专利名称：：具有改变的效应子功能的多肽变体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及包括变体Fc区的多肽。更具体而言，本发明涉及包含Fc区的多肽，因为在其Fc区中有一个或多个氨基酸修饰，其具有改变的效应子功能。
背景技术：
：抗体是蛋白质，其具有与特定抗原的结合特异性。天然抗体通常是大约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，包括两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链。每个轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键的数目是不同的。每个重链和轻链还具有规律间隔的链内二硫键。每个重链在其一个末端具有可变区(VH)，随后是几个恒定区。每个轻链在其一个末端具有可变区(VL)，在其另一个末端为恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对应，而轻链可变区与重链可变区相对应。特殊的氨基酸残基被认为构成轻链和重链可变区之间的界面。术语“可变”指在抗体之间可变区某些部分的序列差异很大，并且负责每种具体抗体对其特定抗原的结合特异性。然而，可变性不是平均的分布于整个抗体的可变区中。在轻链和重链的可变区中，它集中分布于称为互补决定簇(CDR)的三个节段中。可变区中保守性较高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区分别包括四个FR，主要为β片层构象，被三个CDR连接，这些CDR形成与β片层结构相连的环状，在一些情况成为该β片层结构的一部分。每条链中的CDR通过FR紧密地靠在一起，并与其它链的CDR一起形成抗体的抗原结合位点(参见Kabatetal，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd.，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD.(1991))。恒定区不直接参与抗原抗体的结合，但具有各种效应子功能。根据抗体或免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸序列，可将它们分成不同类。主要有5类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以进一步分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；IgA1和IgA2。相应于免疫球蛋白不同类的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。在各种人免疫球蛋白类别中，只有人IgG1、IgG2、IgG3和IgM已知可激活补体；并且人IgG1和IgG3介导ADCC比IgG2和IgG4更有效。天然IgG1的结构示意图见图1A，其中指出了天然抗体分子的各个部分。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为Fab段，每个片段带有单个抗原结合位点，以及一个残留的Fc片段，其名称反映了其易结晶的性能。人IgGFc区的结晶结构已经被确定(Deisenhofer，Biochemistry202361-2370(1981))。在人IgG分子中，通过木瓜蛋白酶切割N末端到Cys226，产生Fc区。Fc区对于抗体的效应子功能是重要的。抗体效应子功能由抗体Fc区介导的效应子功能可以分为两种(1)在抗体与抗原结合之后发挥作用的效应子功能(这些功能涉及补体级联反应的参与或带有Fc受体(FcR)的细胞的参与)；和(2)不依赖于抗原结合而发挥作用的效应子功能(这些功能提供在血循环中的持续性和通过胞吞作用穿过细胞屏障的能力)。Ward和Ghetie，TherapeuticImmunology277-94(1995)。虽然抗体与所需抗原的结合具有中和效应，这可能阻止外源抗原与其内源靶点(例如受体或配体)的结合，但仅靠结合可能不能去除外源抗原。为了有效的去除和/或破坏外源抗原，抗体应该同时具备与其抗原的高亲和力和有效的效应子功能。抗体和抗体-抗原复合物与免疫系统细胞的相互作用引起各种反应，包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖性细胞毒作用(CDC)(参见Daron的综述，Annu.Rev.Immunol.15203-234(1997)；Ward和Ghetie，TherapeuticImmunol.277-94(1995)；以及Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991))。几种抗体效应子功能由与抗体Fc区结合的Fc受体(FcR)介导。FcR根据其对免疫球蛋白同种型的特异性而被确定；IgG抗体的Fc受体称为FcγR，IgE的为FcεR，IgA的为FcαR等等。已经鉴定了FcγR的三个亚类FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。因为每个FcγR亚类是由两个或三种基因编码，并且由于选择性RNA剪接导致形成多种转录本，所以存在很多种FcγR同种型。编码FcγRI亚类的三种基因(FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC)簇集在1号染色体长臂的lq21.1区域；编码FcγRII同种型的三种基因(FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC)和编码FcγRIII的两种基因(FcγRIIIA和FcγRIIIB)均簇集于lq22区。这些不同的FcR亚型在不同类型的细胞中进行表达(参见Ravetch和Kinet的综述，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991))。例如，在人类中，FcγRIIIB仅在中性粒细胞中发现，而FcγRIIIA在巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤(NK)细胞和T细胞的亚群中发现。在结构上，FcγR是免疫球蛋白超家族的所有成员，其包含IgG-结合α-链，其中具有包含两个(FcγRI和FcγRIII)或三个(FcγRI)Ig样结构域的胞外部分。而且，FcγRI和FcγRIII具有与α-链相连的辅助蛋白链(γ、ζ)，其作用在于信号传导。还可通过对IgG的亲和性区分受体。FcγRI显示出对IgG的高亲和性，Ka＝108-109M-1(Ravetchetal.Ann.Rev.Immunol.19275-290(2001))而且能够结合单体IgG。相反，FcγRII和FcγRIII显示出对单体IgG的相对较弱的亲和性，Ka≤107M-1(Ravetchetal.Ann.Rev.Immunol.19275-290(2001))，因此仅能有效地与多聚体免疫复合物产生相互作用。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有相似的主要区别在其细胞浆结构域的氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其细胞浆结构域中包含以免疫受体酪氨酸为基础的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞浆结构域中包含以免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(ITIM)。(参见Daron的综述，Annu.Rev.Immunol15203-234(1997))。NK细胞仅携带FcγRIIIA而且抗体与FcγRIIIA的结合导致通过NK细胞的ADCC活性。在人类种群中已经发现了某些FcγR的等位变体。这些等位变体类型已经显示出在结合人和鼠IgG方面存在差异，而且大量的相关研究已经发现了特定变体类型的存在与临床结果的相关性(参见Lehrnbecheretal.Blood94(12)4220-4232(1999))。某些研究已经研究了两种类型的FcγRIIA(R131和H131)，以及其与临床结果的相关性(Hattaetal.GenesandImmunity153-60(1999)；Yapetal.Lupus8305-310(1999)；以及Lorenzetal.EuropeanJ.Immunogenetics22397-401(1995))。目前研究的仅是FcγRIIIA的两种等位型，F158和V158(Lehrnbecheretal.，如上；以及Wuetal.J.Clin.Invest.100(5)1059-1070(1997))。FcγRIIIA(Val158)同种异型与人IgG的相互作用优于FcγRIIIA(Phe158)同种异型(Shieldsetal.J.BioLChem.2766591-6604(2001)；Koeneetal.Blood901109-1114(1997)；以及Wuetal.J.Clin.Invest.1001059-1070(1997))。人和鼠抗体针对FcγR的结合位点先前已被描绘为所谓的“低铰链区”，其由残基233-239组成(EU索引编号，如Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，5thEd.PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991))。Woofetal.Molec.Immunol.23319-330(1986)；Duncanetal.Nature332563(1988)；Canfield及Morrison，J.Exp.Med.1731483-1491(1991)；Chappeletal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA889036-9040(1991)。在残基233-239中，P238和S239已被证明可能参与结合。其它先前已被证明可能参与结合FcγR的区域是对于人FcγRI的是G316-K338(人IgG)(仅通过序列对比；没有评估取代变体)(Woofetal.Molec.Immunol.23319-330(1986))；对于人FcγRIII的是K274-R301(人IgG1)(基于肽)(Sarmayetal.Molec.Immunol.2143-51(1984))；对于人FcγRIII的是Y407-R416(人IgG)(基于肽)(Gergelyetal.Biochem.Soc.Trans.12739-743(1984))；以及对于鼠FcγRII的是N297和E318(鼠IgG2b)(Lundetal.，Molec.Immunol.2953-59(1992))。同样参见Armouretal.Eur.J.Immunol.292613-2624(1999)。Presta在美国专利6,737,056中描述了对FcR的结合性增强或减少的多肽变体。同样，参见Shieldsetal.J.Biol.Chem.9(2)6591-6604(2001)。WO2004/063351中也描述了结合FcγR的变体Fc。C1q以及两种丝氨酸蛋白酶(C1r和C1s)构成了复合物C1，其是补体依赖细胞毒性(CDC)通路的第一个组件。C1q是六价分子，其分子量大约为460,000，而且具有类似于郁金香花束的结构，其中六个胶原“茎”与六个球状头区域相连接。Burton及Woof，AdvancesinImmunol.511-84(1992)。为了激活补体级联反应，C1q需要结合IgG1、IgG2或IgG3中至少两个分子(一致的观点是IgG4不激活补体)，但IgM仅一个分子即可与抗原靶结合。Ward及Ghetie，TherapeuticImmunology277-94(1995)中80页。根据化学修饰和结晶学研究的结果，Burtonetal.Nature，288338-344(1980)指出IgG上补体亚成份C1q的结合位点涉及CH2区的末尾两个(C末端)β链。Burton稍后指出(Molec.Immunol.，22(3)161-206(1985))包含氨基酸残基318-337的区域可能参与补体结合。采用定向诱变，Duncan及WinterNature332738-40(1988)报道了Glu318、Lys320和Lys322形成了与C1q的结合位点。Duncan及Winter的数据是通过鼠IgG2b同种型与豚鼠C1q结合的试验而得到的。Glu318、Lys320和Lys322残基在C1q结合中的作用通过包含这些残基的短合成肽抑制补体介导的裂解的能力而得以证实。1997年7月15日授权的美国专利5,648,260，以及1997年4月29日授权的美国专利5,624,821中公开了相似的结果。通过分析人IgG亚类产生的补体介导的溶胞能力，已表明残基Pro331参与C1q结合。IgG4中Ser331突变为Pro331赋予了激活补体的能力。(Taoetal.，J.Exp.Med.，178661-667(1993)；Brekkeetal.，Eur.J.Immunol.，242542-47(1994))。通过比较Winter小组的数据，以及Tao等和Brekke等的论文，Ward及Ghetie在其综述文章中认为至少有两个不同的区域参与了C1q的结合一个位于包含Glu318、Lys320和Lys322残基的CH2区的β链，而另一个位于位置在紧靠相同β链的拐角处，其中包含位于331位的关键氨基酸残基。其它包括指出人IgG1残基Lys235和Gly237(位于低铰链区)在补体结合和激活中起着决定性的作用。Xuetal，J.Immunol.150152A(摘要)(1993)。1994年12月22日公布的WO94/29351报道了C1q和FcR结合人IgG1所需的氨基酸残基位于CH2区的N端区域，即残基231-238。还有人认为IgG结合C1q以及激活补体级联反应的能力还依赖于位于两个CH2区之间的糖部分(其通常锚定于Asn297)的存在、缺失或修饰。Ward及Ghetie，TherapeuticImmunology277-94(1995)的81页。美国专利6,194,551B1和WO99/51642中描述了Fc区氨基酸序列改变的并且C1q结合能力增加或降低的多肽变体。这些专利公开中的内容具体地引入本文作为参考。还可参见，Idusogieetal.J.Immunol.1644178-4184(2000)。另一类Fc受体是新生Fc受体(neonatalFcreceptor)(FcRn)。FcRn在结构上相似于主要组织相容性复合体(MHC)，由与β2-微球蛋白非共价相连的α链构成。新生Fc受体FcRn的多种功能见于Ghetie及Ward(2000)Annu.Rev.Immunol.18，739-766。FcRn在基于与抗体Fc区的pH依赖相互作用的IgG内稳态中起着关键作用(Ghetie及Ward(2000)AnnuRevImmunol18，739-766；Ghetie及Ward(1997)ImmunolToday18，592-598)。Fc-FcRn复合体在pH6亲和力增加，而在pH7.4保持低亲和性，已经显示出能够增加抗体半衰期(Hintonetal.(2004)JBiolChem279，6213-6216)。FcRn在从母体被动递送免疫球蛋白IgG至幼体以及调节血清IgG水平中起作用。FcRn作为拯救受体(salvagereceptor)，在细胞内和跨细胞结合并运输完整形式的胞饮的IgG，然后从默认的降解途径中解救它们，如图6中所示。虽然负责拯救IgG的机制仍不清楚，但是未结合的IgG涉及溶酶体中的蛋白水解，而结合的IgG再循环至细胞表面并被释放。这一控制发生在位于所有成体组织中的内皮细胞中。FcRn至少在肝、乳腺和成体肠中表达。FcRn结合IgG；FcRn-IgG相互作用已经得到广泛的研究，显示涉及IgG的Fc区的CH2、CH3区界面上的残基。这些残基与主要位于FcRn的α2区中的残基发生相互作用。Ghetie等在NatureBiotechnology15637-640(1997)中报道了在鼠Fcγ1中Thr252、Thr254和Thr256(这些残基邻近FcRn-IgG作用位点)的随机诱变以便研究对这些变体铰链Fc片段的血清半衰期的作用。对鼠FcRn具有最高亲和力的变体具有长于野生型片段的半衰期，尽管其在pH7.4时自FcRn的解离速率(off-rate)较低。在先前的研究中，Presta及其同事通过广泛丙氨酸扫描(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001)；Presta美国专利6,737,056)鉴定了三个Fc变体，N434A、E380A和T307A，其分别将FcFcRn的亲和力增加了3.5倍，2.2倍和1.8倍。该三元变体在pH6相对于野生型而言对FcRn的亲和力增加了12倍。通过推断人FcFcRn和大鼠Fc-FcRn(其X线结构是已知的)之间的结构同源性(Burnmeisteretal.，Nature372336-343(1994)；Burnmeisteretal.，Nature372379-383(1994))，Dall′Acqua等(JournalofImmunology.1695171-5180(2002)；US2003/0190311)通过噬菌体展示研究了较高的亲和力增加。他们构建了Fc的四个随机文库，每个文库包含完全随机化的4或5个残基(即含有所有可能的氨基酸取代，得到具有204种多样性的两个文库，和具有205种多样性的两个文库)并用于选择对鼠FcRn的结合性。他们报道了采用人FcRn筛选文库的努力是不成功的。虽然采用鼠FcRn从噬菌体选择中鉴定的结合亲和力的增加也增加了对人FcRn的结合性，采用所述方法用人FcRn的直接噬菌体选择被报道是不成功的(Dall′Acqua等，2002)。从这些文库中，他们鉴定了在H433、N434和Y436以及在M252、S254以及T256存在突变的变体。已发现他们的文库来源的变体中的两个(H433K+N434F+Y436H和M252Y+S254T+T256E)在pH6.0对于鼠和人FcRn具有10倍-20倍增加的亲和力。这些突变的组合导致与鼠FcRn的结合增加了30倍而且与人FcRn的结合增加了57倍。但是，这些变体在pH7.4的亲和力也增加，而且在小鼠中的半衰期没有增加。这支持了如下结论，有效的IgG再循环与pH依赖性亲和力相关。关于灵长类或在人FcRn转基因动物中的这些变体的结果尚无报道。Ward等，美国专利6,277,375，美国专利6,821,505和美国专利6,165,745描述了半衰期增加的以及Fc434位突变的免疫球蛋白样区。所得变体N434Q确实显示出半衰期降低。Israel及Simister在WO98/23289中指出通常通过添加、取代或缺失残基而改变残基434以便影响对FcRn的结合但没有提及何种残基应被取代或应添加何种残基。还通过推断与大鼠Fc-FcRn复合体的结构同源性(Burnmeister等，1997)从而构建人Fc-FcRn界面的模型，Hinton等(J.Biol.Chem.2796213-6216(2004))鉴定了人IgG2中的残基T250、L314和M428，其是对结合huFcRn具有重要性的残基。他们鉴定了突变T250Q和M428L，其分别在pH6.0对人FcRn的亲和力增加了大约3倍和7倍，而在pH7.5没有显著的结合。已报道联合变体T250Q+M428L亲和力增加了28倍。对于恒河猴FcRn观察到了相似的结合性。药物代谢动力学研究显示出具有这两个变体的IgG2抗体在恒河猴中具有延长大约1.9倍的清除半衰期(t1/2beta)。本领域中对于制备抗体存在持续的需求，尤其是具有改进的或调节的效应子功能的治疗性抗体。抗体工程的一个目的在于增加抗体的体内半衰期。这可以通过调节抗体与新生Fc受体(FcRn)的相互作用得以实现。本发明满足了这些以及其它需求。发明概述本发明提供了多肽，特别是比具有天然序列/野生型序列Fc区的多肽以更强的亲和力与FcRn和FcγRIII结合的抗体。这些Fc变体多肽和抗体具有具有被再利用和循环的优势而非被降解。血清半衰期增加有益于增加与抗体的接触(exposuretoantibody)并降低了包含Fc的多肽诸如Abs和其它抗体融合蛋白诸如免疫粘附素的施药频率。本发明提供了分离的多肽，所述多肽包括至少含有Asn434取代为Trp(N434W)的氨基酸取代的变体IgGFc区。第二种分离的多肽是如下多肽，其包括至少含有Asn434取代为His(N434H)的氨基酸取代的变体IgGFc区。本发明提供的另一种分离的多肽是如下多肽，其包括至少含有Asn434取代为Tyr(N434T)的氨基酸取代的变体IgGFc区，其中所述多肽不进一步含有选自H433R，H433S，Y436H，Y436R，Y436T的氨基酸取代。而另一种多肽是如下分离的多肽，其包括至少含有Asn434取代为Phe(N434F)的氨基酸取代的变体IgGFc区，其中所述多肽不进一步含有H433K、Y436H、M252Y、S254T或T256E的氨基酸取代。本发明提供了多肽，所述多肽含有变体IgGFc区，其中所述变体IgGFc区具有基本上由Asn434取代为Tyr(N434Y)组成的氨基酸取代，或具有由Asn434取代为Tyr(N434Y)组成的氨基酸取代。还提供了多肽，所述多肽含有变体IgGFc区，其中所述变体IgGFc区具有基本上由Asn434取代为Phe(N434F)组成的氨基酸取代，或具有由Asn434取代为Phe(N434F)组成的氨基酸取代。在一个实施方案中，前述实施方案中任一项的分离的多肽是抗体。在另一个实施方案中，所述多肽是免疫粘附素。在优选的实施方案中，前述实施方案中任一项的IgG抗体是鼠或人的，优选是人的IgG抗体。人IgG包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的任何人IgG同种型。鼠IgG包括IgG1、2a、2b、3的同种型。优选的，用于人的治疗性抗体是人源化的，人的或嵌合的。在包括抗体的前述多肽中，与包含天然序列IgGFc区域的多肽相比，包含变体Fc区的多肽在pH6.0对人FcRn的结合亲和力更强，并且在pH7.4或pH7.5的结合亲和力低于在pH6.0的结合亲和力。在优选的实施方案中，Fc变体多肽在pH6.0对人FcRn的结合亲和力比天然序列/天然序列Fc至少高4倍，优选至少7倍、9倍、甚至更优选的至少20倍。前述实施方案的多肽在灵长类血清，尤其是在人或短尾猴(cynomolgusmonkey)血清中的血清半衰期长于含有天然序列Fc区的多肽。而本发明的另一方面是分离的多肽，所述多肽包括至少含有Lys334取代为Leucine(K334L)的氨基酸取代的变体IgGFc区。在另一实施方案中，该多肽对人FcγRIII的结合亲和力高于含有天然序列IgGFc区的多肽，高3倍以上。该多肽还优选表现出ADCC高于含有天然序列IgGFc区的多肽。还提供了分离的多肽，所述多肽包含变体IgGFc区，所述多肽表现出在pH6对人FcRn的结合力增加，而在pH7.4结合力不增加，所述多肽至少包含G385H、D312H或N315H的氨基酸取代。在另一实施方案中，前述实施方案任一项的分离的多肽是抗体。在另一实施方案中，所述多肽是免疫粘附素。在优选的实施方案中，前述实施方案中任一项的IgG抗体是鼠的或人的，优选是人的。人IgG包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的任何人IgG同种型。鼠IgG包括IgG1、2a、2b、3的同种型。优选的，用于人的治疗性抗体是人源化的，人的或嵌合的。本发明特别提供了前述实施方案的抗体，其结合选自CD20，Her2，BR3，TNF、VEGF、IgE和CD11a。在特定实施方案中，结合特定抗原的重组制备的、人源化抗体包含的序列如下面题目为抗体组成的章节中的SEQIDNO所示。在优选的实施方案中，CD20是灵长类CD20。人和短尾猴CD20是具体的实施方案。在更具体的实施方案中，在抗体结合人CD20时，抗体包含SEQIDNO.2的VH序列和包含SEQIDNO.1的VL序列的L链或SEQIDNO.26的全长L链序列。在另一实施方案中，结合CD20的抗体包含来自SEQIDNO.24的C2B8VL序列和来自SEQIDNO.25的VH序列，如图10中所示。而在另一实施方案中，结合人CD20的分离的人源化抗体包含如下面所示的人源化2H7变体的VH和VL序列。