗体的细胞，并且从因其永生化而产生的细胞获得抗ROBO1的人抗体(参考国际公开WO94/25585、WO93/12227、WO92/03918和WO94/02602)。
以这种方法制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在常规培养液中传代培养，并且另外可在液氮中保存很长时间。
为了从杂交瘤获得单克隆抗体，采用根据常规方法培养杂交瘤，以及该抗体作为其培养物上清而获得的方法，或杂交瘤给予到与其相容的哺乳动物并且在该动物中生长，以及该抗体作为其腹水而获得的方法。前者方法适合于获得高纯度的抗体，相反后者方法适合于抗体的大规模生产。
本发明中，通过从杂交瘤克隆抗体基因，整合该基因至合适的载体，导入构建体至宿主，并且利用重组技术产生的重组抗体可用作单克隆抗体(例如，参考Vandamme，A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775，1990)。具体地，从产生抗-ROBO1抗体的杂交瘤分离编码抗-ROBO1抗体可变(V)区的mRNA。关于mRNA的分离，通过熟知的方法制备总RNA，例如胍超速离心方法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC方法(Chomczynski，P.等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等等，并且利用mRNA纯化试剂盒(由Pharmacia制造)等制备目的mRNA。另外，也可利用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(由Pharmacia制造)直接制备mRNA。
从获得的mRNA，利用逆转录酶合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成利用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(由SeikagakuCorporation制造)等进行。另外，利用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(由Clontech制造)的5’RACE方法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002，Belyavsky，A.等，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919-2932)和PCR等可用于进行cDNA的合成和扩增。
从获得的PCR产物纯化目的DNA片段并且与载体DNA连接。另外，从其制备重组载体，导入大肠杆菌等，并且选择菌落以制备所想要的重组载体。随后，目的DNA的碱基序列通过熟知的方法验证，例如双脱氧核苷酸链终止方法等。在获得编码目的抗-ROBO1抗体V区的DNA后，整合入含有编码所想要的抗体恒定区(C区)DNA的表达载体中。
为了制造用于本发明的抗-ROBO1抗体，抗体基因整合入表达载体以使其在表达调控区例如增强子和启动子的控制下表达。然后，用该表达载体转化宿主细胞以表达抗体。
关于抗体基因的表达，编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA可分别整合入表达载体中并且共转化宿主细胞，或编码H链和L链的DNA可整合入单独的表达载体中并且转化宿主细胞(参考国际公开WO94/11523)。
当抗体基因暂时分离并且导入合适的宿主以制备抗体时，可使用合适的宿主和表达载体的组合。当利用真核细胞作为宿主时，可利用动物细胞、植物细胞和真菌细胞。已知的动物细胞为(1)哺乳动物细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa和Vero，(2)两栖动物细胞，例如爪蟾卵母细胞，或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等等。已知的植物细胞为烟草属的，例如源自Nicotiana烟草的细胞，其能进行愈伤组织培养就可以。已知的真菌细胞为酵母，例如酵母属，如酿酒酵母(Saccharomyces serevisiae)，丝状真菌，例如曲霉属(Aspergillus genus)，如黑曲霉(Aspergillus niger)等等。利用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产系统。已知的细菌细胞为大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌。目的抗体基因通过转化导入这些细胞，通过体外培养转化的细胞获得抗体。
另外，对于重组抗体的产生，不仅可利用上述的宿主细胞而且可利用转基因动物。例如，抗体基因插入在乳汁中特异性产生的蛋白质(山羊β酪蛋白等等)的基因中间并且作为融合基因制备。含有该具有插入抗体基因的融合基因的DNA片段注射入山羊胚胎中，并且胚胎导入雌性山羊。从接受了胚胎的山羊产下的转基因山羊或其后代产生的乳汁中获得所想要的抗体。另外，为了使从转基因山羊产生的含有所想要的抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等，Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
本发明中，为了降低针对人的异种抗原性等，可利用人工改变的重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体等。这些改变的抗原可利用已知的方法制造。嵌合抗体为包括来自人以外的哺乳动物，例如小鼠的抗体重链可变区和轻链可变区以及来自人抗体的重链恒定区和轻链恒定区的抗体，并且可通过将编码小鼠抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，整合入表达载体，并且导入宿主和通过宿主产生而获得。
对于嵌合抗体和人源化抗体的C区，利用来自人抗体的C区，例如可利用用于重链的Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4，以及用于轻链的Cκ和Cλ。另外，人抗体的C区可经修饰以改良抗体或提高其生产的稳定性。
嵌合抗体包括来自人以外哺乳动物来源的抗体的可变区以及源自人抗体的恒定区。其间，人源化抗体包括来自人以外哺乳动物来源的互补决定区，以及源自人抗体的框架区和C区。由于在人体中降低的抗原性，人源化抗体作为本发明治疗剂的有效成分是有效的。
人源化抗体亦称改造的人抗体，是将人以外的哺乳动物，例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)移植入人抗体的互补决定区后形成的抗体，其所用的常规重组技术也是已知的。具体地，通过PCR法由末端含有重叠部分而产生的多种寡核苷酸合成设计为能连接小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区(FR)的DNA序列。获得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，然后整合入表达载体，并且导入宿主和通过宿主表达以获得抗体(参考欧洲专利EP239400和国际公开WO96/02576)。
选择通过CDR连接的人抗体框架区以使互补决定区形成良好的抗原结合位点。根据需要，可取代抗体可变区中框架区的氨基酸以使改造的人抗体的互补决定区形成合适的抗原结合位点(Sato，K.等，Cancer Res，1993，53，851-856)。
另外，获得人抗体的方法也是已知的。例如，还可以用所想要的抗原或表达所想要的抗原的细胞体外致敏人淋巴细胞，将致敏的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞，例如U266融合，并且获得具有结合该抗原活性的所需人抗体(参考日本专利公开No.H1-59878)。另外，具有人抗体基因完整库的转基因动物可用所需抗原免疫以获得所需的人抗体(参考国际公开WO93/12227、WO92/03918和WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096和WO96/33735)。另外，通过淘洗(panning)利用人抗体文库获得人抗体的技术也是已知的。例如，通过噬菌体展示方法将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)表达在噬菌体表面上，可选择结合该抗原的噬菌体。编码结合该抗原的人抗体可变区的DNA可通过分析所选择的噬菌体的基因而确定。如果结合抗原的scFv的DNA序列已知，可产生合适的表达载体的序列，并且获得人抗体。这些方法为大家所熟知，并且可参考国际公开WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438和WO95/15388。
用于本发明的抗体不限于完整的抗体分子，只要其结合ROBO1，可以是来自抗体或其修饰体的片段，并且包括二价抗体和单价抗体。例如，抗体片段的实例包括Fab、F(ab’)2、Fv、具有一个Fab和完整Fc的Fab/c，或具有与合适的接头连接的重链或轻链的Fv的单链Fv(scFv)。
抗体片段或者通过用酶，例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶处理抗体以产生抗体片段，或者通过构建编码这些抗体片段的基因，并且导入表达载体，随后在合适的宿主细胞中表达(例如，参考Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976，Better，M.& Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496，Academic Press，Inc.，Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496，AcademicPress，Inc.，Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663，Rousseaux，J.等，Methods in Enzymology(1989)121，663-669，Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132137)。
scFv通过连接抗体H链的V区和L链的V区获得。该scFv中，H链的V区和L链的V区通过接头连接，优选肽接头(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，1988，85，5879 5883)。scFv中H链的V区和L链的V区可源自任何本说明书中作为抗体描述的那些。包括例如范围在3-25个残基的任何单链肽用作连接V区的肽接头。通过从编码上述抗体的H链或H链V区的DNA以及编码L链或L链V区的DNA中扩增，这些序列的全部或编码所需氨基酸序列的DNA部分用作模板，通过利用限定其两端的引物对，随后进一步结合和扩增编码肽接头部分的DNA以及限定其两端的引物对以使其可与每一H链和L链连接的PCR方法获得编码scFv的DNA。另外，一旦产生编码scFv的DNA，含有这些的表达载体以及由该表达载体转化的宿主可用常规方法获得；另外，scFv可用常规方法利用该宿主获得。这些抗体片段可由宿主通过获得和表达上述基因而产生。
连接至不同分子，如聚乙二醇(PEG)的抗体也可用作修饰的抗体。另外，细胞毒性物质如放射性同位素、化疗剂、源自细菌的毒素等等也可连接至该抗体。所述修饰的抗体可通过对获得的抗体进行化学修饰而获得。值得注意的是本领域中已建立了抗体的修饰方法。这些抗体也包括在本发明的“抗体”中。
另外，用于本发明的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以是具有识别ROBO1分子上不同表位的抗原结合位点，或识别ROBO1的一个抗原结合位点和识别细胞毒性物质如放射性物质、化疗剂或细胞来源的毒素的另一个抗原结合位点的双特异性抗体。在这种情况下，细胞毒性物质可直接对表达ROBO1的细胞起作用以特异性地对肿瘤细胞造成损伤并且抑制肿瘤细胞的生长。双特异性抗体可通过连接来自两种抗体的HL对而产生，或通过融合产生不同单克隆抗体的杂交瘤并且生成产生双特异性抗体的融合细胞而获得。另外，双特异性抗体还可通过遗传工程技术产生。
如上述构建的抗体基因可通过众所周知的方法表达并且获得。在哺乳动物细胞的情况下，可功能性地连接通常所用的有效启动子，所要表达的抗体基因，其3’侧下游的polyA信号，并表达。例如，人巨细胞病毒早早期启动子/增强子可用作启动子/增强子。
另外，本发明中所用的可用于抗体表达的其他启动子/增强子包括病毒启动子/增强子如来自逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)的或源自哺乳动物细胞如人延伸因子1α(HEF1α)的启动子/增强子等等。
当利用SV40启动子/增强子时基因表达可很容易地通过Mulligan等的方法进行(Nature(1979)277，108)，以及当利用HEF1α启动子/增强子时通过Mizushima等的方法进行(Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)。
在大肠杆菌的情况下，可功能性地连接通常所用的有效启动子，用于抗体分泌的信号序列和所要表达的抗体基因以表达该基因。例如，lacz启动子和araB启动子可用作启动子。当利用lacz启动子时可通过Ward等的方法(Nature(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)表达，或当利用araB启动子时通过Better等的方法(Science(1988)240，1041-1043)。
关于用于抗体分泌的信号序列，当生产是在大肠杆菌周质中时，只要利用pelB信号序列(Lei，S.P.等J.Bacteriol.(1987)169，4379)就可以。随后，分离在周质中产生的抗体后，在使用前适当重构(重新折叠)抗体结构。
关于复制起点，可利用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等等的那些；另外，表达载体可包含氨基糖苷类转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等等，作为选择性标记以扩增宿主细胞系统中的基因拷贝数。
任何表达系统，例如真核细胞或原核细胞系统可用于制造用于本发明中的抗体。例如，动物细胞如建立的哺乳动物细胞系统、昆虫细胞系统、丝状真菌细胞酵母细胞等等可用作真核细胞，并且例如，细菌细胞如大肠杆菌细胞可用作原核细胞。
优选，用于本发明的抗体在哺乳动物细胞中表达，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK、Vero或HeLa细胞。
然后，体外或体内培养转化的宿主细胞以产生目的抗体。宿主细胞的培养按照熟知的方法进行。例如，DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM可用作培养液，并且可结合利用血清补充液如胎牛血清(FCS)。
如上述表达和产生的抗体可通过用于常规蛋白质纯化的熟知的方法纯化。例如，抗体可通过适当地选择和组合亲和柱如Protein A柱、层析柱，过滤，超滤，盐析，透滤等等而分离和纯化(Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。
熟知的方法可用于抗体的抗原结合活性的测量(Antibodies ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。例如，可利用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光免疫等等。
药物组合物从另一个角度，本发明的特征为含有作为有效成分结合ROBO1的抗体的药物组合物。另外，本发明的特征为含有作为有效成分结合ROBO1的抗体的细胞生长抑制剂，尤其是抗癌剂。
本发明中，“含有作为有效成分结合ROBO1的抗体”指包含抗-ROBO1抗体作为主要的有效组分，并且并不限制抗-ROBO1抗体的含量比例。