在更具体的实施方案中，在抗体结合人HER2时，抗体包含选自SEQIDNO.3的VL序列配对SEQIDNO.4的VH序列；以及SEQIDNO.5的VL序列配对SEQIDNO.6的VH序列的VL和VH序列。一种具体的抗HER2抗体包括至少含有Asn434取代为His(N434H)的氨基酸取代的变体IgGFc区。此外，本发明提供了分离的抗HER2抗体，该抗体包含SEQIDNO.5的VL序列，SEQIDNO.6的VH序列，以及至少含有Asn434取代为Ala(N434A)的氨基酸取代的变体IgGFc区。在优选的实施方案中，所提供的VH和VL序列与人IgG1恒定区连接，其序列如图4和图5中所示。一方面，前述实施方案的抗体进一步包含在Fc区中一个或多个氨基酸取代，所述取代导致所述抗体与含有天然序列Fc区的抗体相比，表现选自下列的一种或多种特性FcγR结合力增强，ADCC增强，CDC增强，CDC减弱，ADCC和CDC增强，ADCC增强而CDC功能减弱，FcRn结合力增强和血清半衰期延长。前述实施方案的抗体可进一步包含在IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸取代，所述残基位点选自D265A，S298A/E333A/K334A，K334L，K322A，K326A，K326W，E380A和E380A/T307A，其中残基的编号是如Kabat所述的EU标号。其中多肽包含K334L的氨基酸取代，其可进一步包含在IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸取代，所述残基位点选自D265A，S298A/E333A，K322A，K326A，K326W，E380A和E380A/T307A。本发明还提供了包含前述实施方案的任一项的多肽或抗体和载体(诸如药学上可接受的载体)的组合物。本发明的另一方面是编码前述实施方案任一项的多肽的分离的核酸。还提供了编码多肽的表达载体，所述多肽包括本发明的抗体。还提供了包含核酸的宿主细胞，所述核酸编码本发明的多肽或抗体。表达并产生多肽的宿主细胞包括CHO细胞或大肠杆菌细菌细胞。还提供了制备本发明的多肽、抗体和免疫粘附素的方法，包括培养包含核酸的宿主细胞，所述核酸编码所述多肽，宿主细胞产生所述多肽，和从细胞培养物中回收所述多肽。本发明的另一方面是包括容器及其中包含的组合物的制品，其中组合物包含前述实施方案任一项的多肽或抗体。所述制品可进一步包括包装插页，其说明所述组合物可用于治疗抗体意在治疗的适应症。本发明提供了治疗特征在于B细胞表达CD20的B细胞肿瘤或B细胞恶性病变的方法，包括对患有所述B细胞肿瘤或B细胞恶性病变的患者施用治疗有效量的上述实施方案的CD20结合性抗体，特别地，人源化CD20结合性抗体。在特定的实施方案中，B细胞肿瘤是非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma，NHL)，小淋巴细胞性(smalllymphocyte，SL)NHL，淋巴细胞为主型何杰金病(lymphocytepredominantHodgkin’sdisease，LPHD)，囊泡中心细胞(follicularcentercell，FCC)淋巴瘤，急性淋巴细胞性白血病(ALL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和毛细胞性白细胞(hairycellleukemia)。实施方案中提供了治疗慢性淋巴细胞性白血病的方法，包括对患有所述白血病的患者施用治疗有效量的包含前述实施方案的变体IgGFc的抗体，所述抗体结合人CD20，其中所述抗体进一步包含氨基酸取代K326A或K326W。另一方面是缓解B细胞调节性自身免疫性疾病的方法，包括对患有所述疾病的患者施用治疗有效量的CD20结合性抗体，所述抗体包含前述实施方案的变体IgGFc。在特定实施方案中，自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎，青少年型类风湿性关节炎(juvenilerheumatoidarthritis)，系统性红斑狼疮(SLE)，韦格纳病(Wegener’sdisease)，炎性肠病(inflammatoryboweldisease)，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(thromboticthrobocytopenicpurpura，TTP)，自身免疫性血小板减少症，多发性硬化症(multiplesclerosis)，银屑病，IgA肾病，IgM多发性神经病，重症肌无力，血管炎，糖尿病，雷诺氏(Reynaud’s)综合征，斯耶格伦氏(Sjogren′s)综合征和肾小球肾炎。提供的其它治疗方法如下述提供了治疗血管发生相关病症的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的包含前述实施方案的变体IgGFc的VEGF结合抗体。治疗HER2表达性癌症的方法，包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的包含前述实施方案的变体IgGFc的HER2结合抗体。治疗LFA-1介导的病症的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的包含前述实施方案的变体IgGFc的抗体，所述抗体结合人抗CD11a。治疗IgE介导的病症的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的包含前述实施方案的变体IgGFc的抗体，所述抗体结合人IgE。本发明的另一方面是筛选多肽的方法，所述多肽在pH6.0与FcRn的结合亲和力较高，而在pH7.4的结合亲和力低于在pH6.0的结合亲和力。优选地，与含有天然序列IgGFc区域的多肽或抗体相比，所述多肽在pH6.0与人FcRn的结合亲和力较高。所述方法包括在噬菌体上表达候选多肽，提供在固体基质上固定的huFcRn，使噬菌体颗粒与基质上的FcRn结合，通过多次洗涤除去没有结合的噬菌体颗粒，每次洗涤的严格性(stringency)递增，然后在pH7.4洗脱剩余的结合的噬菌体。附图简述图1是天然IgG以及其被酶消化产生不同抗体片段的示意图。CH1和CL结构域以及两个CH2结构域之间的二硫键用S-S代表。V是可变区；C是恒定区；L链表示轻链，H链表示重链。图2A和2B表示抗Her2抗体(Trastuzumab)的VL(图2A；SEQIDNo.5)和VH(图2B；SEQIDNo.6)的氨基酸序列。图3A和图3B表示特异性抗IgE抗体E25，E26，E27和Hu-901的轻链和重链的氨基酸序列。图4描述天然序列人IgGFc区序列，humIgG1(非A和A同种异型；分别是SEQIDNO29和30)，humIgG2(SEQIDNO31)，humIgG3(SEQIDNO32)和humIgG4(SEQIDNO33)的序列对比，序列间的差异用星号标记。图5描述天然序列IgGFc区的序列对比。显示了天然序列人IgGFc区序列，人IgG1(humIgG1)(非A和A的同种异型)(分别为SEQIDNO29和30)，人IgG2(SEQIDNO31)，人IgG3(SEQIDNO32)和人IgG4(SEQIDNO33)。人IgG1序列是非A的同种异型(allotype)，在人IgG1序列下面显示这个序列与A同种异型之间的差别(在位点356和358；EU编号系统)。同样显示了天然序列鼠IgGFc区序列，鼠IgG1(murIgG1)(SEQIDNO34)，鼠IgG2A(SEQIDNO35)，鼠IgG2B(SEQIDNO36)和鼠IgG3(SEQIDNO37)。图6描述FcRn在IgG内环境稳定中的作用。泡囊中的椭圆形是FcRn。图7表示用于噬菌体展示的人IgG1Fc蛋白变体(W0437)的序列。显示了可溶性Fc的成熟蛋白序列(SEQIDNO.38)；用于噬菌体展示的M13g3p部分没有显示。成熟蛋白序列中的第一个残基Ser与铰链区的第二位的Cys(C229)的突变对应，并且最后的残基(Leu)是融合到M13g3p的位点。加下划线的残基与N434对应。图8表示在pH6.0通过SPR(BIAcore)与人FcRn结合的大肠杆菌产生的野生型和变体Fc的平衡分析(equilibriumanalysis)。图9表示与人FcRn结合的2H7IgG1变体的ELISA检测。通过在哺乳动物细胞中的瞬时转染产生人IgG1变体，然后与人源化的4D5(赫赛汀(Herceptin))对于在pH6.0或pH7.4结合FcRn相比较。中性抗生物素(NeutrAvidin)膜/FcRn-生物素化的/抗体/山羊抗hu-IgG-F(ab)’2-HRP结合(pH6.0)和解离(pH7.4)。图10表示C2B8轻链(SEQIDNO.24)和重链(SEQIDNO.25)序列。恒定区和Fc区位于框内，可变区位于框外。图11表示2H7变体与人FcγRIII(V158)的结合亲和力的ELISA结果。图12表示在单次IV剂量(singleIVdose)20mg/kg之后，短尾猴中PRO145234，PRO145181，和PRO145182的血清浓度-时间图。图13表示同样通过ELISA检测的赫赛汀和hu4D5(N434H)与人FcRn在pH6.0和pH7.4的结合力。优选实施方案的详述IgG内稳态的一个重要组成部分是通过Fc区与细胞表面新生受体(FcRn)的pH依赖相互作用介导的再循环途径。抗体工程领域的主要目标在于鉴定Fc中的突变，所述突变能够增加在pH6.0时Fc-FcRn复合物的亲和力，而保持在pH7.4的低亲和力(Ghetie等，1997)。而且，非常需要将引入Fc的突变数目最小化，以便避免在用高度保守恒定区中包含突变的治疗性抗体治疗的患者中产生潜在的抗药免疫反应。在本发明中，通过使用噬菌体展示和构建随机化氨基酸的文库的新方法，我们鉴定了增加Fc对于人FcRn的亲和力的单氨基酸突变(N434W，N434Y和N434F；本文用于IgGFc区的编号系统是EU标号法，如Kabat，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1991)所述)，N434W变体在pH6.0将Fc结合亲和力增加了大约170倍，并在pH7.4保持对huFcRn的低亲和力。结合FcRn的检测方法是已知的(例如参见，Ghetie1997，Hinton2004)并在实施例中进行了描述。例如，可以在表达人FcRn的转基因小鼠或转基因人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类中，检测人FcRn高亲和力结合多肽体内结合人FcRn以及血清半衰期。在独立的实施方案中，含有变体IgGFc的多肽且尤其是本发明的抗体表现出对于人FcRn的结合亲和力比含有野生型IgGFc的多肽高至少7倍，至少9倍，更优选地至少20倍，优选地至少40倍，甚至更优选地，至少70-100倍。在特定实施方案中，对于人FcRn的结合亲和力增加了大约70倍。本发明还提供了分离的多肽，所述多肽包括至少含有Lys334取代为亮氨酸(K334L)的氨基酸取代的变体IgGFc区。该多肽结合人FcγRIII的亲和力高于天然序列IgGFc的，例如高3倍以上。这些多肽优选表现出在存在人效应细胞时ADCC高于含有天然序列IgGFc的多肽。当抗体是CD20结合性抗体时，ADCC活性可在表达人CD20加CD16(hCD20+/hCD16+Tg小鼠)的转基因小鼠中检测。用于ADCC的检测法例如参见Presta美国专利6,737,056。在一个实施方案中，关于针对FcRn的结合亲和力，多肽的EC50或表观Kd(在pH6.0)是＜＝100nM，更优选地＜＝10nM。在一个实施方案中，关于针对FcγRIII(F158；即低亲和力同种型)增加的结合亲和力，EC50或表观Kd＜＝10nM，而关于FcgRIII(V158；高亲和力)，EC50或表观Kd＜＝3nM。在本说明书和权利要求中，免疫球蛋白重链中残基的编号法是如在Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版，PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD(1991)(在此特别引入本文作为参考)所述的EU标号。“如Kabat所述的EU标号”指人IgG1EU抗体的残基编号。“亲本多肽”指包括下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列缺少一或多个在此公开的Fc区修饰，并且与在此公开的多肽变体相比有不同的效应子功能。所述亲本多肽可以包括天然序列Fc区或具有先前存在的氨基酸序列修饰(例如添加、缺失和/或取代)的Fc区。术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端，如图1所示。所述“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常定义为从氨基酸残基Cys226或从Pro230到其羧基末端的一段序列。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定区，CH2和CH3，例如如图1所示。位于IgG1重链最后的赖氨酸残基可以但是不是必须作为末端残基存在于成熟蛋白的Fc中。人IgGFc区的“CH2结构域”(也称为“Cγ2”结构域)通常从约氨基酸231延伸到约氨基酸340。所述CH2结构域的独特性在于它不与其它结构域紧密成对。而是两个N连接的分支糖链介于完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测所述糖可以为结构域-结构域配对提供取代物，并且帮助稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985)。“CH3结构域”包括Fc区中从C末端到CH2结构域的一段残基(即IgG中从大约氨基酸残基341到约氨基酸残基447)。“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应子功能”。“效应子功能”的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒作用；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体，BCR)等。此效应子功能通常需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)组合，且能用诸如本文公开的各种检测方法检测。“天然序列Fc区”包括与自然中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区在图4和5中给出，其包括天然序列人IgG1Fc区(非-A和A同种异型)；天然序列人IgG2Fc区；天然序列人IgG3Fc区；天然序列人IgG4Fc区以及其自然发生的变体。天然序列鼠Fc区见图5。“变体Fc区”包括以至少一个在此定义的“氨基酸修饰”而区别于Fc区天然序列的氨基酸序列。优选所述变体Fc区与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比，具有至少一个氨基酸取代，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约1到约10个氨基酸取代，优选约1到约5个氨基酸取代。所述变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区至少有大约80％的同源性，最优选至少与其大约90％同源，更优选至少与其大约95％同源。“同源性”定义为在序列对比和必要时为获得同源性最大百分率而引入空隙后变体的氨基酸序列中相同残基的百分率。用于序列对比的方法和计算机程序在本领域中众所周知。如“Align2”，GenentechInc所有，其与用户手册一起于1991年12月10日提交美国软件局(UnitedStatesCopyrightOffice)，华盛顿特区20559。术语“含Fc区的多肽”指包括Fc区的多肽，例如抗体或免疫粘附素(见下述定义)。术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与IgG抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。在一个具体实施方案中，FcR是包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类(包括其等位基因变体及这些受体的其它剪接形式)的FcγR。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活性受体”)和FcγRIIB(“抑制性受体”)，其具有相似的主要区别在其细胞浆结构域的氨基酸序列。激活性受体FcγRIIA在其细胞浆结构域中包含以免疫受体酪氨酸为基础的激活基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其细胞浆结构域中包含以免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(ITIM)。(参见Daron的综述M，Annu.Rev.Immunol15203-234(1997))。该术语包括同种异型，例如FcγRIIIA同种异型FcγRIIIA-Phe158，FcγRIIIA-Val158，FcγRIIA-R131和/或FcγRIIA-H131。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9457-92(1991)；Capel等，Immunomethods425-34(1994)；和deHaas等，J.Lab.Clin.Med.126330-41(1995)中对FcR进行了综述。其它FcR，包括将来被鉴定的FcR均包含在本文术语“FcR”中。该术语还包括负责将母体IgG转运给胎儿的新生受体(neonatalreceptor)FcRn。(Guyer等，J.Immunol.117587(1976)和Kim等，J.Immunol..24249(1994))。“抗体依赖性细胞介导的细胞毒”或“ADCC”指分泌性Ig结合到存在于某些细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞、巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)上，能够使这些细胞毒效应细胞与携带抗原的靶细胞特异结合，然后用细胞毒素杀伤所述靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，而且抗体是所述杀伤所绝对需要的。介导ADCC的主要细胞即NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9457-92(1991)第464页上的表3中总结了在造血细胞上的FcR表达。为了评估兴趣分子的ADCC活性，实施体外ADCC检测，诸如美国专利5,500,362或5,821,337中所述。适用于此类检测的“效应细胞”包括外周血单个核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或此外，可以在体内，例如在诸如Clynes等.PNAS(USA)95652-656(1998)中所述的动物模型体内评估兴趣分子的ADCC活性。“人效应细胞”是白细胞，其表达一或多种FcR并且发挥效应子功能。优选这些细胞至少表达FcγRIII并且发挥ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞，优选PBMC和NK细胞。所述效应细胞可以从其天然来源，例如血液或在此叙述的PBMC中分离。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指在存在补体时分子溶解靶细胞。补体激活途径是由补体系统第一组分(C1q)结合与相关抗原结合的抗体(其适合的亚类)。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如Gazzano-Santoroetal.，J.Immunol.Methods202163(1996)中所描述的。具有“改变的”FcR结合亲和力或ADCC活性的变体IgGFc的多肽是指与亲本多肽或含天然序列Fc区的多肽相比，具有提高的或降低的FcR结合活性(FcγR或FcRn)和/或ADCC活性的多肽。所述对FcR“展示增强的结合”的变体Fc以比亲本多肽更强的亲和力结合至少一种FcR。与亲本多肽相比结合力可以提高约3倍，优选约5，10，25，50，60，100，150，200，至500倍，或结合力约25％-1000％的提高。所述对FcR“展示降低的结合”的多肽变体以比亲本多肽更弱的亲和力结合至少一种FcR。与亲本多肽相比结合力可以降低约40％或更多。这类展示对FcR降低的结合的Fc变体可几乎或完全不与FcR结合，例如与FcR的结合为与天然序列IgGFc区相比的0-20％(如本文实施例部分所测)。以比具有野生型或天然IgGFc序列的肽或亲本多肽“更强的亲和力”或“更高的亲和力”与FcR结合的具有变体Fc的多肽，是指当结合试验中具有变体Fc的多肽和亲本多肽的量基本相同时，以基本上比具有天然Fc序列的亲本多肽更强的亲和力与任一或更多种上述鉴定的FcR结合的多肽。例如，所述与FcR结合亲和力增强的变体Fc多肽可展示比亲本多肽强约2-约300倍，例如约3-约170倍的FcR结合亲和力，其中，例如按照本文实施例所述测定FcR结合亲和力。包含“展示增高的ADCC”或在人效应细胞存在的条件下比具有野生型IgGFc的多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的变体Fc区的多肽是，当试验中具有变体Fc区的多肽和具有野生型Fc区的多肽的量基本相同时，在体外或体内更有效介导ADCC的多肽。通常这类变体可用本文公开的体外ADCC试验鉴定，但也可用其它测定ADCC活性的试验或方法，例如在动物模型等中实施。优选的变体介导ADCC的效力比野生型Fc高约5-约100倍，例如约25-约50倍。“氨基酸修饰”是指预定氨基酸序列中的改变。修饰实例包括氨基酸取代、插入和/或缺失。在此优选的氨基酸修饰是取代。特定位点，例如Fc区的“氨基酸修饰”指特定残基的取代或缺失，或指在特定残基附近插入至少一个氨基酸残基。在特定残基“附近”插入指在距其一到二个残基之处插入。该插入可在特定残基的N端或C端。“氨基酸取代”是指用另一个不同的“取代”氨基酸残基取代预定氨基酸序列中已存在的至少一个氨基酸。所述取代残基可以是“天然氨基酸残基”(即由遗传密码编码)且选自丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组胺酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。优选所述的取代残基不是半胱氨酸。用一或多个非天然氨基酸残基进行的取代也包含在本文的氨基酸取代的定义中。“非天然氨基酸残基”指除上文所列天然氨基酸残基以外的，能在肽链中与相邻氨基酸残基共价结合的那些。非天然氨基酸残基包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、同型丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，如Ellman等，Meth.Enzym.202301-336(1991)所述的那些。为了制备这些非天然氨基酸，可以应用Noren等，Science244182(1989)和Ellman等，出处同上的方法。简言之，这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基化学激活抑制性tRNA，随后进行该RNA的体外转录和翻译。本发明中使用的术语“保守性”氨基酸取代意指取代功能上等价的氨基酸的氨基酸取代。保守性氨基酸改变导致所得肽的氨基酸序列中的沉默改变。例如，具有相似极性的一个或多个氨基酸承当功能等价物，可以导致肽的氨基酸序列中的沉默改变。一般而言，基团中的取代可被认为是在结构和功能上保守的。然而，本领域技术人员应能理解的是特定残基的作用是由存在所述残基的分子的三维结构中的环境所决定的。例如，Cys残基可出现在氧化(二硫化物)构型中，其极性低于还原(巯醇)构型。Arg侧链的长脂肪族部分构成其结构或功能作用的重要特征，其可通过非极性而非另一碱性残基的取代得到最佳的保留。