本发明的细胞生长抑制剂中含有的抗体并无特别限制，只要其结合ROBO1。优选，其为特异性结合ROBO1的抗体，并且更优选其为具有细胞毒性的抗体。另外，用于本发明的抗体可以是具有修饰的糖链的抗体。众所周知抗体的细胞毒性可通过修饰糖链而提高。例如，具有修饰的糖基化的抗体(WO99/54342等等)，缺乏添加至糖链的岩藻糖的抗体(WO00/61739、WO02/31140等等)，具有对分(bisecting)GlcNAc的糖链的抗体(WO02/79255等等)等称为具有修饰的糖链的抗体。
关于本发明中的细胞毒性，可引用例如抗体-依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性、补体-依赖的细胞毒性(CDC)活性等等。本发明中，CDC活性指应归于补体系统的细胞毒性，ADCC活性指当抗体特异性附着至靶细胞的，即通过Fcγ受体结合其Fc部分的Fcγ受体载体细胞(免疫细胞等等)的细胞表面抗原时，对靶细胞造成损伤的活性。
抗-ROBO1抗体是否具有ADCC活性，或是否具有CDC活性可通过熟知的方法测量(例如，Current protocols in Immunology，Chapter7.Immunologic studies in humans，Editor，John E，Coligan等，Wiley &Sons，Inc.，(1993)等等)。
具体地，首先进行效应细胞、补体溶液和靶细胞的制备。
(1)效应细胞的制备从CBA/N小鼠等取出脾脏，并且在RPMI1640培养基中(GIBCO制造)分离脾细胞。在含有10％胎牛血清(FBS，HyClone制造)的相同的培养基中洗涤后，以5×106/ml的浓度制备细胞而制备效应细胞。
(2)补体溶液的制备幼兔补体(CEDARLANE制造)在含有10％FBS的培养基中(GIBCO制造)稀释10倍以制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备表达ROBO1的细胞(用编码ROBO1的基因转化的细胞，肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、大肠癌细胞等等)通过与0.2mCi的铬酸钠-51Cr(Amersham Pharmacia Biotech制造)一起在含有10％FBS的DMEM培养基中37℃培养一小时而经放射性标记。放射性标记后，细胞用含有10％FBS的RPMI1640培养基洗涤三次，以2×105/ml的浓度制备细胞而制备靶细胞。
然后，进行ADCC活性或CDC活性的测量。在ADCC活性测量的情况下，50μl每种靶细胞和抗-ROBO1抗体加至96-孔U底平板(Beckton Dickinson制造)，并且在冰上反应15分钟。此后，添加100μl效应细胞，并且培养在二氧化碳温箱中进行4小时。抗体的终浓度为0或10μg/ml。培养后，回收100ul上清，并且用γ粒子计数管测量放射性(COBRAIIAUTO-GMMA，MODEL D5005，Packard InstrumentCompany制造)。细胞毒性(％)可根据(A-C)/(B-C)×100确定，[其中A代表样品中的放射性(cpm)，B代表其中添加1％NP-40(Nakarai制造)的样品中的放射性(cpm)，并且C代表仅含有靶细胞的样品的放射性(cpm)。
其间，在CDC活性测量的情况下，50μl每种靶细胞和抗-ROBO1抗体加至96-孔平底平板(Beckton Dickinson制造)，并且在冰上反应15分钟。此后，添加100μl补体溶液，并且培养在二氧化碳温箱中进行4小时。抗体的终浓度为0或3μg/ml。培养后，回收100μl上清，并且用γ粒子计数管测量放射性。细胞毒性可以与ADCC活性测量同样的方式确定。
抗-ROBO1抗体抑制其增殖的细胞并无特别限制，如果其为表达ROBO1的细胞，并且优选癌细胞，且更优选肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、脑肿瘤细胞和大肠癌细胞。因此，抗-ROBO1抗体可以治疗和预防由细胞生长引起的疾病的目的而利用，所述疾病例如肝细胞癌、肺癌、乳腺癌、子宫癌、胃癌、脑肿瘤、大肠癌等等。
本发明的细胞生长抑制剂和抗癌剂的口服和肠胃外给药都是可行的，优选肠胃外给药，并且具体地，可引用注射剂的类型、鼻给药剂的类型、肺给药剂的类型、经皮给药的类型等等。作为注射剂类型的实例，全身或局部给药是可行的，例如通过静脉注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射等等。另外，可根据患者的年龄和症状适当选择给药方法。关于剂量，例如，其可选择在每次给药每公斤体重0.0001mg至1000mg的范围内。或者，例如剂量可选择在每一患者0.001至100000mg/体重的范围内。然而，本发明的治疗剂不限于这些剂量。
本发明的细胞生长抑制剂和抗癌剂可根据常规方法(例如，Remington’s Pharmaceutical Science，最新版，Mark Publishing Company，Easton，U.S.A)配制，并且还可包含医学上可接受的载体和添加剂。例如可引用表面活性剂、稀释剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲液、悬浮剂、等渗剂、结合物、崩解剂、润滑剂、流动性增进剂、调味剂等等，可适当利用其他常规使用的载体并且不限于这些。具体地，可引用轻的无水硅酸、乳糖、晶状纤维素、甘露糖醇、淀粉、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇缩乙醛二乙胺乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯硬蓖麻油60、白糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等等。
另外，本发明提供通过将表达ROBO1的细胞与结合ROBO1的抗体接触而在表达ROBO1的细胞中诱发损伤的方法或抑制细胞生长的方法。结合ROBO1的抗体为如上所述作为本发明细胞生长抑制剂中包含的结合ROBO1的抗体。由抗-ROBO1抗体结合的细胞无特别限制，只要该细胞表达ROBO1，优选癌细胞，更优选肝癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、子宫癌细胞、胃癌细胞、脑肿瘤细胞和大肠癌细胞。
本说明书中明确引用的所有专利和参考文献内容的全部在此引用作为本说明书的一部分。另外，日本专利申请No.2004-102862、2004-227899和2005-004024的说明书和附图内容的全部在此引用作为本说明书的一部分，其为用作本申请优先权基础的申请。
实施例本发明用下列实施例作进一步描述；然而这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例1每一癌症种类中ROBO1的mRNA表达分析1-1.利用基因芯片的ROBO1基因表达分析为了搜索癌细胞中表达被促进的基因，利用和检验表1中显示的通过利用ISOGEN(Nippon Gene制造)的常规方法从各种提取的组织制备的各种RNA以及总RNA。
表1.用于ROBO1基因表达分析的组织和细胞系基因表达分析利用上述总RNA的每种10ng进行，按照ExpressionAnalysis Technique Manual(Affymetryx制造)经GeneChip U-133(Affimetrix制造)分析。当搜查到具有对总基因设定100表达分值的平均值的基因时，其在癌细胞中表达提高，相比健康的肝脏(9.1)，很显然在中等-分化的肝细胞癌(236.4)中ROBO1mRNA(探针ID213194 at HG-U133A)显著提高26倍，以及在不充分-分化的肝细胞癌(563)中的显著提高62倍。另外，在大肠癌中ROBO1mRNA的表达也提高，相比健康大肠(21.4)，原发大肠癌的八例中五例具有两倍或更多的提高。另外，相比健康肝脏和大肠，大肠癌转移的肝癌七例中的三例也显著提高。另外，相比健康肺，ROBO1提高两倍或更多的一个病例也存在肺小细胞癌(图1a、b)。
癌细胞系的分析中，U251中ROBO1的表达显示100的分值，其为源自人脑肿瘤的细胞系，Alexander、HLE、HuH6、HuH7和HepG2，其源自人肝癌细胞系，Lu1320和H522，其源自人肺癌细胞系，以及Hela，其源自人子宫颈癌等等，显示ROBO1的表达不仅在以上所示的肝细胞癌、大肠癌和肺癌中得到提高的可能性，而且在各种各样的癌症如脑肿瘤和子宫颈癌中提高(图1c)。
另外，以上述同样的方式在完全-分化的、中等-分化的(归因于HBV或HCV病毒感染)和不充分-分化的肝细胞癌中对肝细胞癌，以及以上述同样的方式对肝炎部位、肝硬化部位，其为非-癌症部位，以及健康肝脏利用GeneChipTM HG-U95B Target(Affymetryx[A39])进行分析。从提取的组织制备总RNA，每个来自三个病例，并且混合来自三个病例的5μg的每种总RNA，且经过GeneChip分析。以标准化至100的总芯片分值的平均值显示值。
因此，与健康肝脏和非-癌部位非常低的量相反，对于ROBO1基因(探针ID55461_at_HG-U95B)，从完全-分化的肝细胞癌至不充分-分化的肝细胞癌观察到表达的显著增加，并且很明显肝细胞癌中表达提高(图2)。
实施例21-2.通过定量PCR的ROBO1mRNA表达分析利用从健康肝脏、肝炎部位和肝硬化部位，以及提取自肝癌和相同组织的非-癌部位的组织制备的RNA进行定量PCR。即，利用逆转录酶Superscript II(GIBCO BRL制造)从制备自每种组织的总RNA合成的单-链cDNA作为模板DNA，用iCycleriQ实时PCR分析系统(BIO-RAD制造)进行PCR反应以定量mRNA表达的表达量。对ROBO1的引物设计根据GenBank ID(NM_133631)进行。准备包含500mM KCl，100mM Tris-HCl(pH8.3)，20mM MgCl2，0.1％明胶，1.25mM每种dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，1μL pf每种单链cDNA，5pmol每种ROBO1正向引物(SEQ.ID1)和ROBO1反向引物(SEQ.ID2)，0.75μL的SYBR Green I(1000倍稀溶液，Takara Shuzo制造)，0.25μL重组Taq聚合酶混合物(FGPluthero，Rapid purificationof high-activity TaqDNA polymerase，Nucl.Acids.Res.1993 214850-4851.)的每种25μL PCR反应溶液后，首先，在94℃进行初次变性3分钟，并且进行40次包括94℃15秒，63℃15秒以及72℃30秒的循环。利用与iCycler iQ实时分析系统关联的软件计算每种原本制备物中表达的量。另外，以各个RNA表达的人β-肌动蛋白基因的量也利用人β-肌动蛋白特异的正向引物(SEQ.ID3)和反向引物(SEQ.ID4)以上述同样的方式分析，并且用人β-肌动蛋白(ROBO1/β-肌动蛋白x100)的分析结果校正的ROBO1分析结果用作表达的ROBO1mRNA量。
因此，与GeneChip分析的结果类似，健康肝脏和肝炎部位，以及肝硬化部位中几乎观察不到ROBO1mRNA的表达；相反，在许多肝细胞癌部位中观察到ROBO1mRNA表达提高。尤其，比较相同组织内的癌症部位和非-癌部位，所分析9例的8例中表达提高两倍或更多(表2)。
表2.通过定量PCR分析的ROBO1基因表达提高率定量PCR分析(对照β-肌动蛋白(％))

具有两倍或更多差异的对8例实施例3抗-ROBO1抗体的制备为了阐明利用抗-ROBO1抗体检测癌症是否可行，产生抗-ROBO1抗体。
3-1.抗原的制备3-1-1.ROBO1cDNA的分离为了进行ROBO1的表达，首先如下分离ROBO1cDNA。按照上述方法从Hep3B细胞制备单链cDNA，并且以此为模板，利用引物RBV2F-TA(SEQ.ID5)和RBR-TA(SEQ.ID6)通过PCR方法进行扩增。引物RBV2F-TA设计成能与ROBO1基因(GenBankNM_133631)的5’-端杂交，并且RBR-TA设计成能杂交至3’-端。通过按照LA-PCR试剂盒(TAKARA制造)的方案制备反应溶液，并且首先在95℃进行初次变性两分钟，在72℃进行30次包括94℃15秒，63℃15秒，和72℃5分钟的循环，并且随后在包括72℃10分钟的条件下进行最后的延伸而进行PCR方法。结果，成功检测到对应于预测ROBO1序列的接近大约5kb的条带。当通过PCR方法获得特异性扩增的片段通过TA克隆方法插入pcDNA3.1/V5-His TOPO(Invitrogen制造)，并且通过已建立的方法验证碱基序列时，显然所分离的cDNA为ROBO1的cDNA。
3-1-2.表达ROBO1N末端部位的重组杆状病毒的制备关于包含ROBO1N-末端至第一个免疫球蛋白区(Ig1)的区域，其作为与杆状病毒膜蛋白gp64的融合蛋白表达。即，用上述ROBO1cDNA作为模板，编码包含ROBO1N-末端至第一个免疫球蛋白区(Ig1)区域的基因通过利用RB_BVF引物(SEQ.ID7)和RB_BVR引物(SEQ.ID8)的PCR方法扩增，随后插入pGEM-Te载体(Promega制造)。通过已建立的方法验证碱基序列后，用限制性核酸内切酶KpnI片段切割的基因片段插入pBucSurf载体(Novagen制造)以构建转移载体ROBO1N/pBS。随后，利用限制性核酸内切酶BplI(Fermentas制造)切割4μg ROBO1N/pBS并且线性化后，其与Bac-N-Blue DNA一起按照Invitrogen的说明书导入Sf9细胞以制备表达ROBO1-Ig1和gp64融合蛋白的重组杆状病毒。
添加如上制备的重组病毒以获得MOI为5以感染Sf9细胞(2×106细胞/mL)，其随后在27℃培养3天。培养3天后从培养物上清回收表达ROBO1-Ig1和gp64融合蛋白的出芽杆状病毒(BV)。即，培养溶液在800xg离心15分钟并且除去细胞以及细胞碎片，随后回收的培养物上清在45,000xg离心30分钟。沉淀重悬于PBS，通过在800xg进一步离心除去细胞组分，上清在45,000xg再次离心，获得的沉淀用PBS悬浮以用作BV组分，并且用作用免疫的抗原。
3-2抗-ROBO1单克隆抗体的制备利用通过上述方法制备的表达ROBO1-Ig1的BV作为抗原产生抗-ROBO1单克隆抗体。即，相当于1mg蛋白质量的表达ROBO1-Ig1的BV和200ng百日咳毒素的混合物悬浮在PBS中，并且通过皮下注射入gp64转基因小鼠(WO03/104453)而进行首次免疫。在后来的免疫中，仅皮下注射相当于500μmg蛋白质量的表达ROBO1-Ig1的BV。作为最终的免疫，经血管内给予250μg表达ROBO1-Ig1的BV，此后3天，从小鼠分离脾细胞，并且按照常规方法进行与小鼠P3U1细胞的细胞融合以建立杂交瘤细胞。通过ELISA进行产生抗-ROBO1抗体的杂交瘤细胞的选择，其中用于免疫的抗原，表达ROBO1-Ig1的BV为固相的。对于ELISA方法，表达ROBO1-Ig1的BV在4℃置于96-孔平底平板中(Falcon制造)一昼夜以使终浓度变为10μg/ml，此后包含40％Block Ace试剂(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd制造)的TBS缓冲溶液用于封闭，随后添加杂交瘤培养上清，反应在室温下进行1小时。然后，标记HRP的抗小鼠IgG抗体(Jackson制造)在室温下反应1小时，洗涤4次后，3，3’，5，5’-四甲苯(TMB)试剂(Sigma制造)在室温下反应1小时。用0.5N硫酸终止反应，并且用微量培养板读板器Multickan JX(Labsystems制造)测量在492nm下的光密度。
结果，成功建立产生结合ROBO1的单克隆抗体的杂交瘤细胞A7241A以及A7225A。通过硫酸铵沉淀方法从产生杂交瘤细胞的培养物上清制备每种单克隆抗体。