而且，应能得到理解的是包含芳香族基团(Trp、Tyr和Phe)的侧链能够参与离子性-芳香族或“阳离子-pi”相互作用。在这些情况中，酸性基团或不带电荷的极性基团的成员对这些侧链之一的取代在结构和功能上是保守性的。诸如Pro、Gly和Cys(二硫化物形式)的残基可以对主链构象产生直接的作用，通常无法在无结构变形的情况下进行取代。“氨基酸插入”是指向预定氨基酸序列中掺入至少一个氨基酸。虽然所述插入通常包括一或二个氨基酸残基的插入，但本申请考虑了更大的“肽插入”，例如约3-约5个或高达约10个氨基酸残基的插入。被插入的残基可以是上述的天然或非天然残基。“氨基酸缺失”是指从预定氨基酸序列中除去至少一个氨基酸残基。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，第2版，73-75页，WorthPublishers，NewYork，1975)(1)非极性的Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)(2)不带电荷极性的Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)(3)酸性的Asp(D)、Glu(E)(4)碱性的Lys(K)、Arg(R)、His(H)或者，根据共同的侧链特性，可将天然存在的残基如下分组(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性的Asp、Glu；(4)碱性的His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基Gly、Pro；(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。“铰链区”通常定义为从人IgG1的Glu216到Pro230的一段序列(Burton，Molec.Immunol.22161-206(1985))。通过将形成重链内S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸放置在相同的位置上，可以将其它IgG同种型的铰链区与IgG1序列对比排列。Fc区的“低铰链区”通常定义为从铰链区最接近C末端即Fc区的残基233到残基239的一段序列。在本发明之前，FcγR结合通常归因于IgGFc区的低铰链区中的氨基酸残基。“C1q”是包括针对免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q与两个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s共同形成复合物C1，其是补体依赖性细胞毒(CDC)途径中的第一个组分。人C1q可从如Quidel，SanDiego，CA等厂家购得。术语“结合结构域”是指多肽中结合另一分子的区域。对于FcR，结合结构域可以包括其多肽链(例如其α链)中负责与Fc区结合的部分。一个有用的结合结构域是FcRα链的细胞外结构域。术语“抗体”是指最广泛意义上的抗体，特别包括单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们呈现所需生物学活性。本发明的抗体的“功能性片段”包含完整抗体的一部分，通常包含完整抗体的抗原结合区或可变区，或是抗体中保留FcR结合能力的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在本文中应用的术语“单克隆抗体”是指得自基本同源之抗体群的抗体，即包括在所述群体中的各个抗体除了可能少量出现的突变外是相同的。单克隆抗体具有高度特异性，直接针对单个抗原性位点。而且，与通常含有针对不同决定簇(表位)之不同抗体的传统(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优势在于其通过杂交瘤合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指抗体的得自基本同源性抗体群的特点，不应理解为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明所用的单克隆抗体可以通过杂交瘤方法制备(此方法首先在Kohler等，Nature，256495(1975)中叙述)，或可以通过重组DNA方法制备(例如见美国专利4,816,567)。还可利用如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)所述方法，从噬菌体抗体文库中分离“单克隆抗体”。本文中的单克隆抗体尤其包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与来自特定物种或属于特定抗体类型或亚类之抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分同源或相同于来源于另一物种或属于另一抗体类型或亚类的抗体的相应序列，以及这类抗体的片段，只要它们表现所需生物学活性(美国专利4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。制备嵌合抗体的方法是本领域已知的。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是包含来源于非人免疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供者抗体)，例如小鼠、大鼠、兔的具有所需特异性、亲和力和能力的CDR的残基取代。在一些实例中，人免疫球蛋白Fv框架区(FR)的残基被相应的非人类残基代替。而且，人源化抗体可以包括在受者抗体或引入的CDR或框架序列中没有的残基。这些修饰用于进一步改进或最大化抗体性能。通常，人源化抗体包含至少一个，通常两个基本上全部的可变区，其中所有或基本上所有的超变环均对应于非人免疫球蛋白的超变环，而且所有或基本上所有的FR区是人免疫球蛋白序列的FR区，尽管所述FR区可包括一个或多个能够提高结合亲和力的氨基酸取代。FR中的这些氨基酸取代的数目通常在H链中不多于6个，而在L链中，不多于3个。人源化抗体还任选至少包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常是人免疫球蛋白的一部分。更多细节参见Jonesetal.，Nature321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature332323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。人源化抗体包括PRIMATIZED抗体，其中抗体的抗原结合区来源于通过例如用感兴趣的抗原免疫恒河猴制备的抗体。制备人源化抗体的方法是本领域已知的。人抗体(humanantibody)还可采用本领域已知的多种方法进行制备，包括噬菌体展示文库。Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222581(1991)。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体。Cole等，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985)；Boerner等，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)。本文所使用的术语“免疫粘附素”是指抗体样分子，其将异源蛋白(粘附素)的结合特异性与免疫球蛋白恒定区的效应子功能结合在一起。在结构上，免疫粘附素包含抗体的抗原识别和结合位点之外的(亦即，是“异源性的”)具有所需结合特异性的氨基酸序列与免疫球蛋白恒定区序列的融合体。免疫粘附素分子的粘附素部分通常是连续的氨基酸序列，至少包含受体或配体的结合位点。免疫粘附素中免疫球蛋白恒定区序列可获自于任何免疫球蛋白，诸如IgG-1、IgG-2、IgG-3或IgG-4亚型，IgA(包括IgA-1和IgA-2)、IgE、IgD或IgM。例如，根据本发明可用的免疫粘附素是如下多肽，其中包含BLyS受体的BlyS结合部分，而不包含BLyS受体的跨膜区或细胞质区序列。在一个实施方案中，BR3，TACI或BCMA的胞外区与免疫球蛋白序列的恒定区融合。“融合蛋白”以及“融合多肽”是指具有通过共价键连接在一起的两个部分的多肽，其中各个部分是具有不同特性的多肽。所述特性可以是生物学特性，诸如体外或体内的活性。所述特性还可以是简单的化学或物理特性，诸如与靶分子结合，催化反应等。两个部分可以通过单个肽键直接连接或通过包含一个或多个氨基酸残基的肽连接子相连。一般而言，所述两个部分和所述连接子位于彼此的阅读框中。“分离的”多肽或抗体指已经由其天然环境的一种成分鉴别和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染成分指将会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95％，最优选重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)通过使用考马斯蓝或优选银染的还原或非还原条件下的SDS-PAGE达到同质。既然抗体的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。本发明的CD20结合性和人源化CD20结合性抗体的生物学活性至少包括抗体与人CD20的结合，更优选与人和其它灵长类CD20的结合(包括猕猴、恒河猴、猩猩)。抗体与CD20结合的Kd值不高于1×10-8，优选Kd值不高于大约1×10-9，当与没有用所述抗体治疗的适当阴性对照比较时，其能够杀死或耗竭体内B细胞，优选至少20％体内B细胞。一种或多种ADCC、CDC或其它机制的结果可以是B细胞耗竭。在本文某些疾病治疗的实施方案中，特定的效应子功能或机制可能优于其它的效应子功能或机制，并且优选人源化2H7的特定变体实现这些生物学功能，诸如ADCC。“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“缓解(alleviation)”是指治疗学治疗，其中目的是减少或减慢靶定的病理病症或紊乱。如果在根据本发明的方法接受了治疗量的本发明的CD20结合性抗体之后，所述个体显示出特定疾病的一种或多种体征和症状的可观测的和/或可检测的减少和消失，则个体得以成功“治疗”例如CD20阳性癌症或自身免疫性疾病。例如，对于癌症，大量癌细胞的减少或癌细胞的消失；降低肿瘤大小；肿瘤转移的抑制(亦即，某种程度上减缓和优选停止)；在某种程度上抑制肿瘤生长；缓解期延长，和/或与特定癌症相伴随的一种或多种症状的某种程度上缓解；发病率和死亡率降低，生活质量的改善。疾病体征或症状的减少还可由患者进行感知。治疗可以得到完全响应(定义为癌症所有体征消失)，或部分响应，其中肿瘤的大小降低，优选大小降低超过50％，更优选75％。如果患者的疾病稳定，也可认为患者得到了治疗。在优选的实施方案，癌症患者在一年后，优选15月后仍然没有癌症进展(progression-free)。用于评估疾病得到成功治疗和改善的那些参数是可通过本领域技术人员熟知的常规方法检测的。“治疗有效量”指在患者中有效“治疗”疾病或病症的抗体或药物的量。关于癌症，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；降低肿瘤的大小；抑制(亦即，某种程度上减缓和优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(亦即，某种程度上减缓和优选停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或某种程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。参见上述“治疗”的定义。根据药物可阻止生长和/或杀死存在的癌症细胞的程度，所述药物可以是抑制细胞性的和/或细胞毒性的。“慢性(长期)”施用是指与急性模式(acutemode)相反，以持续性模式施用药剂，以便在长期时间内保持初始治疗作用(活性)。“周期性(intermittent)”施用是非连续性无间断进行的治疗，而具有周期性的特性。这里使用的术语″细胞毒剂″指抑制或阻止细胞功能和/或导致细胞发生破坏的物质。该术语包括放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(vincaalkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它插入剂、酶和其片段，例如溶核酶、抗生素，毒素，例如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体、以及下文公开的各种抗肿瘤和抗癌剂。其它的细胞毒剂描述如下。本文使用的“生长抑制剂”是指在体外或体内抑制细胞尤其是表达CD20的癌细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是能够显著性降低表达PSCA的S期细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻滞细胞周期进展(位于S期之外的时期)的药剂，诸如诱导G1停滞和M-期停滞的药剂。典型的M期阻断剂包括长春药属(vinca)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、紫杉烷类(taxane)和拓扑异构酶II抑制剂，例如，多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻断G1的制剂也可以延伸到S期阻断，例如DNA烷化剂，如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(fluorouracil)和ara-C。在TheMolecularBasisofCancer，MendelsohnandIsrael，eds.，Chapter1，entitled″Cellcycleregulation，oncogenes，andantineoplasticdrugs″byMurakamietal.(WBSaundersPhiladelphia，1995)中，特别是13页可以发现更多信息。紫杉烷类(紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel))都是由紫杉树获得的抗癌药。由欧洲紫杉获得的多西他赛(TAXOTERE，Rhone-PoulencRorer)是紫杉醇(TAXOL，Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进微管蛋白二聚体组装成微管，并通过防止解聚作用稳定微管，这会导致细胞有丝分裂受到抑制。“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类，诸如噻替哌(thiotepa)和环磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯类(alkylsulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺类(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogenmustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如甲酰四氢叶酸(folinicacid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK；雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonicacid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL，Bristol-MyersSquibbOncology，Princeton，NJ)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE，Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C(mitomycinC)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞宾(vinorelbine)；诺维本(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸(retinoicacid)；埃斯波霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，诸如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟泰米芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；及上述任何物质的制药学可接受的盐、酸或衍生物。本文所使用的“载体”包括制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，其在所采用的剂量和浓度对所施用的细胞或哺乳动物是无毒的。通常生理学上可接受的载体是水性pH缓冲溶液。生理学上可接受的载体的实例包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇诸如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)或PLURONICSTM。术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养和耕作动物，以及动物园、体育用动物或宠物动物，诸如狗、马、猫、牛等。优选地，本文的哺乳动物为人。组合物在特定实施方案中，抗体包含下述V区序列或全长序列但应含有本发明的能够增强一种或多种Fc效应子功能的Fc突变。本发明的多肽和抗体可进一步包括其它氨基酸取代，例如能够增强或降低其它Fc功能或进一步增强相同Fc功能，增强抗原结合亲和力，增强稳定性，改变糖基化，或包括同种异型变体。抗体可进一步包括Fc区中的一种或多种氨基酸取代，所述取代导致抗体表现一种或多种选自下列的特性与含有野生型Fc的多肽或抗体相比，FcγR结合增强，ADCC增强，CDC增强，CDC减弱，ADCC和CDC功能增强，ADCC增强但CDC功能减弱(例如最小化输液反应)，FcRn结合增强和血清半衰期延长。这些活性可通过本文所描述的方法进行检测。关于其它能够增强Fc功能的氨基酸改变可以参见美国专利6,737,056，将其引入本文作为参考。本发明的任何抗体可进一步包含能够减弱CDC活性的Fc区中至少一个氨基酸取代，例如至少包含取代K322A。参见美国专利6,528,624B1(Idusogie等)。能够增强ADCC和CDC的突变包括S298A/E333A/K334A同样引入本文作为三元(triple)Ala突变体。K334L增强对CD16的结合。K322A导致CDC活性减弱；K326A或K326W增强CDC活性，D265A导致ADCC活性减弱。WO03/035835(引入本文作为参考)中描述了能够增强ADCC功能的糖基化变体。稳定变体是表现出对于例如氧化、脱酰胺作用稳定性增强的变体。鼠HER2抗体4D5的重组人源化形式包括(huMAb4D5-8、rhuMAbHER2、Trastuzumab或赫赛汀(HERCEPTIN)；美国专利5,821,337)对于已经接受大量先前抗癌治疗的患有HER2过表达转移乳腺癌的患者具有临床活性(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。曲妥单抗(trastuzumab)已被食品与药品管理局于1998年9月25日批准进入市场用于治疗患有转移乳腺癌的患者，其肿瘤过表达HER2蛋白。具有多种特性的其它HER2抗体见于Tagliabueetal.Int.J.Cancer47933-937(1991)；McKenzieetal.Ocogee4543-548(1989)；Maieretal.CancerRes.515361-5369(1991)；Bacusetal.MolecularCarcinogenesis3350-362(1990)；Stancovskietal.PNAS(USA)888691-8695(1991)；Bacusetal.CancerResearch522580-2589(1992)；Xuetal.Int.J.Cancer53401-408(1993)；WO94/00136；Kasprzyketal.CancerResearch522771-2776(1992)；Hancocketal.CancerRes.514575-4580(1991)；Shawveretal.CancerRes.541367-1373(1994)；Arteagaetal.CancerRes.543758-3765(1994)；Harwerthetal.J.Biol.Chem.26715160-15167(1992)；美国专利5,783,186；以及Klapperetal.Oncogene142099-2109(1997)。在一个实施方案中，抗HER2抗体包含下述VL和VH区序列(CDR用粗体字表示)人源化2C4型式574抗体VL(SEQIDNO3)1102030405060|||||||||||||DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPS708090100110120||||||||||||RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK以及人源化2C4型式574抗体VH(SEQIDNO4)1102030405060|||||||||||||EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIY708090100110120||||||||||||NQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS在另一实施方案中，抗体HER2抗体包括Trastuzumab的VL(SEQIDNO.5)和VH(SEQIDNO.6)区序列，如图2A和图2B中所示。在特定实施方案中，本发明的抗VEGF抗体包括下述序列在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括下列序列的VL序列(SEQIDNO7)DIQMTQTTSSLSASLGDRVIISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSTVPWTFGGGTKLEIKR；和下列序列的VH序列(SEQIDNO8)EIQLVQSGPELKQPGETVRISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLETSASTAYLQISNLKNDDTATYFCAKYPHYYGSSHWYFDVWGAGTTVTVSS；在另一实施方案中，抗VEGF抗体包括下列序列的VL序列(SEQIDNO9)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR；和下列序列的VH序列(SEQIDNO10)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSS。在第三个实施方案中，抗VEGF抗体包括下列序列的VL序列(SEQIDNO11)DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKR；和下列序列的VH序列(SEQIDNO12)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYDFTHYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPYYYGTSHWYFDVWGQGTLVTVSS人源化抗CD11a抗体efalizumab或Raptiva(美国专利6,037,454)已由食品与药品管理局于2003年10月27日批准进入市场用于治疗银屑病。