实施例4利用抗-ROBO1抗体检测ROBO1蛋白质分子为了验证通过以上描述制备的抗-ROBO1抗体的反应性，利用来自强制表达ROBO1的细胞系以及来自各种癌细胞系的细胞裂解物进行ROBO1的检测。首先，通过利用强制表达ROBO1的HEK293细胞的Western分析验证抗-ROBO1抗体A7241A的反应性。具有上述插入到pcDNA3.1/V5-His TOPO(Invitrogen制造)中的编码ROBO1的cDNA的全长ROBO1基因表达载体(ROBO1/pcDNA3.1)用作动物细胞表达载体。然后，作为阴性对照的1μg ROBO1/psDNA3.1或pcDNA3.1(模拟物)利用FuGene6试剂(Roche Diagnostics制造)导入5×104COS7细胞或2×105HEK293细胞以瞬时表达ROBO1。在导入表达载体三天后回收细胞，并且培养的细胞溶于RIPA缓冲溶液中(150mM氯化钠，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸，0.1％SDS，50mM三-羟甲氨基甲烷羟基氨基甲烷盐酸盐(pH8.0))以制备细胞裂解物。
相当于3μg蛋白质量的每种裂解物经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并且在通过SDS-PAGE分离蛋白质后，转移至Hybond-P(AmershamBioscience制造)。随后，当利用抗-His抗体(Sigma制造)或A7241A抗体(1μg/mL)作为一抗，并且利用HRP标记的抗鼠IgG抗体(Jackson制造)作为二抗的ECL plus(Amersham Bioscience制造)进行检测时，检测到与抗-His抗体特异反应的大约260kd分子量的条带。虽然这可认为是全长ROBO1，用抗-ROBO1抗体A7241A还在细胞裂解物中观察到相同分子量的条带。根据上述结果，抗-ROBO1抗体A7241A显示能特异性检测全长ROBO1蛋白。另外，对于A7241A还检测到具有小分子量的一些条带，由于这些条带用抗-His抗体检测不到，考虑其可能是缺乏C-末端的降解产物，并且事实上在培养物上清中检测到大约120kd分子量的条带(图3)。虽然全长ROBO1所估计的分子量为190kd，由于糖链修饰等等，认为其在比250kd预染的分子量标志物(Bio-Rad制造)更高的位置(大约260kd)检测到。另外，虽然还在利用pcDNA3.1的HEK293细胞模拟检验中检测到认为是ROBO1的条带，根据ROBO1在胎儿阶段表达的事实，认为其是由于ROBO1通过HKE293细胞表达的原因，该细胞源自人胚肾。
然后，对来自各种癌细胞系的细胞裂解物进行Western分析。结果，仅在具有高mRNA表达分值的细胞系中成功检测到认为是全长ROBO1的大约260kd分子量的条带，与GeneChip U133分析结果一致(图4)。另外，以同样的方式检测到多个具有小分子量的条带的事实提示，取决于细胞系，糖链中的连接数是不同的，或由于降解产物或剪接的差异，存在具有不同分子量的ROBO1。
另外，当在培养物上清以及表达ROBO1的癌细胞系中验证可溶ROBO1片段的检测是否可行时，与强制表达细胞的培养物上清的相同分子量的条带也通过抗-ROBO1抗体在高表达ROBO1的肝癌细胞系培养物上清中检测(图3)。
根据上述结果，清楚ROBO1单克隆抗体A7241A可特异性检测ROBO1，并且通过GeneChip分析的mRNA表达程度与ROBO1蛋白表达程度匹配。另外，根据利用抗-ROBO1抗体的检查，清楚了可溶ROBO1片段存在于表达ROBO1的细胞的培养物上清中，强烈提示可通过检测可溶的ROBO1而测定癌细胞的存在与否。
实施例5肝细胞癌的免疫组织染色利用抗-ROBO1单克隆抗体进行肝细胞癌临床样品的免疫组织学染色分析。
切至4μm的来自肝细胞癌提取组织的固定石蜡包埋制备物的切片附着于载玻片上，并且在37℃充分干燥16小时左右。进行通过在100％二甲苯中每次5分钟浸泡三次的脱蜡，随后通过在100％乙醇中5分钟以及在70％乙醇5分钟浸泡三次的脱水。随后，在50mM TBS缓冲溶液(50mM Tris，pH7.4，150mM NaCl)中洗涤5分钟三次后，通过在柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH7.0)中120℃反应10分钟进行抗原的活化。随着抗原的活化，利用TBS缓冲溶液进行三次洗涤，每次5分钟，随后，稀释至10μg/mL的A7241A抗体在室温下反应一小时。然后，通过用0.3％过氧化氢在室温下作用15分钟灭活内源的过氧化物酶。在用TBS缓冲溶液再洗涤三次后，作为二抗的ENVISION+kit/HRP(DAKO制造)作用一小时。用TBS缓冲溶液每次5分钟洗涤三次后，DAB(3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐)用于染色。另外，苏木精用于核的对比染色。
结果，如图5所示，根据肝细胞癌通过抗-ROBO1抗体特异性染色的事实，显然肝细胞癌中ROBO1蛋白的表达特异性地提高。另外，显示抗-ROBO1抗体可用于高表达ROBO1的癌症的免疫组织化学诊断，如肝细胞癌。
实施例6肝细胞癌患者血清中可溶ROBO1蛋白(sROBO1)的检测根据实施例4的结果表明ROBO1蛋白的片段作为可溶ROBO1释放和存在的事实，考虑可能是可溶ROBO1蛋白(sROBO1)存在于具有ROBO1高表达的癌症患者，如肝细胞癌患者血清中，该片段认为可用作诊断标志物。因此，通过利用A7241A抗体的Western分析检验来自24个肝细胞癌患者，6个肝硬化患者和6个肝炎患者的每一血清中可溶ROBO1的存在。如上所述进行SDS-PAGE以及Western分析，利用5μl每一患者的血清，并且肝癌细胞系Alexander(ALX)的培养物上清用作阳性对照。结果，如图6所示，与肝硬化和肝炎患者血清中的未检出相反，24例的23例中在肝细胞癌患者血清中检测到sROBO1。根据上述，显示sROBO1也存在于患有表达ROBO1的癌症的患者血清中，并且同时，作为表达ROBO1的癌症如肝细胞癌的血清诊断标志物，sROBO1的检测显示是非常有效的。
实施例7可溶ROBO1(sROBO1-His)的制备如下所述制备具有添加至ROBO1胞外区C-末端的His-tag的可溶ROBO1(sROBO1-His)。
ROBO1cDNA用作模板，利用引物RBV2F-TA(SEQ.ID.13)和引物RB_SH_TA(SEQ.ID14)通过PCR方法扩增编码胞外区的基因。PCR产物直接插入pBlueBack4.5-TOPO载体并且进行序列分析后，产生具有正确碱基序列的转移载体sROBO1/pBB。利用4μgsROBO1/pBB，通过与实施例3类似的方法产生重组杆状病毒。
然后，如下所述制备sROBO1-His。即，用表达sROBO1-His的重组杆状病毒感染2×106/mL Sf9细胞以使MOI变成5，在27℃培养3天，回收其培养物上清。利用Ni-NTA superflow(QIAGEN)按照内附的方案纯化培养物上清中包含的sROBO1-His。利用Centircon-10(Amicon制造)，并且缓冲液更换为PBS而浓缩纯化产物以制备sROBO1-His。
实施例8来自sROBO1免疫的兔血清的评估8-1.通过Western分析检测ROBO1蛋白质分子新西兰白兔(10周大小的雌性，Clea Japan生产)通过以100μg/0.5mL/动物悬浮于PBS中的纯化的sROBO1抗原与0.5mL弗氏完全佐剂(DIFCO制造)混合形成乳剂而皮下注射而给予而，进行首次免疫。接着，以2周的时间间隔，悬浮于PBS中的纯化的sROBO1抗原100μg/0.5rnL通过与0.5mL弗氏完全佐剂混合形成乳剂而皮下注射而进行总共四次免疫。在每次免疫之前以及第三次和免疫后进行血液的采集，并且通过ELISA方法测定sROBO1抗体水平的增加。即，sROBO1固定于ELISA聚苯乙烯平板板上，并且兔抗血清的稀释行反应后，与辣根过氧化酶标记的抗兔IgG抗体(Cappel制造)反应并且用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺试剂(TMB试剂；Cytech制造)显色以测定抗体效价。验证抗体水平的增加后，采集全血以获得抗-ROBO1兔抗血清。