一个实施方案提供了包含本发明的Fc突变的抗人CD11a抗体，所述突变能够增强一种或多种Fc效应子功能，所述抗体包含HuMHM24的VL和VH序列，如下可变轻链(SEQIDNO13)HuMHM24DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIY110203040HuMHM24SGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQ60708090100HuMHM24GTKVEIKR可变重链(SEQIDNO14)HuMHM24EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGHWMNWVRQAPGKGLEWV110203040HuMHM24GMIHPSDSETRYNQKFKDRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR50a607080abc90HuMHM24GIYFYGTTYFDYWGQGTLVTVSS100110抗人CD11a抗体可包括SEQIDNO14的VH和具有下述序列的HuMHM24的全长L链DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASKTISKYLAWYQQKPGKAPKLLIYSGSTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNEYPLTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO15)在特定实施方案中，含有本发明的Fc突变的抗IgE抗体(所述突变能增强一种或多种Fc效应子功能)至少包含抗IgE抗体E25，E26，E27和Hu-901的V区序列，其L和H链序列显示于图3A和3B中。轻链序列如下E25L链(SEQIDNO.16)；E26L链(SEQIDNO.17)；E27L链(SEQIDNO.18)；以及Hu-901L链(SEQIDNO.19)。重链序列如下E25H链(SEQIDNO.20)；E26H链(SEQIDNO.21)；E27H链(SEQIDNO.22)；以及Hu-901H链(SEQIDNO.23)。对于图3A和3B中所示的抗IgE抗体，VL终止于VEIK(图3A中的残基111)而VH终止于VTVSS(图3B中残基#121周围)。E25，E26，E27和Hu-901抗体的VL序列分别是SEQIDNO.47，SEQIDNO.49，SEQIDNO.51和SEQIDNO.53。E25，E26，E27和Hu-901抗体的VH序列分别是SEQIDNO.48，SEQIDNO.50，SEQIDNO.52和SEQIDNO.54。在另一实施方案中，含有本发明的Fc突变的抗IgE抗体包含选自具有如图3A中所示序列的抗体任一项的L链E25L链(SEQIDNO.16)；E26L链(SEQIDNO.17)；E27L链(SEQIDNO.18)；以及Hu-901L链(SEQIDNO.19)。结合CD20抗原的抗体的实例包括“C2B8”，其现在被称为“利妥昔单抗”(“RITUXAN”)(美国专利5,736,137，其明确地引入本文作为参考)；钇-[90]-标记的2B8鼠抗体，名为“Y2B8”或“替伊莫单抗(IbritumomabTiuxetan)”ZEVALIN(美国专利5,736,137，其明确地引入本文作为参考)；鼠IgG2a“B1”，也被称为“托西莫单抗(Tositumomab)”，任选地用131I产生“131I-B1”抗体(碘I131托西莫单抗，BEXXARTM)(美国专利5,595,721，其明确地引入本文作为参考)；鼠单克隆抗体“1F5”(Pressetal.Blood69(2)584-591(1987)及其变体，包括“框架贴补的(frameworkpatched)”或人源化1F5(WO03/002607，Leung，S.)；ATCC保藏号HB-96450)；鼠2H7和嵌合2H7抗体(Clarketal.PNAS821766-1770(1985)；美国专利5,500,362，其明确地引入本文作为参考)；人源化2H7；huMax-CD20(WO04/035607，Genmab，Denmark)；AME-133(AppliedMolecularEvolution)；A20抗体或其变体诸如嵌合或人源化A20抗体(分别是cA20，hA20)(US2003/0219433，Immunomedics)；以及可获自InternationalLeukocyteTypingWorkshop的单克隆抗体L27，G28-2，93-1B3，B-C1或NU-B2(Valentineetal.，InLeukocyteTypingIII(McMichael，Ed.，p.440，OxfordUniversityPress(1987))。本文中术语“利妥昔单抗(rituximab)”或“RITUXAN”是指针对CD20抗原的基因工程化嵌合鼠/人单克隆抗体并且在美国专利5,736,137(其明确地引入本文作为参考)中将其命名为“C2B8”，包括其保留结合CD20能力的片段。C2B8轻链(SEQIDNO.24)和重链(SEQIDNO.25)序列见图10。其中标出了VL和VH。在特定实施方案中，结合CD20抗原的抗体包括下述人源化2H7v16抗体及其变体。人源化2H7v.16是指完整抗体或抗体片段，其中包含可变轻链序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO1)；和可变重链序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO2)当人源化2H7v.16抗体是完整抗体时，优选地，其包含v16全长轻链氨基酸序列2H7.v16轻链DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO26)；以及全长重链氨基酸序列2H7.v16重链EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO27)。除了下表中所示的氨基酸取代位置之外，基于型式16的所有其它变体的V区应含有v16的氨基酸序列。除非下面另有描述，2H7变体应含有与v16相同的L链。各型式(version)114、115、116、138、477、511包含VL序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR(SEQIDNO41)各型式96、114、115、116、138、477包含VH序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO42)前述人源化2H7mAb的一个变体是2H7v.31，其含有与上述v16相同的VL(SEQIDNO.1)和VH(SEQIDNO.2)以及L链(SEQIDNO.26)序列，以及全长H链氨基酸序列2H7v.31H链EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO28)。人源化2H7抗体的另一变体是2H7v.138，其含有SEQIDNO.39的L链和SEQIDNO.40的H链，如下2H7.v138轻链(SEQIDNO.39)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC2H7.v138重链(SEQIDNO.40)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK变体人源化2H7.v477含有SEQIDNO.39的L链序列和SEQIDNO.43的H链序列(含有氨基酸取代N434W)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHWHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO43)。v138的其它变体含有氨基酸取代N434Y或N434F。变体2H7.v114含有SEQIDNO.39的完整L链序列和完整H链氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSASYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO44)。变体2H7.v511包含上述SEQIDNO.41的VL和SEQIDNO.45的VHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.45)和SEQIDNO.45的VHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.45)2H7.v511具有上述SEQIDNO.39轻链序列而重链序列是EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSYRYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO.46)。还提供了包含芳香族残基F、Y、H或S取代N434的抗BR3抗体。本发明的方法本发明还提供了筛选多肽的方法，所述多肽在pH6.0与FcRn的结合亲和力高，而在pH7.4的结合亲和力低于在pH6.0的结合亲和力，如实施例所述。所述方法包括在噬菌体上表达候选多肽，提供在固体基质上固定的huFcRn，使噬菌体颗粒与基质上的FcRn结合，通过多次洗涤除去没有结合的噬菌体颗粒，每次洗涤严格性递增，然后在pH7.4洗脱剩余的结合的噬菌体。如实施例1中所述，严格性递增是指洗涤的次数和/或时间长度递增。可以使得洗脱的噬菌体进行繁殖然后从噬菌体中分离多肽。在一个实施方案中，多肽是包含IgGFc的多肽，诸如抗体或免疫粘附素。抗体制备单克隆抗体单克隆抗体可通过最初由Kohleretal.，Nature256495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(美国专利4,816,567)。在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice，59-103(AcademicPress，1986))。将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞(也被称为融合配偶体)生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择培养基通常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的融合配偶体骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对针对未融合的亲本细胞进行选择的选择培养基敏感的骨髓瘤细胞。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如可从SalkInstituteCellDistributionCenter(SanDiege，California，USA)购得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的衍生细胞系，以及可从美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland，USA)购得的SP-2或衍生系例如X63-Ag8-653细胞。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已有描述(Kozbor，J.Immunol.1333001(1984)；以及Brodeuretal.，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，51-63(MarcelDekker，Inc.，NewYork，1987)。可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对抗原的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射性免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munsonetal.，Anal.Biochem.107220(1980)描述的Scatchard分析来测定。在鉴定得到生成具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，所述克隆可通过有限稀释流程进行亚克隆，并使用标准方法进行培养(Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice，59-103(AcademicPress，1986))。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，所述杂交瘤细胞可在动物中例如通过将细胞腹腔内注射至小鼠中作为腹水瘤进行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化流程，诸如亲和层析法(例如采用蛋白A或蛋白G-Sepharose)或离子交换层析法、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析等，将所述亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。编码单克隆抗体的DNA易于通过常规流程分离并测序(例如使用能够特异性结合编码鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。以杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到宿主细胞中，诸如不另外产生抗体蛋白质的大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以便在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerraetal.，Curr.OpinioninImmunol.5256-262(1993)和Plückthun，Immunol.Revs.130151-188(1992)。在另一个实施方案中，可从使用McCaffertyetal.，Nature348552-554(1990)所述技术构建的噬菌体抗体文库中分离抗体或抗体片段。Clacksonetal.，Nature352624-628(1991)和Marksetal.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物描述了通过链改组(Marksetal.，Bio/Technology10779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouseetal.，Nuc.AcidsRes.212265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。由此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。还可以修饰编码抗体的DNA，例如通过用人重链和轻链恒定区(CH和CL)序列代替同源鼠序列(美国专利4,816,567；Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的整个或部分编码序列融合，制备嵌合或融合抗体多肽。非免疫球蛋白多肽可替代抗体的恒定区，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变区，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点以及对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。人源化抗体本领域已经描述了用于将非人抗体人源化的方法。优选的是，人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们通常取自“输入”可变区。人源化可基本上依照Winter及其同事的方法进行(Jonesetal.，Nature321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature332323-327(1988)；Verhoeyenetal.，Science2391534-1536(1988))，通过用高变区序列替代相应的人抗体序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中本质上少于整个人可变区用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是其中一些高变区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。当抗体用于人类治疗时，用于制备人源化抗体的人可变区的选择，包括轻链和重链，对于降低抗原性和HAMA反应(人抗小鼠抗体)非常重要。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体可变区序列对已知的人可变区序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人V区序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Simsetal.，J.Immunol.1512296(1993)；Chothiaetal.，J.Mol.Biol.196901(1987))。另一种方法使用由轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carteretal.，Proc.Natl.AcadSci.USA894285(1992)；Prestaetal.，J.Immunol.1512623(1993))。更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力以及其它有利的生物学特性。为了实现这一目的，依照优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，且为本领域熟练技术人员所熟悉。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得所需抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。通常，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。人源化抗体可以是抗体片段，诸如Fab，其任选地与一种或多种细胞毒剂偶联以便产生免疫偶联物。或者，人源化抗体可以是全长抗体，诸如全长IgG1抗体。人抗体和噬菌体展示技术作为人源化的替代方法，可生成人抗体。例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovitsetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902551(1993)；Jakobovitsetal.，Nature362255-258(1993)；Bruggermannetal.，YearinImmuno.733(1993)；及美国专利5,545,806、5,569,806、5,591,669(均为GenPharm)；5,545,807；以及WO97/17852。或者，噬菌体展示技术(McCafferrtyetal.，Nature348552-553)可用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因全集生成人抗体和抗体片段。根据这种技术，将抗体V区基因克隆到丝状噬菌体诸如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因的读码框中，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。由此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；有关综述参见例如Johnson，KevinS.以及Chiswell，DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。Clacksonetal.，Nature352624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。可基本上依照Marksetal.，J.Mol.Biol.222581-597(1991)或Griffithetal.，EMBOJ.12725-734(1993)所述技术，由未免疫人供体构建V基因全集，并分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利5,565,332和5,573,905。如上所述，还可通过体外激活B细胞(参见美国专利5,567,610和5,229,275)来生成人抗体。抗体片段在特定情况中，使用抗体片段而不是完整抗体是有益的。片段长度较小能使其被快速清除，并可更易于到达实体瘤。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimotoetal.，JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24107-117(1992)和Brennanetal.，Science22981(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv以及ScFv抗体片段均可在大肠杆菌中表达并分泌，由此使得大量这些片段易于制备。可从上文讨论的噬菌体抗体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段，并通过化学方法偶联形成F(ab′)2片段(Carteretal.，Bio/Technology10163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)2片段。美国专利5,869,046中描述了包含补救受体结合表位残基的具有增高的体内半衰期的Fab和F(ab′)2片段。用于生成抗体片段的其它技术对熟练从业人员是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO1993/16185；美国专利5,571,894；和美国专利5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点但缺少恒定区的唯一种类，因此，其适用于降低体内使用期间非特异性的结合。可以构建SFv融合蛋白以便生成位于sFv氨基端或羧基端的效应蛋白的融合体。参见AntibodyEngineering，ed.Borrebaeck，如上。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如美国专利5,641,870中描述的抗体。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。双特异性抗体双特异性抗体指对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。例示性的双特异性抗体可结合CD20蛋白的两种不同表位。其它此类抗体可将CD20结合位点与另一种蛋白的结合位点组合。或者，抗CD20臂可与结合白细胞上触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcγR)，诸如FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)，或NKG2D或其它NK细胞激活配体的臂组合，使得细胞防御机制聚焦并定位于表达CD20的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达CD20的细胞。这些抗体拥有CD20结合臂以及结合细胞毒剂(例如肥皂草毒蛋白(saporin)、抗干扰素-α、长春花生物碱、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab′)2双特异性抗体)。WO96/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRIII抗体而美国专利5,837,234描述了双特异性抗ErbB2/抗FcγRI抗体。WO98/02463显示了双特异性抗ErbB2/Fcα抗体。美国专利5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。用于制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生成基于两种免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millsteinetal.，Nature305537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦，且产物产量低。WO93/08829及Trauneckeretal.，EMBOJ.103655-3659(1991)中公开了类似的流程。根据一种不同的方法，将具有所需结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变区与免疫球蛋白恒定区序列融合。融合优选使用包含至少部分铰链、CH2和CH3区的Ig重链恒定区。优选的是，在至少一种融合物中具有包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物以及，如果需要，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的所需双特异性抗体的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比率表达导致高产量时或在该比率对所需链组合的产量没有明显的影响时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一个载体。在本方法的一个优选实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在一半双特异性分子中的存在提供了分离的便利途径，因此发现这种不对称结构便于将所需双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法公开于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的其它细节参见例如Sureshetal.，MethodsinEnzymology121210(1986)。根据美国专利5,731,168中描述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，将从重组细胞培养物中回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含至少部分CH3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用具有较大侧链的氨基酸(例如酪氨酸或色氨酸)取代。通过用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)取代大氨基酸侧链，在第二抗体分子的界面上产生针对大侧链的相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的抗体之一可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO91/00360、WO92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，并且连同许多交联技术一起公开于美国专利4,676,980。文献中还描述了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennanetal.，Science22981(1985)描述了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)2片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。近期的进展方便了从大肠杆菌中直接回收Fab′-SH片段，其可被化学偶联以便形成双特异性抗体。Shalabyetal.，J.Esp.Med.，175217-225(1992)描述了制备完整人源化双特异性抗体F(ab′)2分子。每一Fab′片段独立地从大肠杆菌中分泌并对其实施体外直接化学偶联从而形成双特异性抗体。由此形成的双特异性抗体能够与过表达ErbB2受体的细胞以及正常人类T细胞结合，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳腺肿瘤靶的裂解活性。还描述了从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelnyetal.，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原而形成单体，然后重新氧化而形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。由Hollingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448(1993)描述的“双抗体”技术提供了制备双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL区与另一个片段上的互补VL和VH区配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruberetal.，J.Immunol.1525368(1994)。设想了具有超过两价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tuttetal.，J.Immunol.14760(1991)。多价抗体多价抗体可通过细胞表达抗体所结合的抗原而比二价抗体更快地被内在化(和/或被分解代谢)。本发明的抗体可以是含有3个或多个抗原结合位点的多价抗体(除IgM类型之外的抗体)(例如四价抗体)，其易于通过重组表达编码抗体的多肽链的核酸而得以制备。多价抗体可包含二聚化区和3个或多个抗原结合位点。优选的二聚化区包含(或包括)Fc区或铰链区。在该情况下，抗体包含Fc区和位于Fc区氨基末端的3个或多个抗原结合位点。本文优选的多价抗体包含(或包括)3个至大约8个，优选4个，抗原结合位点。多价抗体包含至少一个多肽链(优选两个多肽链)，其中多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一个可变区，VD2是第二个可变区，Fc是Fc区的一个多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，n是0或1。例如，多肽链可包含VH-CH1-柔性连接子-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中多价抗体优选进一步包含至少2个(优选4个)轻链可变区多肽。例如，本文中多价抗体可包含大约2至大约8个轻链可变区多肽。本文设想的轻链可变区多肽包含轻链可变区和任选地，进一步包含CL区。载体，宿主细胞和重组方法宿主细胞的选择和转化用于克隆或表达本文所述重组mAbs，免疫粘附素和其它多肽拮抗剂的合适的宿主细胞是原核细胞、酵母或高等真核细胞。用于此目的的适合的原核细胞包括真细菌诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)诸如埃希菌属(例如大肠杆菌)、肠杆菌属、欧文菌属、克雷白菌属、变形菌杆属、沙门菌属(例如鼠伤寒沙门菌)、沙雷菌属(粘质沙雷菌)和志贺菌属等，以及芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(例如1989年4月12日出版的DD266710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属的铜绿菌假单胞菌，及链霉菌。优选大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31446)，虽然其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X177(ATCC31537)和大肠杆菌W3110(ATCC27325)也是适宜的。这些实例是用于举例说明而并非意在限制。全长抗体，抗体片段以及抗体融合蛋白可以在细菌中制备，尤其是无须糖基化和Fc效应子功能时，诸如治疗性抗体与自身即能有效地破坏肿瘤细胞的胞毒剂(例如毒素)和免疫结合剂相结合时。全长抗体在循环中的半衰期较长。在大肠杆菌中的制备更为快速且更为经济。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，例如参见美国专利5,648,237(Carter等)，美国专利5,789,199(JoIy等)，以及美国专利5,840,523(Simmons等)，其中描述了优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列，这些专利引入本文作为参考。表达后，抗体以可溶性级分从大肠杆菌细胞团中分离出来并可通过例如基于同种型的蛋白A或G柱进行纯化。最终纯化以类似于用于纯化例如在CHO细胞中表达的抗体的方法进行。除了原核生物，丝状真菌或酵母等真核微生物也是对抗体编码(诸如CD20抗体编码)载体适合的克隆或表达宿主。酿酒酵母，或常用的面包酵母，在低等真核宿主微生物中最为常用。然而，多种其它属、种和株也是可公开得到的并可用于本发明，例如粟酒裂殖酵母；克鲁维酵母属，例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16045)、威克曼氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24178)、K.waltii(ATCC56500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)等；yarrowia(EP402226)；巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)(EP183070)；念珠菌属(Candida)；Trichodermareesia(EP244234)；粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)；许旺氏酵母属(schwanniomyces)如西方许旺氏酵母(schwanniomycesoccidentalis)等；和丝状真菌，例如链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Tolypocladium以及曲霉属(Aspergillus)如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)等。用于表达糖基化CD20结合性抗体的适合宿主细胞来自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒株和变体以及相应的容许型昆虫宿主细胞，所述宿主诸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、Drosophilamelanogaster(果蝇)和家蚕蛾(Bombyxmori)等。用于转染的各种病毒株可以公开地获得，例如加利福尼亚Y级夜蛾(autographacalifornia)NPV的L-1变体和家蚕蛾NPV的Bm-5株，并且这些病毒可以在此用作为根据本发明的病毒，尤其是用于草地夜蛾细胞的转化。棉花、玉米、土豆、大豆、牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。然而，关注最多的是脊椎动物细胞，而且在培养(组织培养)中繁殖脊椎动物细胞已经成为常规方法。有效哺乳动物宿主细胞的实例是用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL1651)；人胚肾细胞系(293细胞或亚克隆培养成悬浮培养液的293细胞，Grahametal，J.GenVirol.3659(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCCCCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaubetal，Proc.Natl.Acad.ScLUSA774216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))；猴肾细胞(CV1ATCCCCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL2)；犬肾细胞(MDCKATCCCCL34)；布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442)；人肺细胞(W138，ATCCCCL75)；人肝细胞(HepG2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCCCCL51)；TRI细胞(Matheretal.AnnalsN.Y.Acad.Sci.38344-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞癌细胞系(HepG2)。宿主细胞用上述用于B细胞耗竭抗体诸如CD20结合性抗体或整联蛋白拮抗抗体制备的表达或克隆载体转化，并在改进型传统营养培养基上培养，所述培养基经改进已适于诱导启动子、筛选转化体或扩增编码所需序列的基因。培养宿主细胞用于产生本发明抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如Ham′sF10(Sigma)、最小基本培养基((MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco氏改良型Eagle氏培养基((DMEM)，Sigma)均适合于培养所述宿主细胞。另外，在Hametal.，Meth.Enz.5844(1979)；Barnesetal，Anal.Biochem.102255(1980)；美国专利4767704、4657866、4927762、4560655或5122469；WO90/03430；WO87/00195；或美国专利Re.30985中所述任何培养基可作为所述宿主细胞的培养基。任何所述培养基可在需要时补充激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠，钙，镁，和磷酸)、缓冲液(例如HEPES)，核苷酸(例如腺苷和胸苷嘧啶)、抗生素(例如遗传霉素(GENTAMYCINTM))、痕量元素(定义为通常以微摩尔级终浓度出现的无机化合物)、葡萄糖或等价能源。还包括任何其它必须补充物，其相应浓度为本领域已知。培养条件如温度、pH等是现有技术中应用于表达型宿主细胞的那些，这对本领域技术人员来说是显而易见的。抗体的纯化当应用重组技术时，所述抗体可以在细胞内周质空间产生，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在细胞内产生，第一步例如通过离心或超滤除去颗粒状碎片，即宿主细胞或其裂解片段。Carteretal，Bio/Technology10163-167(1992)中叙述了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间中的抗体的方法。简言之，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)存在的条件下融解细胞团超过30分钟。通过离心可以将细胞碎片除去。在所述抗体分泌到培养基中时，通常首先用市售的蛋白浓缩滤膜(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单位)浓缩此类表达系统的上清。在任何上述步骤中可以包括抑制蛋白裂解的PMSF等蛋白酶抑制剂，并且可以包括抑制外来污染物生长的抗生素。从所述细胞中制备的抗体组合物可利用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析等方法纯化，优选亲和层析作为纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于该抗体上任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmarketal，J.Immunol.Meth.621-13(1983))。建议蛋白G用于所有的小鼠同种型和人γ3(Gussetal，EMBOJ.51567-1575(1986))。与亲和配体结合的基质最常用琼脂糖，但也可利用其它基质。具有机械稳定性的基质如控制孔径的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯等，比琼脂糖允许更快的流速且耗时更短。在所述抗体包括CH3结构域的情况中，BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker，PhilliPBSurg，NJ)可用于纯化。根据待回收的抗体，还可以应用其它蛋白纯化技术，例如在离子交换柱上的分级分离、乙醇沉淀、反向HPLC、硅层析、在阳离子或阴离子交换树脂层析(例如聚天冬氨酸柱)上进行的肝素SEPHAROSETM层析、聚焦层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在任何最初纯化步骤之后，利用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，可以对包括所述兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，优选在低盐浓度条件下进行(例如大约0-0.25M盐浓度)。抗体偶联物抗体可与胞毒剂诸如毒素或放射性同位素结合。在特定实施方案中，毒素优选是刺孢霉素(calicheamicin)，美登醇(maytansinoid)，多拉司他汀(dolastatin)，auristatinE及其类似物或衍生物。抗体组合物的治疗用途本发明的CD20结合性抗体可用于治疗大量恶性和非恶性疾病，包括自身免疫性疾病以及相关病症，和特征在于B细胞表达CD20的B细胞瘤或恶性病变，包括B细胞淋巴瘤和白血病。骨髓中的干细胞(B细胞前体细胞)缺失CD20抗原，这就使得治疗后健康B细胞再生并在数月内恢复到正常水平。“自身免疫性疾病”在本文中指由个体自身组织引起的并针对个体自身组织的疾病或病症或其共分离(co-segregate)或表现或由其产生的疾患。自身免疫性疾病或病症的实例包括(但不限于)关节炎(类风湿性关节炎，青少年型类风湿性关节炎，骨性关节炎，银屑病关节炎，以及强直性脊柱炎)，银屑病，皮炎(包括特应性皮炎)；慢性特发性荨麻疹(包括慢性自身免疫性荨麻疹)，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，系统性硬皮病和系统性硬化症，炎性肠病相关的反应(IBD)(克罗恩氏病(Crohn′sdisease)、溃疡性结肠炎)，和具有坏疽性脓皮症共分离的IBD，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，和/或巩膜外层炎)，呼吸窘迫综合征，包括成人型或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，IgE介导的疾病诸如过敏性和变应性鼻炎，脑炎诸如拉斯默森氏(Rasmussen’s)脑炎，葡萄膜炎，结肠炎诸如微观结肠炎(microscopiccolitis)和胶原性结肠炎，肾小球肾炎(GN)诸如膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)，包括I型和II型，以及快速发展的GN，变应性反应，湿疹，哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的病症，动脉粥样硬化，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮(SLE)，诸如表皮SLE，狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、儿科狼疮、非肾狼疮、盘状狼疮、脱发狼疮)，青少年型糖尿病，多发性硬化(MS)诸如脊髓-眼MS(spino-opticalMS)，变应性脑脊髓炎，与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和延迟性超敏反应相关的免疫应答，结核病，结节病，肉芽肿病包括韦格纳氏肉芽肿病，粒细胞缺乏，血管炎病(包括大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)，CNS血管炎，以及ANCA相关血管炎，诸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或综合征(CSS)，再生障碍性贫血，库姆斯阳性贫血，戴-布二氏(DiamondBlackfan)贫血，免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血(perniciousanemia)、单纯红细胞性贫血或再生障碍(PRCA)，因子VIII缺乏，血友病A、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，白细胞渗出有关的疾病，CNS炎性病症，多器官损伤综合征，重症肌无力，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，贝切特氏(Bechet)病，卡斯尔曼氏(Castleman’s)综合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture’s)综合征，兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力综合征症，雷诺氏(Reynaud′s)综合征，斯耶格伦氏(Sjorgen′s)综合征，史-约二氏(Stevens-Johnson)综合征，实体器官移植排斥反应(包括用于高反应性群体抗体滴度的预处理，组织中的IgA沉积，以及由于肾移植，肝移植，肠移植，心脏移植等产生的排斥反应)，移植物抗宿主病(GVHD)，大疱性类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、粘膜类天疱疮型天疱疮(pemphigusmucus-membranepemphigoid))，自身免疫性多内分泌腺病，莱特氏(Reiter′s)病或综合征，僵人综合征，免疫复合物肾炎，IgM多发性神经病或IgM介导的神经病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，血小板减少症(例如心肌梗死患者发生的)，包括自身免疫性血小板减少症，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症；自身免疫性内分泌病包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、阿狄森氏(Addison’s)病，格雷夫斯氏(Grave′s)病，自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，包括儿科IDDM，和席汉氏(Sheehan’s)综合征，自身免疫性肝炎，淋巴性间质性肺炎(HIV)，梗阻性细支气管炎(非移植)对NSIP，格-巴二氏(Guillain-Barré)综合征，贝格尔氏(Berger’s)病(IgA肾病)，原发性胆汁性肝硬变，口炎性腹泻(麸质肠病)，与疱疹样皮炎共分离的难治性炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩侧索硬化(ALS；卢格里克氏(LouGehrig′s)病)，冠状动脉疾病，自身免疫性内耳病(AIED)，自身免疫性听觉缺失，视性眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，多软骨炎诸如难治性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，淀粉样变，巨细胞性肝炎，巩膜炎，性质未确定的/未知意义的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)，周围神经病，瘤外综合征，通道病诸如癫痫、偏头痛、心率失常、肌肉病症、耳聋、盲、周期性瘫痪，和CNS的通道病，孤独症，炎性肌病，以及局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)。