通过利用来自sROBO1免疫的兔血清的Western分析进行全长ROBO1分子的检测。如上所述利用RIPA缓冲溶液从强制表达全长ROBO1的HEK293细胞制备的相当于10μg蛋白质量的细胞裂解物经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶，并且分离蛋白质后，转移至Hybond-P(Amersham Bioscience制造)。随后，当利用来自sROBO1免疫兔的100倍稀释的血清作为一抗，并且利用HRP标记的抗兔IgG抗体(Amersham Bioscience制造)作为二抗的ECL plus(AmershamBioscience制造)进行检测时，与阳性对照A7241A抗体类似，可检测到认为是全长ROBO1分子的大约260kd分子量的条带(图7)。根据上述结果，来自sROBO1免疫兔的血清显示能通过Western分析检测全长ROBO1分子。
8-2.通过FACS分析检测ROBO1蛋白为了评估来自sROBO1免疫的兔血清是否可检测细胞表面的ROBO1，利用强制表达ROBO1的HEK293细胞进行FACS分析。即，强制表达ROBO1的HEK293细胞或阴性对照HEK293细胞悬浮于FACS溶液中(含有1％白蛋白和0.1％NaN3的PBS)。来自sROBO1免疫的兔血清添加至该细胞悬液且在4℃反应60分钟，在用FACS溶液洗涤两次后，添加FITC标记的抗兔F(ab)2抗体(DAKO制造)并且在4℃反应30分钟。随后，用FACS溶液洗涤两次后，用FACScalibur(Beckton Dickinson制造)按照所用的指南进行FACS分析。抗-V5-tag抗体(Invtrogen制造)用作本实验的阳性对照，并且FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Jackson制造)用作其二抗。因为V5-tag添加至ROBO1胞内区的C末端，当使用一抗时利用含有0.1％皂甙的FACS溶液以使该抗体能检测胞内V5-tag。
结果，如图8所示，与阳性对照抗-V5抗体的峰移位类似，还在sROBO1-免疫兔的血液中检测到仅在强制表达ROBO1的HEK293细胞中的特异性的峰移位。
另外，如图9所示，当按照如上所述相同的方法在内在表达ROBO1的肝癌细胞系HepG2细胞中进行FACS分析时，在sROBO1免疫兔的血清中观察到特异性的峰移位，表明也可检测细胞表面上具有原始结构的ROBO1分子。
实施例9抗人ROBO1兔多克隆抗体的纯化上述制备自sROBO1免疫兔血清的抗人ROBO1兔多克隆抗体，如下列所述通过具有固相ROBO1的亲和层析进行纯化。即，按照内附的文本利用CNBr-活化的Sepharose 4B(Amasham Pharmacia Biotec#17-0430-02)，并且按照内附的文件每1mL凝胶固定0.7mg纯化的sROBO1-His抗原而产生sROBO1-His亲和柱。随后，按照常规方法从实施例8中获得的兔血清纯化抗-ROBO1兔多克隆抗体。
实施例10通过ELISA建立ROBO1测量系统以及检测血液中的ROBO1利用实施例9中获得的抗-ROBO1兔多克隆抗体构建ELISA检测系统。即，抗-ROBO1兔多克隆抗体以5μg/mL的浓度稀释于PBS中，并且每孔50μL分配入96-孔免疫-平板板中。在2至8℃过夜后，平板用含有0.05％Tween20的PBS洗涤三次，用每孔150μL免疫测定稳定剂(ABI#10-601-001)进行包被一小时。此后，弃去溶液，在37℃干燥两小时以转变平板为固相抗-ROBO1平板抗体平板。关于用于检测的生物素化的抗-ROBO1抗体，利用pH8.5的50mM碳酸盐缓冲溶液制备分别为0.12mg/mL和46μg/mL的抗-ROBO1兔多克隆抗体和硫代-NHS-LC-生物素(Pierce#21335)，并且经室温下两小时。未反应的生物素试剂利用PD-10(Pharmacia#17-0851-01)除去，并且通过用含有30％小牛血清的PBS稀释至1μg/mL而制备生物素化的抗-ROBO1抗体。进一步，利用在含有30％小牛血清的tris-羟甲氨基甲烷缓冲的生理盐水中稀释至3μg/mL的链亲和素标记的过氧化物酶(Vector#SA-5004)检测生物素化的抗-ROBO1抗体，并且TMB试剂(Cytech#TM490041)用作过氧化物酶的检测底物以及TMB终止试剂(Cytech#TSB999)用作底物反应的终止试剂。
然后，在来自72例健康受试者，79例肝癌患者，67例肝硬化/慢性肝炎患者以及22例其他癌症患者的血消中测量ROBO1浓度。当测量ROBO1浓度时纯化的sROBO1-His用作标准品。血清或sROBO1-His分别用含有20％兔血清以及1％BSA的tris-羟甲-氨基甲烷缓冲溶液稀释90倍，并且每种100μL分配入上述抗体固相平板板的每个孔中。在室温下温育两小时后，每种25μL生物素化的抗-ROBO1抗体分配入每个孔中。此外，在室温下温育两小时后，除去每孔的反应溶液，分配100μl每种链亲和素标记的过氧化物酶试剂。在室温下温育30分钟后，平板用含有0.05％Tween20的PBS洗涤平板5次。分配100μL每种TMB试剂入每孔，并且在室温下温育30分钟后，添加100μL TMB终止试剂，以及用EIA平板板读数器(Corona Electric Co.，#MTP-120)测量450nm波长的吸收。主意630nm的波长用作参照。
结果，当利用sROBO1-His时，观察到吸收值浓度-依赖的提高；此外，通过每个标准浓度吸收值的回归确定每种血清中的浓度(图10)。结果显示在表3、4、5和6中。
表3.健康受试者血液中ROBO1的浓度



表4.肝癌患者血液中ROBO1的浓度




注意表中的空白表示“未测量的”。
表5.肝硬化和慢性肝炎患者血液中ROBO1的浓度



注意表中的空白表示“未测量的”。
表6.肝癌以外癌症患者血液中ROBO1的浓度

根据72例健康受试者血清中ROBO1浓度的测量平均值和标准偏差为36ng/mL和8ng/mL的事实，81ng/mL，其为平均值+(6×标准偏差)，作为边界值。结果，所有健康受试者例的血清样品在该边界值下；相反，肝癌患者样品、肝硬化/慢性肝炎患者样品和其他癌症患者样品中分别显示46％(79例中的36例)、22％(67例中的15例)和9％(22例中的2例)的值不小于边界值，而这些样品认为是ROBO1阳性的。其间，根据通常用作肝癌诊断方法的AFP阳性率在肝癌患者样品和肝硬化/慢性肝炎患者样品中分别为46％(59例中的27例)和15％(52例中的8例)的事实，肝癌诊断中的灵敏度和特异性大约位于AFP和ROBO1之间。然而，根据32例AFP阴性肝癌患者样品中存在10例ROBO1阳性样品，而且在这10例中的5例PIVKA也是阴性的的事实，认为通过利用ROBO1，在通过现有诊断方法的不能诊断为肝癌的情况中诊断也成为可能。事实上，通过联合使用ROBO1将AFP单独检测的46％的阳性率提高至63％。
根据上述，在肝癌的诊断中，ROBO1测量系统具有与目前应用的AFP测量系统大致等价的性能，可通过与现有癌症标志物的联合使用建立高灵敏度和特异性的癌症诊断方法。
另外，按照表3、4、5和6中显示的疾病值绘图的结果在图11中显示。健康受试者(NHS)、慢性肝炎(CH)、肝硬化(LC)和肝癌(HCC)血清中的ROBO1浓度的平均值分别为34.8、39.3、74.0和84.4ng/mL。根据该结果，清楚的是来自每一组健康受试者、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者的血清中ROBO1的浓度随着肝脏疾病恶化成比例提高。
然后，为了确定对于每个个体ROBO1浓度是否也在实时测量中变化，在肝癌发病之前收集的血样中进行ROBO1浓度的测量。结果，观察到在3例中2例中血液中ROBO1浓度随恶化成比例提高(图12)。虽然在一例中没有观察到与恶化成比例的提高，根据该值比健康受试者高30至40ng/ml的事实，推测已达到最大值。
这些结果表明患者中不仅肝癌的诊断而且肝脏疾病范围的诊断可通过实时测量，即通过监测肝脏疾病血清中的ROBO1浓度而完成。