特征在于B细胞表达CD20的B细胞瘤或恶性疾病指包括在细胞表面表达CD20的细胞异常增生的疾病。含有CD20+B细胞的B细胞瘤包括CD20阳性何杰金氏(Hodgkin’s)病，包括淋巴细胞为主型何杰金氏病(LPHD)；非何杰金氏(non-Hodgkin’s)淋巴瘤(NHL)；滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；毛细胞性白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低级/滤泡非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，中级/滤泡NHL，中级弥漫性NHL，高级成免疫细胞NHL，高级成淋巴细胞NHL，高级小非分裂细胞NHL，贮积病(bulkydisease)NHL，浆细胞样淋巴细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，AIDS相关性淋巴瘤和特发性巨球蛋白血症。还涉及治疗这些疾病复发的方法。LPHD是一类何杰金氏病，其尽管实施放疗或化疗但仍趋向频繁复发而且特征在于CD20阳性恶性细胞。CLL是四种主要白血病类型之一。CLL是称为淋巴细胞的成熟B细胞的癌症，CLL的症状在于血液、骨髓和淋巴组织中细胞的进行性累积。缓慢进展淋巴瘤是缓慢生长的、无法治疗的疾病，其中在多次缓解和复发之后，平均患者生存率为6-10年。如本文所使用的术语“非何杰金氏淋巴瘤”或“NHL”是指除何杰金氏淋巴瘤之外的淋巴系统的癌症。根据何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)细胞而非何杰金氏淋巴瘤中没有所述细胞通常可将何杰金氏淋巴瘤与非何杰金氏淋巴瘤区分开来。如本文所使用的术语所涵概的非何杰金氏淋巴瘤的实例包括本领域技术人员(例如肿瘤学家或病理学家)根据本领域已知的分类方案能够鉴定的任何淋巴瘤，所述分类方案诸如修订的欧洲美国淋巴瘤(REAL)方案，如ColorAtlasofClinicalHematology(3rdedition)，A.VictorHofibrandandJohnE.Pettit(eds.)(HarcourtPublishersLtd.，2000)中所述。尤其参见图11.57、11.58和11.59中的列表。更具体的实例包括(但不限于)复发或难治的NHL，前线低级NHL(frontlinelowgradeNHL)，III/IV阶段NHL，化疗耐受性NHL，前体B成淋巴细胞性白血病(precursorBlymphoblasticleukemia)和/或淋巴瘤，小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或幼淋巴细胞性白血病和/或小淋巴细胞性淋巴瘤，B细胞幼淋巴细胞性淋巴瘤，免疫细胞瘤和/或淋巴浆细胞性淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区淋巴瘤，结节外边缘区MALT淋巴瘤，结节边缘区淋巴瘤，毛细胞性白血病，浆细胞瘤和/或浆细胞性骨髓瘤，低级/滤泡淋巴瘤，中级/滤泡NHL，套细胞淋巴瘤，滤泡中心淋巴瘤(滤泡性)，中级弥漫性NHL，弥漫性大B细胞淋巴瘤，攻击性(aggressive)NHL(包括攻击性前线NHL(aggressivefront-lineNHL)和攻击性复发NHL)，自体干细胞移植后复发或难治的NHL，原发纵隔大B细胞淋巴瘤，原发弥漫性淋巴瘤，高级成免疫细胞NHL，高级成淋巴细胞NHL，高级小无裂细胞(highgradesmallnon-cleavedcell)NHL，贮积病(bulkydisease)NHL，伯基特(Burkitt’s)淋巴瘤，前体(外周)T细胞成淋巴细胞性白血病和/或淋巴瘤，成人T细胞淋巴瘤和/或白血病，T细胞慢性淋巴细胞性白血病和/或幼淋巴细胞白血病，大颗粒状淋巴细胞性白血病，蕈样肉芽肿病和/或塞扎里综合征(Sezarysyndrome)，结节外天然杀伤细胞/T细胞(鼻型)淋巴瘤，肠病型T细胞淋巴瘤，肝脾T细胞淋巴瘤，皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤，皮肤(表皮)淋巴瘤，间变性大细胞淋巴瘤，血管中心性淋巴瘤，肠型T细胞淋巴瘤，外周T细胞(未有特殊说明)淋巴瘤和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(angioimmunoblasticT-celllymphoma)。在特定实施方案中，本发明的治疗具有CD20+B细胞的B细胞癌症的方法用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，淋巴细胞为主型何杰金氏病(lymphocytepredominantHodgkin’sdisease)(LPHD)，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在特定实施方案中，治疗自身免疫性疾病的方法或耗竭B细胞的方法用于治疗类风湿性关节炎和青少年型类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)，包括狼疮肾炎，韦格纳(Wegener’s)病，炎性肠病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，自身免疫性血小板减少症，多发性硬化症，银屑病，IgA肾病，IgM多发性神经病，重症肌无力，血管炎，糖尿病，雷诺氏(Reynaud’s)综合征，斯耶格伦氏(Sjorgen’s)综合征和肾小球肾炎期望B细胞耗竭的水平取决于疾病。对于治疗CD20阳性癌症，需要将作为本发明的抗CD20抗体的靶的B细胞的耗竭最大化。因此，对于治疗CD20阳性B细胞瘤，需要B细胞耗竭足以至少抑制疾病的进展，所述进展可由本领域技术人员通过例如监测肿瘤生长(大小)，癌细胞类型的增殖，转移，特定癌症的其它体征和症状进行评估。优选地，B细胞耗竭足以将疾病的进展抑制至少2个月，更优选3个月，甚至更优选4个月，更优选5个月，甚至更优选6个或更多个月。在更优选的实施方案中，B细胞耗竭足以将缓解时间增加至少6个月，更优选9个月，更优选1年，更优选2年，更优选3年，更优选5年或更多年。在最优选的实施方案中，B细胞耗竭足以治愈疾病。在优选的实施方案中，癌症患者中的B细胞耗竭至少是治疗之前基线水平的大约75％，更优选地，80％、85％、90％、95％、99％，甚至100％。对于治疗自身免疫性疾病，需要根据个体患者中疾病和/或症状的严重程度，通过调整CD20结合性抗体的剂量来调整B细胞耗竭的程度。因此，B细胞耗竭可以但非必须是完全的。或者，在起始治疗中需要全部B细胞耗竭，而在随后的治疗中，可调整剂量以便仅实现部分耗竭。在一个实施方案中，B细胞耗竭至少20％，即，与治疗前的基线水平相比，CD20阳性B细胞保留80％或更低。在一个实施方案中，B细胞耗竭25％、30％、40％、50％、60％、70％或更高。优选地，B细胞耗竭足以使疾病的进展停止，更优选地缓解所治疗的特定疾病的症状和体征，更优选地治愈疾病。在适宜的疾病中评估对肿瘤的治疗有效性或成功的参数是本领域技术人员已知的。一般而言，本领域技术人员应当寻求具体疾病的体征和症状的减弱。参数包括疾病进展的中值时间(mediantime)，缓解和稳定疾病的时间。下述参考文件描述了淋巴瘤和CLL，它们的诊断、治疗和检测治疗有效性的标准医学方法。CanellosGP，Lister，TA，SklarJLTheLymphomas.W.B.SaundersCompany，Philadelphia，1998；Hematology，BasicPrinciplesandPractice，3rded.Hoffman等(编者)，ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000中，vanBesienK和Cabanillas，FClinicalManifestations，StagingandTreatmentofNon-Hodgkin′sLymphoma，Chap.70，pp1293-1338；以及Hematology，BasicPrinciplesandPractice，3rded.Hoffman等(编者)，ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000中，Rai，K和Patel，DChronicLymphocyticLeukemia，Chap.72，pp1350-1362。在适宜的疾病中评估自身免疫或自身免疫相关疾病的治疗有效性或成功的参数是本领域技术人员已知的。一般而言，本领域技术人员应当寻求具体疾病的体征和症状的减弱。下面举例说明。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗类风湿性关节炎。RA特征在于多关节炎症，软骨丧失和骨质侵蚀，这导致关节破坏并最终降低关节功能。此外，由于RA是全身性疾病，其可对其它组织诸如肺、眼和骨髓产生作用。CD20结合性抗体可用作含有早期RA的患者(即未接触氨甲喋呤(MTX)(MTX))的一线疗法，或联合例如MTX或环磷酰胺。或者，抗体可作为二线疗法联合例如MTX而用于治疗DMARD和/或MTX耐药的患者。CD20结合性抗体还可联合B细胞动员剂诸如能驱动B细胞进入血流以便更有效进行杀伤的整联蛋白抗体进行施用。CD20结合性抗体可用于防止或控制关节损伤、延迟结构损伤，降低RA中炎症相关的疼痛，并全面减少(减弱)中度或重度RA的体征和症状。可以在治疗RA中使用的其它药物治疗之前、之后或同时采用CD20抗体治疗RA患者(参见下述联合治疗)。在一个实施方案中，对先前使用缓解疾病的抗风湿药物失败的和/或对单独氨甲喋呤不能产生足够反应的患者施用CD20结合性抗体。在另一实施方案中，对患者施用人源化CD20结合性抗体加上环磷酰胺或CD20结合性抗体加上氨甲喋呤。一种评估RA中治疗有效性的方法基于美国风湿病学院(ACR)标准，除了其它问题之外，其检测了在触痛和肿胀关节中的改善百分比。例如以ACR20(20％改善)对RA患者进行与无抗体治疗(例如治疗前的基线)或用安慰剂治疗相比的评分。评估抗体治疗有效性的其它方法包括X射线评分诸如用于评分结构损伤诸如骨侵蚀和关节腔狭窄的SharpX射线评分。还可对患者进行防止失能性或改善失能性的评估，所述评估基于健康评定问卷[HAQ]评分，AIMS评分，治疗期间或之后时间期间的SF-36。ACR20标准可包括在触痛(疼痛)关节计数和肿胀关节计数中均20％的改善加上在如下5种其它检测中至少3种的20％改善1.通过直观类比标度((visualanalogscale，VAS)，患者的疼痛评估，2.患者的疾病活动性(VAS)的整体评估，3.医师的疾病活动性(VAS)的整体评估，4.通过健康评定问卷检测，患者自我评估失能性，和5.急性期反应物，CRP或ESR。ACR50和70的定义是类似的。优选地，对患者施用一定量的本发明的CD20结合性抗体，所述抗体的量足以实现至少ACR20，优选至少ACR30，更优选至少ACR50，甚至更优选至少ACR70，最优选至少ACR75以及更高的评分。银屑病关节炎具有独特的和明确的放射显影特征。对于银屑病性关节炎，可以通过Sharp评分等评估关节侵蚀和关节腔狭窄。本文所述的人源化CD20结合性抗体可用于防止关节损伤以及减少疾病体征和病症症状。本发明另一方面是通过对患有SLE的患者施用治疗有效量的本发明的人源化CD20结合性抗体从而治疗狼疮或SLE的方法。SLEDAI评分提供了疾病活动性的数值定量。SLEDAI是已知与疾病活动性相关的24个临床和实验室参数的加权指数，数值范围为0-103。参见BryanGescuk&JohnDavis，″Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus″，CurrentOpinioninRheumatology2002，14515-521。针对双链DNA的抗体确信能够导致肾耀斑(renalflare)和其它狼疮表现。对于实施抗体治疗的患者可以监测肾耀斑的时间，所述肾耀斑的定义为血清肌酸酐、尿蛋白质或尿血的显著性、可重现性增加。或者，或此外，可监测患者的抗核抗体和针对双链DNA的抗体的水平。SLE的治疗包括高剂量皮质激素和/或环磷酰胺(HDCC)。脊椎关节病是一组关节病症，包括强直性脊柱炎、银屑病性关节炎和克隆氏病(Crohn’sdisease)。通过验证的患者和医师整体评估检测方法可测定治疗的成功。可以采用多种药物治疗银屑病；治疗的差异与疾病严重性直接相关。患较轻类型银屑病的或者通常采用局部治疗，诸如局部类固醇、地蒽酚(anthralin)、卡泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索(clobetasol)和他佐罗汀(tazarotene)，从而治疗疾病，而患中度和重度银屑病的患者更有可能采用全身性(氨甲喋呤、类视黄醇、环孢霉素A、PUVA和UVB)治疗。还可以使用Tars。这些治疗方法是治疗的安全性顾虑、耗时方案或不便步骤的组合。而且，某些治疗需要昂贵的设备和诊所设定中的专用空间。全身性药物会产生严重的副作用，包括高血压、高脂血症、骨髓抑制、肝病、肾病和胃肠不适。而且，使用光疗会增加皮肤癌的发生率。除了使用局部治疗相关的不便和不适之外，光疗和全身性治疗需要患者开始和终止治疗循环以及由于其副作用而要终生监测这些治疗。对于银屑病的治疗有效性可以通过监测，与基线状态相比，所述疾病临床体征和症状中的改变进行评估，包括医师整体评估(PGA)改变和银屑病面积和严重性指数(PASI)评分，银屑病症状评估(PSA)。在治疗全过程中，可以对患者定期地检测用于显示特定时间点出现的搔痒程度的直观类比标度。含有本发明的Fc突变的抗HER2抗体可用于治疗HER2表达或过表达的癌症。“表达HER2的癌症”指包含在其细胞表面存在HER2蛋白的细胞的癌症。“过表达”HER受体的癌症指与相同组织类型的非癌细胞相比，在其细胞表面产生显著较高水平的HER受体，诸如HER2的癌症。所述过表达可以是由基因扩增或通过增强的转录或翻译而导致的。HER受体过表达可在诊断性或预后性测定法中通过评估细胞表面上存在的HER蛋白水平的增加而得以测定(例如通过免疫组织化学测定法；IHC)。或者，或除此之外，可以通过例如荧光原位杂交(FISH；参见WO98/45479)、southern印迹、或聚合酶链式反应(PCR)技术如实时定量PCR(RT-PCR)测定细胞中HER编码核酸的水平。HER受体过表达还可通过检测生物学液体诸如血清中的脱落抗原(例如HER胞外域)而得以研究(例如参见1990年6月12日公布的美国专利4,933,294；1991年4月18日公开的WO91/05264；1995年3月28日公布的美国专利5,401,638；和Siasetal.J.Immunol.Methods13273-80(1990))。除了上述测试以外，熟练技术人员还可以采用多种其它体内测试。例如，可以将患者体内的细胞与抗体接触，所述抗体任选用可检测的标记，例如，放射性同位素标记过，可以评估抗体与患者细胞的结合，例如，通过放射性外部扫描，或者通过分析活组织样品，该活组织样品取自之前接触过所述抗体的患者。下面列出了可用Her-2抗体组合物治疗的多种癌症。术语“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物的生理状况，其以不受调节的细胞生长为典型特征。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤，和胰岛细胞瘤)、间皮瘤、神经鞘瘤(Schwannoma)(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤，和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌包括肠道癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(livercancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepaticcarcinoma)、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食管癌、胆管癌，以及头颈部癌。还设想了HER2抗体可用于治疗多种非恶性疾病或病症，诸如自身免疫性疾病(例如银屑病)；子宫内膜异位症；硬皮病；再狭窄；息肉诸如结肠息肉、鼻息肉或胃肠息肉；纤维腺瘤；呼吸系统疾病；胆囊炎；神经纤维瘤病；多囊性肾病；炎性疾病；皮肤病症包括银屑病和皮炎；血管疾病；涉及血管上皮细胞异常增生的病症；胃十二指肠溃疡；门内特里埃氏(Menetrier’s)病，分泌型腺瘤或蛋白质丧失综合征；肾脏病症；血管生成性病症；眼的病症诸如与年龄相关的黄斑变性、眼假组织胞浆菌病综合征(presumedocularhistoplasmosissyndrome)、增殖型糖尿病视网膜病导致的视网膜新生血管形成、视网膜血管化、糖尿病性视网膜病、或者与年龄相关的黄斑变性；骨相关病诸如骨性关节炎，佝偻病和骨质疏松症；脑局部缺血事件后的损伤；纤维变性疾病或缺血性(edemia)疾病诸如肝硬化、肺纤维化、肉样瘤病(carcoidosis)、甲状腺炎、系统性高粘滞综合征，OsierWeber-Rendu病，慢性闭合性肺部疾病，或烧伤、创伤、辐射、中风、缺氧或缺血后的水肿；皮肤的超敏反应；糖尿病性视网膜病和糖尿病性肾病；格-巴二氏综合征；移植物抗宿主病或移植排斥；佩吉特(Paget’s)病；骨或关节炎症；光老化(例如由于人类皮肤的紫外线辐射导致的)；良性前列腺肥大；确定的微生物包括微生物病原体的感染，所述微生物病原体选自腺病毒、汉坦病毒、博氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、耶尔森菌各种(Yersiniaspp.)和百日咳杆菌；由血小板聚集导致的血栓；生殖性病症诸如子宫内膜异位症、卵巢过度刺激综合征、先兆子痫、功能障碍性子宫出血，或者月经频多；滑膜炎；粥样斑；急性和慢性肾病(包括增生性肾小球肾炎和糖尿病诱导的肾病)；湿疹；肥厚性瘢痕形成；内毒素性休克和真菌感染；家族性腺瘤息肉病；神经变性性疾病(例如阿耳茨海默氏病、AIDS相关性痴呆、帕金森氏病、肌萎缩侧索硬化、视网膜色素变性、脊髓性肌萎缩和小脑变性)；骨髓增生异常综合征；再生障碍性贫血；局部缺血性损伤；肺、肾或肝纤维化；T细胞介导的超敏性疾病；婴儿肥厚性幽门狭窄；尿梗阻综合征；银屑病关节炎和桥本(Hasimoto’s)甲状腺炎。本文的治疗优选的非恶性适应症包括银屑病，子宫内膜异位症，硬皮病，血管疾病(例如再狭窄、动脉粥样硬化、冠状动脉疾病或高血压)，结肠息肉，纤维腺瘤或呼吸系统疾病(例如哮喘、慢性支气管炎、支气管扩张或囊性纤维化病)。本发明的抗血管生成和抗VEGF抗体可用于治疗血管生成相关病症，所述疾病包括下述肿瘤性和非肿瘤性病症。肿瘤性病症包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤，和白血病或或淋巴恶性肿瘤。所述癌更具体的实例包括肾癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、肺癌包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞癌，鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞瘤、胃癌包括肠胃癌、胰腺癌、头颈部癌、成胶质细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤(thecomas)、arrhenoblastomas、肝癌、血液恶性肿瘤包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，多发性骨髓瘤和急性血液恶性肿瘤、子宫内膜或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、黑色素瘤、皮肤癌、神经鞘瘤、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲状腺癌、Wilm肿瘤，以及与斑痣性错构瘤病相关的异常血管增生，水肿(诸如与脑肿瘤伴随的水肿)，和梅格斯氏(Meigs’)综合征。更具体地，适宜采用本发明的拮抗剂治疗的癌症包括肾癌、乳腺癌、结直肠癌、小细胞肺癌、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、前列腺癌、肝癌、头颈部癌、黑色素瘤、卵巢癌、间皮瘤，和多发性骨髓瘤。适于用抗血管生成抗体(包括抗VEGF抗体)治疗的非肿瘤性病症包括，但不限于例如不希望有的或异常肥大，关节炎，类风湿性关节炎(RA)，银屑病，银屑病斑块，结节病，动脉粥样硬化，粥样硬化斑块，心肌梗死导致的水肿，糖尿病性和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病，晶状体后纤维组织增生症，新生血管性青光眼，与年龄相关的黄斑退行性改变，糖尿病性黄斑水肿，角膜新生血管形成，角膜移植新血管形成，角膜移植排斥，视网膜/脉络膜新血管形成，角心血管形成(潮红)，眼新血管疾病，血管再狭窄，动静脉畸形(AVM)，脑膜瘤，血管瘤，血管纤维瘤，甲状腺增生(包括Grave’s病)，角膜和其它组织移植，慢性炎症，肺炎症，急性肺损伤/ARDS，脓毒症，原发性肺动脉高压，恶性肺渗出，脑水肿(例如与急性中风/闭合性头部损伤/创伤相关的)，滑液炎，RA中血管翳形成，骨化性肌炎，增生性骨形成，骨性关节炎(OA)，顽固性腹水，多囊性卵巢疾病，子宫内膜异位症，第三间隙液体病(3rdspacingoffluiddiseas)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)，子宫纤维瘤，早产，慢性炎症诸如IBD(克隆氏病和溃疡性结炎性肠病)，肾同种异体移植物排斥，炎性肠病，肾病综合征，不希望有的或异常组织块生长(非癌)，血友病性关节，过度增生性瘢痕，毛发生长抑制，Osier-Weber综合征，脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生症，硬皮病，沙眼，血管粘连，滑膜炎，皮炎，先兆子痫，腹水，心包积液(诸如心包炎伴随的积液)和胸腔积液。具有本发明的Fc氨基酸改变的抗CD11a抗体可用于治疗LFA-1介导的病症。术语“LFA-I-介导的病症”是指由涉及LFA-1受体或淋巴细胞的细胞粘附相互作用导致的病理状态。所述病症的实例包括T细胞炎性反应诸如炎性皮肤疾病包括银屑病；与炎性肠病(诸如克隆氏病和溃疡性结炎性肠病)相关的反应；成人呼吸窘迫综合征；皮炎；脑膜炎；脑炎；色素层炎；变应性病症诸如湿疹和哮喘以及涉及T细胞浸润和慢性炎性反应的其它病症；皮肤超敏反应(包括常春藤(poisonivy)和槲叶毒葛(poisonoak))；动脉粥样硬化；白细胞粘附缺陷；自身免疫性疾病诸如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、糖尿病、多发性硬化、雷诺氏综合征，自身免疫性甲状腺炎，实验性自身免疫性脑脊髓炎、斯耶格伦氏综合征，青少年型糖尿病，和通常见于结核病中由细胞因子和T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应相关的免疫反应、结节病、多肌炎、肉芽肿病和血管炎；恶性贫血；涉及白血病渗出的疾病；CNS炎性疾病，继发于败血症或创伤的多器官损伤综合征；自身免疫性溶血性贫血；重症肌无力；抗原抗体复合物介导的疾病；所有类型的移植排斥，包括移植物抗宿主或宿主抗移植物疾病。具有能够增强与FcRn的结合并增强血清半衰期的本发明的Fc氨基酸改变的抗IgE抗体可用于治疗IgE介导的病症。IgE介导的病症包括变应性病症，其特征在于对多种一般天然存在的吸入性和摄入性抗原产生免疫反应并持续产生IgE抗体的遗传倾向。具体的特应性病症包括变应性哮喘、变应性鼻炎、特应性皮炎和变应性胃肠病。遗传变应性患者通常具有多种变态反应，这意味着他们具有针对多种环境变应原(包括季节性、多年生性和职业变应原)的IgE抗体和来自其的症状。季节性变应原的实例包括花粉(例如草、树、黑麦、梯牧草、豕草)，多年生性变应原的实例包括真菌(例如霉菌、霉菌孢子)、羽毛、动物和昆虫(例如尘螨)碎片。职业性变应原的实例包括去污剂、金属和异氰酸盐。可以导致IgE介导的反应的非抗原特异性刺激包括感染、刺激物诸如烟、燃烧烟雾、柴油机废气颗粒和二氧化硫、运动应激、冷应激和情绪应激。超敏反应可以是由于暴露于食品中的蛋白质、毒液、疫苗、激素、抗血清、酶、和乳胶、抗生素、肌松药、维生素、细胞毒素、阿片制剂和多糖，诸如糊精、右旋糖酐铁和聚明胶肽引起的超敏反应。但是与IgE水平升高相关的病症并不局限于这些具有遗传性(特应性)病因学的病症。其它与IgE水平升高相关的病症(表现为IgE介导的并可采用本发明的药物制剂治疗的病症包括超敏反应(例如，变应性超敏反应)、湿疹、荨麻疹、变应性支气管肺曲霉菌病、寄生虫病、超IgE综合征、运动失调性毛细血管扩张症、威斯科特-奥尔德里奇(Wiskott-Aldrich)综合征、丘-施二氏(Churg-Strauss)综合征、系统性血管炎、胸腺淋巴发育不全、IgE骨髓瘤、移植物抗宿主反应、炎性肠病(例如克隆氏病(Crohn′sdisease)、溃疡性结炎性肠病、原因不明的结炎性肠病(indeterminatecolitis)和感染性结炎性肠病)，胃肠病，小炎性肠病，粘膜炎(例如口粘膜炎、胃肠道粘膜炎、鼻粘膜炎和直炎性肠病)，坏死性小肠结炎性肠病和食管炎。剂量根据所要治疗的适应症和本领域技术人员熟知的与剂量相关因素，本发明的拮抗剂和抗体以有效治疗所述适应症同时毒性和副作用最小化的剂量进行施用。对于治疗CD20阳性癌症或自身免疫性疾病，治疗上有效剂量的范围是大约250mg/m2-大约400mg/m2或500mg/m2，优选大约250-375mg/m2。在一个实施方案中，剂量范围是275-375mg/m2。在治疗CD20阳性B细胞瘤的一个实施方案中，抗体的施用剂量是300-375mg/m2。对于治疗患有B细胞淋巴瘤诸如非何杰金氏淋巴瘤的患者，在特定实施方案中，本发明的抗CD20抗体和人源化抗CD20抗体以10mg/kg或375mg/m2的剂量施用于人类患者。在一个实施方案中，利妥昔单抗的施用剂量范围是7-15mg/kg。对于治疗NHL，一种剂量方案是在治疗第一周施用一剂抗体组合物，剂量为10mg/kg，随后间隔2周，然后施用第二剂相同量的抗体。一般而言，NHL患者在一年中接受一次所述治疗，但淋巴瘤复发时，可以重复进行所述治疗。在另一剂量方案中，低等NHL患者接受四周的人源化2H7型式，优选v16(375mg/m2每周)，然后第五周实施三个额外疗程的抗体加标准CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)或CVP(环磷酰胺、长春新碱、强的松)化疗，其每三周给予持续三个周期。在一个实施方案中，对于治疗类风湿性关节炎，人源化抗体的剂量范围是125mg/m2(等价于大约200mg/剂)-600mg/m2，如果是分两剂给药，例如第一个200mg剂量在第一日施用，随后第二个200mg剂量在第15日施用。在不同的实施方案中，剂量是250mg/剂，275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg。在治疗疾病时，本发明的靶向B细胞的抗体诸如CD20结合性抗体可长期地或间歇地施用于患者，如本领域技术人员对于所述疾病所能确定的。通过静脉输注或皮下施用药物的患者可能会产生副作用，诸如发热、寒战、灼痛感、无力和头痛。为了减轻或最小化所述副作用，可在治疗剂量之前，对患者施用抗体初始调整剂量。所述调整剂量低于治疗剂量从而调整患者使之耐受更高的剂量。施药途径用于本发明的方法的抗体可根据医师已知的方法而施用于人类患者，诸如通过静脉内施用，例如快速推注或通过在一段时间内的连续输注，通过皮下、肌肉内、动脉内、腹膜内、肺内、脑脊髓内、关节内、滑膜内、鞘内、伤口内或吸入途径(例如鼻内)，通常通过静脉内或皮下施用在一个实施方案中，采用0.9％氯化钠溶液作为输注载体提供静脉输注施用人源化2H7抗体。联合治疗在上述B细胞瘤的治疗中，可采用本发明的CD20结合性抗体联合一种或多种治疗剂诸如化疗剂以多药给药方案治疗患者。CD20结合性抗体可以与化疗剂同时、顺序或交替施用，或者在其它治疗无反应之后施用。淋巴瘤治疗的标准化疗包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑和米托蒽醌加美法仑。CHOP是一种最常见的用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的化疗方案。CHOP方案中使用下述药物环磷酰胺(商品名Cytoxan，neosar)；阿霉素(多柔比星/羟基多柔比星)；长春新碱(Oncovin)；和强的松龙(有时称为Deltasone或Orasone)。在特定实施方案中，CD20结合性抗体联合一种或多种下述化疗剂施用于有此需要的患者阿霉素、环磷酰胺、长春新碱和强的松龙。在特定实施方案中，患有淋巴瘤(诸如非何杰金氏淋巴瘤)的患者采用本发明的抗CD20抗体联合CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松)治疗进行治疗。在另一实施方案中，癌症患者采用本发明的人源化CD20结合性抗体联合CVP(环磷酰胺、长春新碱和强的松)化疗进行治疗。在特定实施方案中，采用上述人源化2H7.v16或其变体联合CVP治疗患有CD20阳性NHL的患者。在治疗CLL的特定实施方案中，CD20结合性抗体与采用氟达拉滨(fludarabine)和Cytoxan之一或两者的化疗联合施用。在上述自身免疫性疾病或自身免疫相关性病症的治疗中，可对患者施用B细胞耗竭剂诸如本发明的CD20结合性抗体在诸如多剂量给药方案中联合第二治疗剂，诸如免疫抑制剂。B细胞耗竭剂可以与免疫抑制剂同时、顺序或交替施用或者用其它治疗无反应时施用。免疫抑制剂可以采用与本领域中相同或较低的剂量进行施用。优选的附加免疫抑制剂取决于多种因素，包括所要治疗的疾病的类型以及患者的病史。在本文中使用的用作附加剂的术语“免疫抑制剂”是指作用在于抑制或掩蔽患者免疫系统的物质。所述药剂可包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。此类试剂的实例包括类固醇诸如糖皮质激素、例如强尼松(prednisone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077)；硫唑嘌呤(azathioprine)(或环磷酰胺，如果存在对于硫唑嘌呤的副作用)；溴隐亭(bromocryptine)；戊二醛(如美国专利4,120,649中所述，其能封闭MHC抗原)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂，包括抗干扰素-γ、-β或-α抗体；抗肿瘤坏死因子-α抗体；抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体(pan-Tantibodies)，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；含有LFA-3结合域的可溶性肽(90年7月26日出版的WO90/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(美国专利5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science251430-432(1991)；WO90/11294；和WO91/01133)；及T细胞受体抗体(EP340,109)，诸如T10B9。对于类风湿性关节炎的治疗，可对患者施用本发明的CD20结合性抗体联合任意一种或多种下述药物DMARDS(缓解疾病性抗风湿药(disease-modifyingantirheumaticdrug)(例如氨甲喋呤)、NSAI或NSAID(非甾体抗炎药)、HUMIRATM(阿达木单抗(adalimumab)；AbbottLaboratories)、ARAVA(lefiunomide)、REMICADE(英夫利昔单抗(infliximab)；CentocorInc.，Malvern，Pa)、ENBREL(依那西普(etanercept)；Immunex，WA)、COX-2抑制剂。通常用于RA的DMARD是羟基氯替平(hydroxycloroquine)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、氨甲喋呤、lefiunomide、依那西普、英夫利昔单抗、硫唑嘌呤、D-青霉胺、Gold(口服)、Gold(肌内)、米诺环素(minocycline)、环孢霉素A、葡萄球菌蛋白A免疫吸附剂。阿达木单抗是结合TNFα的人单克隆抗体。英夫利昔单抗是结合TNFα的嵌合单克隆抗体。依那西普是“免疫粘附素”融和蛋白，包括人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的胞外配体结合部分，其与人IgG1的Fc部分相连。对于RA的常规治疗，例如参见“Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis”Arthritis&Rheumatism46(2)328-346(2002年2月)。在特定实施方案中，采用本发明的CD20抗体联合氨甲喋呤(MTX)治疗RA患者。MTX的示例性剂量是大约7.5-25mg/kg/wk。MTX可以通过口服和皮下进行施用。对于强直性脊柱炎、银屑病关节炎和克隆氏病的治疗，可对患者施用本发明的CD20结合性抗体联合，例如Remicade(英夫利昔单抗；获自CentocorInc.，Malvern，Pa.)，ENBREL(依那西普(etanercept)；Immunex，WA)。SLE的治疗包括高剂量皮质激素和/或环磷酰胺(HDCC)。对于银屑病的治疗，可对患者施用CD20结合性抗体联合局部治疗，诸如局部类固醇、地蒽酚(anthralin)、卡泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索(clobetasol)和他佐罗汀(tazarotene)，或者联合氨甲喋呤、类视黄醇、环孢霉素A、PUVA和UVB治疗。在一个实施方案中，采用CD20结合性抗体与环孢霉素A顺序地或同时地治疗银屑病患者。药用制剂制备依照本发明使用的抗体的治疗用制剂，即将具有所需纯化程度的抗体与任选的制药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington′sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，.Ed.(1980))，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，还包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或PEG。例示性抗CD20抗体制剂描述于WO1998/56418，其明确地引入本文作为参考。另一制剂是液体多剂量(multidose)制剂，其中含有40mg/mL抗CD20抗体，25mM醋酸盐，150mM海藻糖，0.9％苯甲醇，0.02％聚山梨酯20，pH5.0，它在2-8℃具有最少2年的保存期。另一种感兴趣的抗CD20制剂在9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL二水合柠檬酸钠，0.7mg/mL聚山梨酯80，和注射用无菌水，pH6.5中包含10mg/mL抗体。而另一种水性药用制剂包含约pH4.8-约pH5.5，优选pH5.5的10-30mM醋酸钠，量约为0.01-0.1％v/v的聚山梨酯20作为表面活性剂，量约为2-10％w/v的海藻糖以及苯甲醇作为防腐剂(U.S.6,171,586)。WO97/04801中描述了适用于皮下给药的冻干制剂。这种冻干制剂可用合适的稀释液重建成高蛋白质浓度，且重建后的制剂可皮下施用于本文中待治疗的哺乳动物。人源化2H7变体的一种制剂是在10mM组氨酸，6％蔗糖，0.02％聚山梨酯20，pH5.8含12-14mg/mL的抗体。在具体的实施方案中，2H7变体且尤其是2H7.v16的配制如下，在10mM组氨酸硫酸盐，60mg/ml蔗糖，0.2mg/ml聚山梨酯20，以及注射用无菌水，pH5.8中含20mg/mL的抗体。本文中的制剂还可包含治疗特定适应症所需的一种以上的活性化合物，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的化合物。例如，在所述制剂中还可以进一步提供细胞毒剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的药剂，诸如环孢菌素或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。此类其它试剂的有效量取决于制剂中存在的抗体的量、疾病或病症或治疗的类型、及上文讨论的其它因素。这些通常以与上文所用相同的剂量和给药路径使用，或是迄今所用剂量的约1-99％。活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中、在胶状药物传递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于Remington′sPharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.Ed.(1980)。可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ-乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。制品和试剂盒本发明的另一实施方案是包含用于治疗上述病症例如自身免疫性疾病或癌症诸如CLL的物质的制品。所述制品包含至少一个容器和容器上的或与容器相连的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、管形瓶、注射器等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料构成。至少一个容器装有治疗所述病症有效的组合物并可具有无菌存取口(例如，所述容器可以为静脉内溶液袋或管形瓶，所述管形瓶具有可用皮下注射针穿透的塞子)。制品中可以提供两种治疗组合物。第一组合物中至少一种活性剂是本发明的Fc变体抗体。标签或包装插页指明所述组合物用于治疗的特定病症。标签或包装插页可进一步包括将组合物施用于患者的说明书。包装插页是指治疗产品的商业包装中通常包含的说明书，其中包含关于使用所述治疗产品的适应症、用法、剂量、给药途径、禁忌症和/或告诫事项的信息。此外，所述制品可以进一步包含容器，该容器包含药学上可接受的缓冲液，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户的观点来看所需的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头、和注射器。实施例这些实施例用于例举说明，而并非意在限制本发明的范围。实施例1人IgG1-Fc的噬菌体展示，用于选择与人FcRn最佳化pH-依赖结合的单位点突变体对于噬菌体展示，我们采用了人IgG1Fc的“无铰链区”变体，所述变体中已除去铰链区的二硫键(删除C226，并用Ser取代C229)，并且将C-端融合到噬菌粒构建体(pW0437)中的M13gIII蛋白(g3p)的C-端区。蛋白序列(SEQID.NO.38)如图7中所示。我们作为噬菌体选择靶点使用的huFcRn已被生物素化，并俘获到pH6.0的缓冲液中中性抗生物素(neutravidin)包被的免疫吸附剂(MaxisorpTM)的平板上，用pH6.0的缓冲液充分洗涤以除去较低亲和力变体，用pH7.4的缓冲液洗脱较高亲和力的pH敏感性变体。经过第三轮选择，N434W为优势克隆(48个经测序的克隆中有44个与该变体相符)，还存在N434Y(3/48)和N434F(1/48)。为了实现Fc突变数目最小化的目的(因此将治疗性抗体中免疫原性的风险最小化)，仅单氨基酸取代包含在噬菌体展示文库中。用于通过噬菌体展示选择而构建抗体片段随机文库的大多数常用方法是同时突变多个残基的寡核苷酸定向诱变，和经由易错PCR或类似方法的随机诱变，(Clackson和Lowman(eds.)PhageDisplayAPracticalApproach，OxfordUniversityPress(2004)中给出综述)；然而，这些方法通常会导致每个分子有多个突变，然后必须重新叠合以便确定实现期望的分子性质所需的突变最小数目。作为备选方案，我们采用寡核苷酸定向诱变，通过系统地突变FcRn的10内(当FcRn与IgG结合时的结构中)的各个残基独立地构建了随机文库(通过与大鼠FcRn结构的同源性(Burnmeister，1997))。由此得到43个“小文库”(每个由具体氨基酸位点(表1)上的20个变体组成)，包含8600个变体的完整文库，用于选择单位点Fc变体，所述变体具有对FcRn增强的pH依赖结合。表1.人IgG1Fc无铰链区变体中的随机化残基以前选择以更强的亲和力与人FcRn结合的Fc变体均未成功(Dall′Acqua2002；US2003/0190311)。在那些研究中，huFcRn被直接包被在Maxisorp平板上。我们发现huFcRn对包被条件非常敏感，而且为了保持其与Fc结合的能力，其必须被生物素化，并在包被中性抗生物素的Maxisorp平板上俘获。采用50mM碳酸盐缓冲液中，pH9.6，2μg/mL中性抗生物素(neutravidin)包被Maxisorp平板，4℃过夜，然后用AssayDiluent(PBS+0.5％BSA，pH6.0)封闭。通过与10μL新鲜配制的10mM生物素-LC-NHS(Pierce)在室温下混合30分钟，将50μL的huFcRn(～0.2mg/mL)生物素化。加入10μL的1MTris灭活未反应的生物素-LC-NHS。通过在PBSpH6.0平衡的PD-10柱(Amersham-Pharmacia)上凝胶过滤，从过剩的生物素-Tris中纯化huFcRn-生物素。收集到2mL(huFcRn-生物素，5μg/mL)。在8个用中性抗生物素包被并封闭的孔中俘获huFcRn-生物素1小时(110μL/孔)。加入噬菌体前用AssayDiluent快速冲洗平板三次。通过采用2.5MNaCl/20％PEG沉淀获得密集的过夜生长的噬菌体颗粒然后在AssayDiluent中重悬，通常浓度为1013噬菌体/mL。然后噬菌体按1∶10的比例在AssayDiluent中稀释，然后与包被huFcRn-生物素的孔(或没有包被的孔，作为阴性对照)结合～1小时(100μL/孔)。用PBS+0.05％Tween，pH6.0，洗涤平板。采用对于每轮选择而言严格性递增的方式实施洗涤(第一轮10次快速洗涤；第二轮20次快速洗涤；第三轮40次快速洗涤；第四轮16次快速洗涤和20次15秒的洗涤；第五轮4次快速洗涤和1次3分钟的洗涤，重复5次(总共20次洗涤))。剩余的结合的噬菌体用110μLpH7.4的PBS洗脱，然后加入到10mL处于对数生长期的大肠杆菌(XL1-Blue；Stratagene，Inc.)中进行增殖培养。实施例2可溶性Fc变体蛋白的鉴定具有这些突变的可溶性Fc变体已被表达，纯化，并用BIAcore结合测定法对其针对人，短尾猴，大鼠，和小鼠FcRn的亲和力进行了测定。还通过大小排阻层析对所述Fc变体进行分析以测定它们的聚集趋势。通过采用变体pW0437噬菌粒转化34B8大肠杆菌细胞，在无磷酸盐培养基中于30℃生长24小时以诱导Fc基因的表达，以及收集细胞，对变体Fc片段进行了表达。细胞团冰冻过夜，然后通过渗透压休克溶解于10mMTris，1mMEDTA中。离心分离溶解产物，然后上ProteinA柱。用PBS冲洗柱，可溶性Fc被ProteinACitrateElutionBuffer(0.1M柠檬酸盐，pH3.0)洗脱，然后用pH7.5的Tris中和。在AmiconCentriprep中浓缩可溶性Fc。通过NHS化学法以不同密度(100-3000RU)将来自人，短尾猴，大鼠，或小鼠的FcRn固定在BiacoreCM5芯片上。在PBSpH6.0中系列稀释Fc变体(10μM稀释至1nM)，并即时监测结合力。对于亲本无铰链区Fc(即，野生型)，huFcRn几乎立即达到结合平衡，表明了它具有非常快的结合率和分离率，而且通过平衡分析测定Kd大约为700nM(图8)。对于N434W变体，结合率(on-rate)明显较慢，而解离率(off-rate)极其慢。通过以较慢流量和较长时间注入N434W，使平衡分析成为可能，Kd约为4nM。变体N434W，N434F，N434A，和三联变体N434A+E380A+T307A的亲和力明显增强，于pH6.0，分别超过野生型Fc～170倍，～9倍，～2.7倍，和～14倍。相反地，于pH7.4，N434变体对于huFcRn的亲和力实际上非常弱以致于不能在该测定法中进行检测。相对于野生型而言，N434W的改进对于与短尾猴FcRn的结合并不那样显著，对大鼠FcRn的结合力仅表现出高约10倍，而实际上对小鼠FcRn的结合力与WT的相同(数据未显示)。因此由该突变实现的改进具有对人FcRn的特异性。聚集的Fc可表现出由于效价影响(valencyeffect)而具有对FcRn较高的亲和力。我们通过定量大小排阻层析法测定Fc变体(WT，N434W，N434Y，N434F，N434A，和N434A+E380A+T307A)。除N434W之外，所有变体表现出至少90％的单体，而N434W具有二聚体，四聚体，和八聚体形式的显著群体。在S-200柱上通过准备的大小排阻层析从低聚物形式纯化单体N434W变体。纯化的单体材料在SPR结合力测定法中保持对huFcRn的强亲和力，这显示出对N434W检测到的亲和力增强实际上是由于其对huFcRn的内在亲和力的变化，而并非是人为的聚集。纯化的低聚N434W实际上表现出对FcRn亲和力减弱(图8)。实施例3具有FcRn突变的人源化抗CD20的IgG1变体的鉴定还在完整抗体2H7.v138的环境下，对通过人Fc噬菌体展示鉴定的突变的作用进行了测试。2H7.v138是人源化抗CD20抗体，其中为了增强ADCC和CDC活性通过下列突变对Fc进行了修饰S298A，K326A，E333A，K334A。将N434位点的突变引入该环境中，而且如前所述通过293细胞的瞬时转染制备IgG(表2)。在各个情况中，通过如上述的大小排阻层析法，纯化的IgG变体显示出具有低水平的蛋白质聚集。表2.人源化抗CD20抗体2H7.v138的变体使用生物素化FcRn，在ELISA中测定2H7.v138的人IgG1变体对人FcRn的pH-依赖结合力。用2μg/ml中性抗生物素(NeutraAvidin)(Pierce，Rockford，IL)包被MaxiSorp96孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)，加入50mM碳酸盐缓冲液，100μl/每孔，pH9.6，4℃过夜。采用含0.05％聚山梨醇酯(polysorbate)的PBS(洗涤缓冲液)，pH7.4，洗涤平板，然后采用含0.5％BSA的PBS，pH7.4，150μl/孔，进行封闭。室温孵育1小时后，用洗涤缓冲液，pH7.4，冲洗平板。用生物素-X-NHS(ResearchOrganics，Cleveland，OH)生物素化人FcRn。在平板中加入生物素化FcRn，2μg/ml，100μl/孔，于含有0.5％BSA，0.05％聚山梨醇酯20的PBS，pH7.4(样品缓冲液)中。孵育平板1小时，然后用洗涤缓冲液，pH6.0冲洗。在平板中加入用样品缓冲液，pH6.0，7次两倍连续稀释的IgG抗体(3.1-200ng/ml)。两小时孵育后，用洗涤缓冲液，pH为6.0，冲洗平板。