实施例11补体-依赖的细胞毒性(CDC活性)的测量产生人白蛋白veronal缓冲液(HAVB)溶解12.75gNaCl(特级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)，0.5625g巴比妥钠(特级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和0.8625g巴比妥(特级，Wako Pure Chemical Industries，.)于Milli Q水中并且补至200mL后，进行高压灭菌处理(121℃，20分钟)。添加100mL体积高压灭菌的热Milli Q水并且验证pH7.43(推荐pH7.5)。此用作5×veronal缓冲液。0.2205g量的CaCl2·2H2O(特级，Junsei ChemicalCo.，Ltd.)溶于50mL Milli Q水以达到0.03mol/L，其用作CaCl2溶液。1.0165g量的MgCl2·6H2O(特级，Junsei Chemical Co.，Ltd.)溶于50mLMilli Q水以达到0.1mol/L，其用作MgCl2溶液。100mL体积的5Xveronal缓冲液，4mL人血清白蛋白(25％Buminate(注册商标)，250mg/mL人血清白蛋白浓缩物，Baxter)，2.5mL CaCl2溶液，2.5mLMgCl2溶液，0.1gKCl(特级，Junsei Chemical Co.，Ltd.)以及0.5g葡萄糖(D(+)-葡萄糖，无水葡萄糖，特级，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)溶于Milli Q水中，并且得到的溶液加至500mL。此用作HAVB。过滤除菌后，溶液在5℃的设定温度保存。
靶细胞的制备在补充10％FBS(Thermo Trace)和0.5mg/mL遗传霉素(Geneticin)(GIBCO)的DMEM培养基(SIGMA)中培养强制表达ROBO1的HEK293细胞，利用细胞分离缓冲溶液(GIBCO)从平板板分离，以96-孔U平板底平板(BECTON DICKINSON)的每孔1×104细胞/孔分配，并且培养过夜。培养后，添加5.55MBq铬-51，在5％二氧化碳的温箱中进行37℃培养一小时，该细胞用HAVB洗涤两次，并且添加50μLHAVB以获得靶细胞。
幼兔补体的制备幼兔补体(BABY RABBIT COMPLEMENT，CEDARLANE)，其在使用前立即制备，在检查的时候溶于每瓶1mL可注射蒸馏水中(FusoPharmaceutical Industries，Ltd.)，用作补体溶液。
铬释放检验(CDC活性)抗-ROBO1抗血清(抗-ROBO1兔多克隆抗体)用HAVB稀释至获得50倍-以及500倍-抗体溶液。50μL体积的每种抗体溶液添加至靶细胞，其随后放于冰上15分钟。然后，100μg/mL每种补体溶液添加至每孔(最终的抗体稀释比200倍和2000倍)，并且37℃放于5％的二氧化碳温箱中90分钟。平板板离心分离后，从每孔回收100μL每种上清，并且用γ粒子计数器测量放射性。根据下列公式确定特定的铬释放率特定的铬释放率(％)＝(A-C)/(B-C)×100其中A代表孔中的放射性(cpm)，B代表其中100μL2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，Nacalai Tesque Co，Ltd.)和50μL HAVB添加至靶细胞的孔中的放射性(cpm)平均值，以及C代表其中150μL HAVB添加至靶细胞的孔中的放射性(cpm)平均值。检验一式三份进行，并且对CDC活性(％)计算平均值和标准偏差。
结果在图13中显示。显然，抗-ROBO1抗血清，即抗-ROBO1多克隆抗体呈现对表达ROBO1的HEK293细胞的剂量-依赖的CDC活性。注意当利用兔的免疫前血清时，未证实CDC活性，与不添加抗体类似。
实施例12结合ROBO1胞外区的单克隆抗体的产生
12-1.表达ROBO1 N末端部位的重组杆状病毒的产生存在于ROBO1胞外区的粘连蛋白III区域(FnIII)作为与杆状病毒膜蛋白gp64的融合蛋白表达。即，通过用上述ROBO1cDNA作为模板，利用gp4F引物(SEQ.ID15)和gp4R引物(SEQ.ID16)的PCR方法扩增编码ROBO1第三个粘连蛋白区域的基因，随后插入pGEM-Te载体中(Promega制造)。通过已建立的方法验证碱基序列后，用限制性核酸内切酶KpnI切割的基因片段插入pBucSurf载体(Novagen制造)以构建转移载体ROBO1gp4/pBS。随后，利用限制性核酸内切酶BplI(Fermentas制造)切割4μg ROBO1gp4/pBS并且线性化后，其与Bac-N-Blue DNA一起按照Invitrogen的说明书导入Sf9细胞以制备表达ROBO1的FnIII和gp64融合蛋白的重组杆状病毒。
SEQ.ID15GGTACCCGCACCCAGTGCCCCACCCCAAGGSEQ.ID16GGTACCGCATCTGAAATCTGCTGAGCGAGG添加如上制备的重组病毒以感染Sf9细胞(2×106细胞/mL)以使MOI为5，其随后在27℃培养3天。培养3天后从培养物上清回收表达ROBO1-FnIII和gp64融合蛋白的出芽杆状病毒(BV)。即，培养溶液在800xg离心15分钟并且除去细胞以及细胞碎片，并且随后回收的培养物上清在45,000xg离心30分钟。沉淀悬浮于PBS并且在800xg进一步离心除去细胞组分，并且通过在45,000xg再次离心上清而获得的沉淀悬浮于PBS中作为BV组分，且用作免疫的抗原。
12-2.抗-ROBO1单克隆抗体的产生通过上述方法制备的表达ROBO1-FnIII的BV用作抗原以产生抗-ROBO1单克隆抗体。即，相当于1mg蛋白质量的表达ROBO1-FnIII的BV和200ng百日咳毒素的混合物悬浮在PBS中，通过皮下注射入gp64转基因小鼠(WO03/104453)而进行首次免疫。在后来的免疫中，仅皮下注射相当于500μmg蛋白质量的表达ROBO1-FnIII的BV。作为最终的免疫，经血管内给予250μg表达ROBO1-Ig1的BV，此后3天，从小鼠分离脾细胞，并且按照常规方法进行与小鼠NS-1细胞的细胞融合以建立杂交瘤细胞。通过ELISA进行产生抗-ROBO1抗体的杂交瘤细胞的选择，其中用于免疫的抗原的表达ROBO1-FnIII的BV为固相的。对于ELISA方法，表达ROBO1-FnIII的BV在4℃置于96-孔平底平板中(Falcon制造)一昼夜以使终浓度变为10μg/ml，此后包含40％Block Ace试剂(Dainippon Pharmaceutical Co.，Ltd制造)的TBS缓冲溶液用于封闭，随后添加杂交瘤培养上清，反应在室温下进行1小时。然后，HRP标记的抗鼠IgG抗体(Jackson制造)在室温下反应1小时，洗涤4次后，3，3’，5，5’-四甲苯(TMB)试剂(Sigma制造)在室温下反应1小时。用0.5N硫酸终止反应，并且用微量培养板读数器MultickanJX(Labsystems制造)测量492nm的光密度。
结果，成功建立产生结合ROBO1的单克隆抗体的杂交瘤细胞B2318C。通过硫酸铵沉淀方法从产生抗体的杂交瘤细胞的培养物上清制备单克隆抗体。
实施例13补体-依赖的细胞毒性(CDC活性)的测量与实施例11类似，进行人白蛋白veronal缓冲液(HAVB)的产生，靶细胞制备物的制备，以及幼兔补体的制备。
B2318C抗体(抗-ROBO1单克隆抗体)用HAVB稀释，每种50μL添加至靶细胞，其放于冰上15分钟。然后，100μg/mL每种补体溶液添加至每孔(制备以使抗体终浓度为1μg/mL和10μg/mL)，并且37℃放于5％的二氧化碳温箱中90分钟。平板离心分离后，从每孔回收100μL每种上清，并且用γ粒子计数器测量放射性。根据下列公式确定特定的铬释放率特定的铬释放率(％)＝(A-C)/(B-C)×100其中A代表孔中的放射性(cpm)，B代表其中100μL2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，Nacalai Tesque Co，Ltd.)和50μLHAVB添加至靶细胞的孔中的放射性(cpm)平均值，以及C代表其中150μL HAVB添加至靶细胞的孔中的放射性(cpm)平均值。检验一式三份进行，并且对CDC活性(％)计算平均值和标准偏差。
结果在图14中显示。显然，B2318C抗体，即抗-ROBO1单克隆抗体呈现对表达ROBO1的HEK293细胞剂量-依赖的CDC活性。
另外当在也为肝癌细胞系的Alexander(PLC/PRF/5)细胞上尝试CDC活性检验时，显然B2318C抗体，即抗-ROBO1单克隆抗体，类似于对表达ROBO1的HEK293细胞的作用，表现出剂量-依赖的CDC活性。
实施例14利用小鼠骨髓来源的效应细胞测量ADCC活性14-1.小鼠骨髓来源的效应细胞溶液的制备从SCID小鼠(10周大小的雄性，Clea Japan)的股骨收集骨髓细胞，悬浮以获得10％FBS/RPMI1640培养基中5×105细胞/mL，添加小鼠GM-CSF(PeproTech)和人IL-2(PeproTech)以分别达到10ng/mL和50ng/mL，细胞在37℃，5％的二氧化碳温箱中培养5天。培养后，用刮器刮落细胞，用培养基洗涤一次，悬浮以达到10％FBS/RPMI1640培养基中5×106/细胞/mL，其用作小鼠骨髓来源的效应细胞溶液。
14-2靶细胞的制备强制表达ROBO1的HEK293细胞在含有10％FBS(ThermoTrace制造)和500ng/mL遗传霉素(Invitrogen)的DMEM培养基(Sigma制造)中传代培养，利用细胞解离缓冲液(Invitrogen)与培养皿分离，以96-孔U底平板(Falcon)的每孔1×104细胞/孔分配，并且培养过夜。培养后，在37℃，5％二氧化碳温箱中进行添加5.55MBq铬-51的培养四小时，该细胞用培养基洗涤三次，添加50μL10％的FBS/RPMI1640培养基以获得靶细胞。
14-3.铬释放检验(ADCC活性)50μL体积的B2318C抗体(抗-ROBO1单克隆抗体)溶液添加至靶细胞，其随后放于冰上15分钟，随后添加100μL小鼠骨髓-来源的效应细胞溶液(5×105细胞/孔)，并且细胞在37℃，5％二氧化碳温箱中培养4小时(制备以使最终的抗体浓度为1μg/mL和10μg/mL)。此后，进行平板的离心分离，并且用γ粒子计数器测量100μL培养上清中的放射性。根据下列公式确定特定的铬释放率特定的铬释放率(％)＝(A-C)×100/(B-C)其中A代表孔中的放射性(cpm)平均值，B代表其中100μL2％NP-40水溶液(Nonidet P-40，代码No.252-23，Nacalai Tesque Co，Ltd.)和50μL10％的FBS/RPMI培养基添加至靶细胞的孔中的放射性(cpm)平均值，以及C代表其中150μL10％的FBS/RPMI培养基添加至靶细胞的孔中的放射性(cpm)平均值。检验一式三份进行，并且对ADCC活性(％)计算平均值和标准偏差。
结果在图16中显示。显然，B2318C抗体，即抗-ROBO1单克隆抗体呈现对表达ROBO1的HEK293细胞剂量-依赖的ADCC活性。
根据上述，证实了利用抗-ROBO1单克隆抗体对表达ROBO1的癌细胞的治疗有效性。
本发明在癌症的诊断和治疗，以及肝炎恶化的监测中是有效的。
序列表<110>油谷浩幸(ABURATANI Hiroyuki)中外制药株式会社(CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA)<120>利用抗-ROB01抗体诊断和治疗癌症(Method for Diagnosis and Treatment ofCancers using Anti-ROBO1 Antibody)<130>SCT064052-47<150>JP2004-102862<151>2004-03-31<150>JP2004-227899<151>2004-08-04<150>JP2005-004024<151>2005-01-11<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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权利要求
1.一种癌症诊断方法，其特征是检测ROBO1蛋白的。
2.根据权利要求1的诊断方法，其中检测ROBO1蛋白的胞外区。
3.根据权利要求1的诊断方法，其中利用识别ROBO1蛋白的抗体。
4.根据权利要求1的诊断方法，其中检测血液中、血清中或血浆中的ROBO1蛋白。
5.根据权利要求1的诊断方法，其中检测从细胞分离的ROBO1蛋白。
6.一种癌症诊断方法，包括(a)从受试者收集样品的步骤，和(b)检测包含在所收集样品中的ROBO1蛋白的步骤。
7.根据权利要求6的诊断方法，其中从受试者收集的样品为血液、血清或血浆。
8.根据权利要求6的诊断方法，其中检测ROBO1蛋白的胞外区。
9.根据权利要求6的诊断方法，其中利用识别ROBO1蛋白的抗体。
10.用于诊断癌症的试剂盒，包含结合ROBO1蛋白的抗体。
11.根据权利要求10的试剂盒，其中癌症为肝细胞癌。
12.根据权利要求10或11的试剂盒，其中该抗体为结合ROBO1蛋白胞外区的抗体。
13.药物组合物，包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体。
14.细胞生长抑制剂，包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体。
15.抗癌剂，包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体。
16.根据权利要求15的抗癌剂，其中结合ROBO1的抗体为具有细胞毒性的抗体。
17.根据权利要求15或16的抗癌剂，其中该癌症为肝细胞癌。
18.用于治疗由异常细胞生长引起的疾病的方法，包括将包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的药物组合物施予需要治疗的患者。
19.用于治疗癌症的方法，包括将包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的药物组合物施予需要治疗的患者。
20.根据权利要求18或19的方法，其中该癌症为肝细胞癌。
21.一种在表达ROBO1的细胞中引起细胞损伤的方法，其通过将表达ROBO1的细胞与结合ROBO1的抗体接触。
22.一种抑制表达ROBO1的细胞生长的方法，其通过将表达ROBO1的细胞与结合ROBO1的抗体接触。
23.根据权利要求21或22的方法，其中结合ROBO1的抗体为具有细胞毒性的抗体。
24.根据权利要求21至23任何一项的方法，其中表达ROBO1的细胞为癌细胞。
25.一种抗体，其结合ROBO1并且对表达ROBO1的细胞具有细胞毒性。
26.一种用于监测肝炎恶化的试剂盒，包含抗-ROBO1抗体。
27.根据权利要求26的试剂盒，其中抗-ROBO1抗体为特异性识别ROBO1的抗体。
28.根据权利要求26或27的试剂盒，其预测从肝炎或肝硬化至肝癌的转变。
29.根据权利要求26至28任何一项的试剂盒，包含固定于支持物上的抗-ROBO1第一抗体和用标记物标记的抗-ROBO1第二抗体。
30.用于监测肝炎恶化的方法，其特征是测量检验样品中的ROBO1。
31.根据权利要求30的监测方法，其中抗-ROBO1抗体用于测量检验样品中的ROBO1。
32.根据权利要求31的监测方法，其中抗-ROBO1抗体为特异性识别ROBO1的抗体。
33.根据权利要求30至32任何一项的监测方法，其中检验样品为血液、血清或血浆。
34.根据权利要求30至33任何一项的监测方法，其预测从肝炎或肝硬化至肝癌的转变。
35.根据权利要求30至34任何一项的监测方法，其利用固定于支持物上的抗-ROBO1第一抗体和用标记物标记的抗-ROBO1第二抗体。
全文摘要
公开了特征在于检测ROBO1蛋白的诊断癌症的方法。另外，公开了包含作为有效成分的结合ROBO1的抗体的药物组合物，细胞生长抑制剂和抗癌剂。进一步，公开了通过将表达ROBO1的细胞与结合ROBO1的抗体接触，而在表达ROBO1的细胞中诱导细胞毒性的方法以及抑制表达ROBO1的细胞生长的方法。此外，公开了通过检测ROBO1蛋白而用于监测肝炎恶化的方法。
文档编号G01N33/576GK101014860SQ20058001049
公开日2007年8月8日 申请日期2005年3月31日 优先权日2004年3月31日
发明者油谷浩幸, 笔宝义隆, 渡边亮, 深山正久, 伊藤行夫, 新井正广, 伊藤浩孝, 大友俊彦, 舟桥真一, 木下恭子 申请人:中外制药株式会社, 油谷浩幸, 株式会社英仙蛋白质科学