以100μl/孔加入样品缓冲液(pH6.0)中过氧化物酶标记的抗人IgGF(ab′)2的山羊F(ab′)2(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)，检测结合的IgG。孵育1时后，用洗涤缓冲液，pH为6.0，冲洗平板，然后加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories)，100μl/孔。通过加入1M磷酸，100μl/孔，终止反应。在multiskanAscent酶标仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)上记录450nm吸光度。计算标准曲线中点的吸光度(mid-OD)。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph，Synergysoftware，Reading，PA)根据滴定曲线测定该mid-OD对应的标准品和样品的浓度。通过用标准品的mid-OD浓度除以样品的该浓度计算出相对活性。为了评估在pH6.0或pH7.4时结合的IgG与FcRn的解离，除了在样品孵育步骤之后和当冲洗平板时，加入100μl/孔pH6.0或pH7.4的样品缓冲液之外，以相似的方式实施测定法。平板孵育45分钟，然后洗涤。然后按上述方法继续测定法。结果(图9)表明相对结合亲和力与针对Fc变体检测到的相似。在pH6.0时，相对结合亲和力是v477＞v478＝v479＞v364＞v138。在pH7.4时，相对结合亲和力始终弱于pH6.0时，具有相同的相对结合力v477＞v478＝v479＞v364＞v138。这些Fc突变总的来说适用于人IgG抗体。实施例4FcRn结合力对药物代谢动力学影响的体内研究为了测定改进的FcRn结合力在体内对这些Fc变体抗体的药物代谢动力学的影响，将各个抗体变体静脉注射至短尾猴(cynomolgusmonkeys)(Macacafascicularis)或其它灵长类种系，然后即时收集血样以监视抗体的清除率。一些动物被注射了一个或多个剂量水平。在一个实验中，在第一日的0时注射单次静脉注射剂量1-20mg/kg。给药之前以及给药后的第6小时，24小时和72小时从各个动物收集血液(血清)样品。在第8日，第10日，第30日和第60日收集另外的样品。用ELISA测定血清样品中抗体的浓度。利用标准药理学技术建立由时间依赖的血清中抗体浓度降低的模型(Shargel和Yu，AppliedPharmaceuticsandPharmacokinetics，Fourthedition，pp.67-98，AppletonandLange，Stamford，CT(1999))。使用二室模型(two-compartmentmodel)解释抗体到组织的初始分布(α相)，随后是末相或消除相(β相)。由此计算得出的消除半衰期(t1/2β)表明改进的FcRn结合力的影响，因为FcRn发挥了维持循环中IgG的功能。在所述研究的一个实验中，在短尾猴中比较了对FcRn具有不同结合亲和力的3个人源化单克隆抗BR3抗体(PRO145234，PRO145181和PRO145182)的药物代谢动力学。BR3(也已知为BAFF-R)是B细胞表面上表达的184-残基的III型胯膜蛋白(Thompson，J.S.etal，(2001)Science293，2108-2111；Yan，M.，etal，(2001)Curr.Biol.11，1547-1552)。PRO145234是野生型抗BR3抗体，而PRO145181和PRO145182分别是N434A和N434W的变体，其具有增强的对人和短尾猴FcRn的结合亲和力。从SNBLUSA库中获得17只雄性和17只雌性短尾猴(Macacafascicularis)。在研究开始时进行体格检查(例如，开始适应环境)，猴年龄为～45岁，重～24kg。只有外观健康而且没有明显异常情况的动物才可用于研究。按照体重将三十只动物随机分为三组。对组1，2和3中的动物分别施用单个IV剂量20mg/kg的PRO145234(野生型)、PRO145181(N434A)、或PRO145182(N434W)。表11中总结了实验设计。表11.实验设计Cone.＝浓度a根据最近的体重计算总剂量体积(mL)。剂量体积被补至最接近0.1mL。在下列时间点从各只动物的外周静脉收集大约1.0mL血液进行药物代谢动力学分析-给药前-在实验第1日给药后的30分钟，和6小时。-在实验第2，3，4，5，8，11，15，18，22，29，36，43，50，57，64，71，78，85，92，99，106，113，120，127，和134日(每日一次)在下列时间点从各只动物的外周静脉收集大约1.0mL血液进行抗治疗性抗体分析-给药前-在研究的第15，29，43，57，71，85，99，113，127和134日(每日一次)收集用于药物代谢动力学(PK)分析和抗治疗性抗体(ATA)分析的血样，置于血清分离试管，然后于室温凝集大约30-80分钟。通过离心(2000xg室温下15分钟)获得血清(大约0.5mL)。将血清样品转移到预先标记的1.5mLEppendorf试管，然后储存于冷冻装置中维持-60℃至-80℃的温度，直至用干冰包装，并且连夜运送到Genentech以测定PRO145234，PRO145181和PRO145182浓度。使用ELISA测定法测定各血清样品中PRO145234、PRO145181或PRO145182的浓度。血清中检测定量下限((lowerlimitofquantification)LLOQ)是0.05μg/mL。在该下限值以下的值被记录为低于可报告性((lessthanreportable)LTR)。使用桥接ECLA测定法测定各样品中的抗治疗性抗体。在数据分析中使用根据时间表的具有最小偏差的额定剂量和样品收集时间。使用Excel(版本2000，MicrosoftCorporation，Redmond，WA，)计算雄性和雌性短尾猴中血清PRO145234，PRO145181，和PRO145182浓度的均值和SD，然后用SigmaPlot(版本9.0；SystatSoftware，Inc.，PointRichmond，CA)绘图。从全部数据分析中除去低于可报告性的血清浓度。当n≤2时不计算SD。结果保留三位有效数字。Gauss-Newton(Levenberg和Hartley)二室模型以1对y帽加权(hatweighting)方式评估各动物的PK参数(WinNonlinVersion3.2；PharsightCorporation；MountainView，CA)。组1(野生型；PRO145234)中10只短尾猴中的8只，组3(N434W；PRO145182)中10只短尾猴中的5只在第57日产生ATA′s。一般而言，在特殊时间检测到ATA′s与在该时间期间或该时间之后的血清中浓度的急剧下降有关，导致更短的终末半衰期(terminalhalf-time)和药物暴露量减少。为了解ATA反应对PK影响的大小，使用两种方法计算各组的均值PK参数。方法1中，使用来自各组全部10只短尾猴的数据计算PK参数(均值±标准差)。方法2中，仅使用来自第57日没有产生抗治疗性抗体的短尾猴的数据计算PK参数(组1的n＝2，组2的n＝10，而组3的n＝5)。对于组1和组3而言，与方法2相比，方法1的结果是对终末半衰期(t1/2，β)和暴露量(AUC；测量全部药物暴露量)的评估值较低。然而，使用两种方法的总体结论是相似的。因此，此处报告的PK参数均值是使用方法1(例如，包括来自全部短尾猴的数据)计算的。结果在单次IV推注给药20mg/kgPRO145234(野生型抗体)，PRO145181(N434A变体)，和PRO145182(N434W变体)之后，血清浓度表现出二相性分布，具有快速初始分布相和之后的较慢清除相(图12)。表12中显示了对各组评估的PK参数，包括来自各组全部10只短尾猴的数据。PRO145234(野生型抗体)的终末半衰期(均值±SD)是6.15±2.01天，在10只短尾猴中的值域是4.24至11.0。在第57日没有产生ATA’s的两只短尾猴中PRO145234的终末半衰期(t1/2，β)均值是8.95天。对于PRO145181(N434A变体)，其终末半衰期的均值是14.1±1.55天，大于PRO145234(p＜0.05)1.6-2.3倍。对于PRO145182(N434W变体)，在10只短尾猴中的均值±SD终末半衰期是9.55±2.49天。该值显著大于10只短尾猴中PRO145234(野生型抗体)的全部t1/2，β均值(p＜0.05)，但它与没有产生可检测的ATA′s的两只短尾猴的PRO145234的t1/2，β均值(8.95天)非常相似。该两组中ATA反应可能混淆了PRO145234(野生型抗体)和PRO145182(N434W变体)之间所检测到的t1/2，β差异。对于10只短尾猴，PRO145234(野生型抗体)的浓度-时间曲线下面积外延至无限大的区域(AUC)是2440±398天*ug/mL，值域为1740至3140天*ug/mL。在第57日没有产生ATA’s的两只短尾猴中PRO145234的均值AUC是2850天*ug/mL。对于PRO145181(N434A变体)，其均值AUC是4450±685天*ug/mL，大于PRO145234(野生型抗体)(p＜0.05)1.6-1.8倍。PRO145234(野生型抗体)和PRO145182(N434W变体)的AUC没有差异。表12PRO145234，PRO145181和PRO145182的PK参数(均值±SD)*PRO145234和PRO145182组中8/10和5/10的短尾猴中抗药抗体的存在可能混淆了PRO145234和PRO145182的PK参数(例如，AUC减弱和t1/2，β减弱)**与PRO145234的差异，p＜0.05概括而言，在对短尾猴实施单次IV剂量20mg/kg之后，检测PRO1451234，PRO145181和PRO145182的药物代谢动力学。在第56日10只短尾猴中的8只产生针对PRO145234的抗治疗性抗体(anti-therapeuticantibodies)(ATA′s)，而在第56日10只短尾猴中的5只产生针对PRO145182的ATA′s。在第56日没有短尾猴产生针对PRO145181的ATA′s。与PRO145234(野生型抗体)相比，PRO145181(N343A变体)表现出终末半衰期增高和AUC增高(p＜0.05)。与PRO145234相比，PRO145182表现出终末半衰期轻微增高；但是，针对PRO145234和PRO145182两者的抗治疗性抗体反应可能混淆了该观察到的差异。实施例5对FcγRIII结合力增强的人IgG1变体先前已经描述了通过增强IgG对激活性Fcγ受体的结合力并减弱IgG对抑制性Fcγ受体的结合力从而改进抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的突变(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.2766591-6604(2001)；Prestaetal，Biochem.Soc.Trans.30487-490(2002))。增强ADCC活性同时维持或增强补体依赖性细胞毒作用(CDC)的突变是尤其需要的，因为该两个机制可能均具有对体内CD20阳性细胞溶解的重要性。特别地，先前已经鉴定了三个Ala突变的组合通过改进C1q结合力从而改进CDC活性(Idusogieetal.，J.Immunol.1644178-4184(2000))；Idusogieetal.，J.Immunol.1662571-2575(2001))，并通过改进FcγRIII结合力和减弱FcγRII结合力改进ADCC活性S298A+E333A+K334A(Shieldsetal.，2001)。这些突变，以及其它增强ADCC和CDC活性的取代，K326A，已被导入至人源化的抗CD20抗体变体，已知为2H7.v138，(表3)。这里，我们描述了位于298，333，和334位的其它氨基酸取代。在2H7.v16环境中完成各取代，然后在ELISA中与v16比较针对人FcγRIII的高亲和力或低亲和力同种型的相对结合性(图11)。结果表明，在这些位点上的若干取代，如S298T，S298L，E333L和K334G可被很好地耐受，对于针对FcγRIII的结合亲和力的影响非常小(表1)。其它取代例如S298G，E333G和K334R对结合是不利的，这是因为这些侧链与受体的不利相互作用或因为对Fc结构的去稳定化作用。一种突变，K334L，经鉴定对FcγRIII的结合亲和力增加了＞3倍。这些结果表明，在Fc中所选择位点上，表现出具有Ala取代的影响的取代(Ala除外)能够改进对Fcγ受体的结合力。特别地，K334L改进对FcγRIII的结合力，而且与其它Fc突变例如2H7.v138中的那些相组合可进一步改进结合力。预测所述抗体变体具有改进的ADCC活性并能更有效地耗竭体内靶细胞。表3.Fc区中的取代对CD20结合力的影响。通过EU编号(Kabat，如上)表示Fc突变，而且与2H7.v16亲本相对应。通过用2H7.v16的浓度除以相等结合力所需的变体浓度来表示相对结合力；由此比率＜1表示对变体较弱的亲和力，比率＞1表示较强的亲和力。显示了关于FcγRIII的同种型F158(低亲和力)和V158(高亲和力)的结果。实施例6组氨酸突变体在该实施例中，通过按照大鼠IgG与大鼠FcRn复合物已经公开的结构(Burnmeister，1997)推论的Fc和FcRn之间界面中的残基的组氨酸扫描(His-scan)研究点突变。我们认为His的取代对IgG结合FcRn的pH依赖性作用是有利的，因为His的侧链通常可在pH6和pH7之间滴定。Fc中位点(其中质子化型有利于FcRn结合，但是非质子化型不利于FcRn结合)上的His取代会产生对于增强分子体内半衰期所期望的特性。我们探讨了在全长抗体(赫赛汀(Herceptin))中先前描述的点变体的其它特性并研究了若干新变体(包括点突变的组合)的特性。曲妥单抗(TRASTUZUMAB)FcRn变体的构建前面的实施例描述了Fc中的一些突变，所述突变改进了对FcRn的结合力而且作为Fc片段，或在完整抗体2H7.v138环境下进行了研究。为研究这些突变对全长人IgG1(但缺少其它Fc改变)的影响，使用如前述的寡核苷酸定点诱变将突变N434W，N434Y，N434F和N434A导入rhuMab4D5(trastuzumab，(赫赛汀(Herceptin)))环境中。因为采用Fc-噬菌体点突变文库发现四个芳香族氨基酸中的三个在N434位点发生取代，我们认为芳香族取代通常增强FcRn(低pH，也可能是高pH)结合力。因此，还构建了其它突变，N434H。从大规模瞬时CHO细胞培养物中纯化这5个赫赛汀(Herceptin)变体，采用ProteinA亲和层析，随后用大小排阻层析法除去聚集体。此外，在赫赛汀(Herceptin)上构建突变E380A，E380A+T307A，+/-N434A，和+/-N434H。在293细胞中表达抗体，用ProteinA色谱法纯化，测定FcRn的结合力。为了鉴定对于FcRn结合重要的其它残基，和能够改进结合力的突变，使用了组氨酸扫描的方法。这些实验用组氨酸取代Fc和FcRn之间界面上的残基(根据与大鼠FcRn结构的同源性(Burnmeister，1997))。将具有这些突变的抗体在293细胞中表达，纯化，并检测结合力，如上所述。赋予FcRn结合力改进的组氨酸扫描突变与在N434的突变组合得到另外的变体。FcRnELISA如前所述，制备可溶性FcRn(Shieldsetal.，2001)。采用50mM碳酸盐缓冲液中，pH9.6，2μg/mL中性抗生物素(NeutrAvidin)(Pierce，Rockford，IL)包被MaxiSorp96孔微孔板(Nunc，Roskilde，Denmark)，100μl/孔，4℃过夜。用含有0.05％聚山梨醇酯(洗涤缓冲液)的PBS，pH7.4，冲洗平板，然后用含有0.5％BSA的PBS，pH7.4，进行封闭，150μl/孔。室温下孵育1小时，用洗涤缓冲液，pH7.4，冲洗平板。用生物素-X-NHS(ResearchOrganics，Cleveland，OH)生物素化人FcRn。在含有0.5％BSA，0.05％聚山梨醇酯20的PBS中(检测缓冲液)，pH7.4，以2μg/ml将生物素化FcRn加入平板，100μl/孔。孵育平板1小时，然后用洗涤缓冲液，pH6.0，冲洗。在检测缓冲液中，pH6.0，7次两倍连续稀释的IgG抗体(3.1-200ng/ml)加入平板。使用赫赛汀(Herceptin)作为标准品。孵育2小时后，用洗涤缓冲液，pH6.0，冲洗平板。加入检测缓冲液，pH6.0或pH7.4，100μl/孔，实施解离步骤。孵育平板45分钟，然后用洗涤缓冲液，pH6.0，冲洗。通过加入检测缓冲液中，pH6.0，过氧化物酶标记的山羊F(ab′)2抗人IgGF(ab′)2(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)，100μl/孔，检测结合的IgG。孵育1小时后，用洗涤缓冲液，pH6.0，冲洗，然后加入底物3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories)，100μl/孔。通过加入1M磷酸，100μl/孔，终止反应。在multiskanAscent酶标仪(ThermoLabsystems，Helsinki，Finland)上记录450nm吸光度。计算pH6.0的赫赛汀曲线中点的吸光度(mid-OD)。使用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph，Synergysoftware，Reading，PA)根据滴定曲线测定该mid-OD对应的赫赛汀和样品的浓度。通过用标准品的mid-OD浓度除以样品的该浓度计算出相对活性。BIACORE方法采用BIAcore-3000表面等离子共振系统(6，7)检测了与人和短尾猴FcRn结合的若干4D5变体的表观结合率(apparentassociationrate)(Ka)，表观解离率(apparentdissociationrate)(Kd)和表观值(apparent)(KD)。各抗体对抗原的结合力(如表观平衡解离常数所示)，均以KD＝kd/ka进行计算(7)，并在平衡结合实验中直接进行测量。使用胺偶联法基本上按照厂商的说明书(6，8)所述，将人和短尾猴FcRn固定在羧甲基葡聚糖生物传感器芯片(商品目录号CM5，BIAcore，Inc.)上。简言之，采用与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合的N-乙基-N′-(3-二甲胺基丙基)-碳二亚胺盐酸化物(EDC)活化生物传感器芯片。然后将FcRn(在pH4的10mM醋酸钠中预平衡)注入到活化的芯片上从而生成固定的浓度，短尾猴FcRn(cynoFcRn)700-900反应单位(RU)和人FcRn大约2000RU。注入1M乙醇胺封闭未反应的琥珀酰亚胺组。动力学测量方法实施如下。在电泳缓冲液(pH6，包含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水)中将3倍连续稀释(1uM至0.5nM)的抗体于25℃以0.02ml/分钟的流速注入2分钟。注入0.01ml10mMTris，pH9，150mMNaCl实现再生。对于各结合力曲线，数据与单纯1∶1的Langmuir结合模型拟合。对于各结合曲线，计算伪第一级速率常数(Pseudo-firstorderrateconstant)(ks)，然后作为蛋白浓度的函数进行绘图从而获得ka+/-s.e.(拟合的标准误差)。在pH6和pH7.4实施平衡结合力检测。在电泳缓冲液(包含0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水)中将3倍连续稀释(1uM至0.5nM)的抗体于25℃以2ul/分钟的流速注入6分钟。注入后，将流速增强到0.02ml/分钟。注入0.01ml10mMTris，pH9，150mMNaCl实现再生。将平衡时结合的抗体量(Req)作为抗体浓度的函数进行绘图，并与四参数剂量反应曲线拟合以便测定KD。ELISA结果测量在pH6.0和7.4时对FcRn的结合力。按照材料和方法中所述计算相对结合亲和力，如表4中所示。结果表明在pH6时突变N434A、N434W、N434Y、N434F，或N434H的结合力改进。在pH7.4时对于N434W，N434Y，和N434F也观测到相对赫赛汀(Herceptin)的结合力增强。表4.N434点变体的FcRnELISA结果。与亲本赫赛汀分子相比，相对结合力值＞1表示增强的结合力；值＜1表示减弱的结合力。具有N434H或N434A和前述Ala取代(Shieldsetal.，2000)的组合变体在pH6.0时也表现改进的结合力，而在pH7.4时结合力少许增强或无增强(表5)。表5.N434组合变体的FcRnELISA结果。与亲本赫赛汀分子相比，相对结合力值＞1表示增强的结合力；值＜1表示减弱的结合力。Fc界面区的His-扫描鉴定了若干能够增强或减弱FcRn结合力的His取代(表6)。这些变体中的部分表现出具有pH依赖性结合，而在pH7.4时与FcRn的相互作用很小或不能检测到。虽然这些其它His突变中没有任一种能够在pH6时单独增强结合力高于N434H，取代Q31IH，D312H，N315H，和G385H，各自在pH6时改进结合力＞4倍，而在pH7.4时结合力没有显著的增强。表6.His-扫描变体的FcRnELISA结果。与亲本赫赛汀(Herceptin)分子比较，相对的结合力值＞1表示增强的结合力；值＜1表示减弱的结合力。最后，若干His扫描点突变与突变N434A或N434H配对组合。在这些变体中，双重变体T289H/N434H和N315H/N434H在pH6时表现出结合力最佳的改进，而在pH7.4时结合力没有明显改进。表7.His扫描组合变体的FcRnELISA结果。与亲本赫赛汀(Herceptin)分子相比，相对结合力值＞1表示增强的结合力；值＜1表示减弱的结合力。BIAcore结果根据ELISAFcRn结合力结果选择若干抗体，然后将其分为3组进行BIAcore分析。组1主要包括Asn434变体，组2包括组氨酸扫描变体，而组3包括以前公开的变体(3)。来自组1的抗体在pH6时动力学和平衡结合力分析的结果(表8)，提示KD的改进是ka和/或kd变化的结果。而且，能够改进对人FcRn的结合力的变体表现出也能够改进对短尾猴FcRn的结合力。在pH6时具有最好的改进结合力的变体是N434W，N434Y和N434F。然而，这些变体在pH7.4时也表现出显著增强的结合力。相反，赫赛汀(Herceptin)，N434A，N434H和T250Q/M428L在pH7.4时全部表现出由微弱至无的结合力。注意到虽然在pH7.4时N434W，N434Y和N434F的结合力比野生型Fc显著增强，但结合速度和解离速度非常快以至不能精确测定平衡解离常量。所以表4中pH7.4时的结合力用+或-表示。特别地，-表示与赫赛汀水平相似的结合力，+/-表示可以忽略的结合力，+表示明显的结合力，而++表示显著的结合力。表8.组1变体的动力学和平衡结合力比较。a根据动力学参数计算的KD。b根据平衡结合力试验计算的KD。c在293细胞中表达的蛋白。通过动力学和平衡结合力分析测定的KDs之间有一些差异。然而，这些值的比较显示对于人FcRn结合力的相关系数是0.994而对于短尾猴FcRn结合力的相关系数是0.934，这提示存在系统偏差。来自组2的抗体的动力学和平衡结合力分析(表9)，显示结果与来自组1的抗体的分析结果相似。能够改进对人FcRn的结合力的变体也表现出能够改进对短尾猴FcRn的结合力。在pH6时具有最好的改进结合力的变体是N434H/T370A/E380A，N434H/T289H和N434H/N315H。然而，这些变体在pH7.4时也表现出显著增强的结合力。相反，在pH7.4时其余抗体全部表现由弱至无的结合力。表9.组2变体的动力学和平衡结合力比较。a根据动力学参数计算的KD。b根据平衡结合力试验计算的KD。c在293细胞中表达的蛋白。在通过动力学和平衡结合力分析的KDs测定之间的相关系数的检验显示，对人FcRn结合力的相关系数是0.246，而对短尾猴FcRn结合力的相关系数是0.966。导致对人FcRn结合力的低相关系数的原因是G385H，其在平衡结合力测定期间，出现了一些聚集问题。排除该数据点所得相关系数为0.916。来自组3的抗体的动力学分析和平衡结合力分析(表10)，显示结果与来自组1的抗体的分析结果相似。能够改进对人FcRn的结合力的变体也表现出能够改进对短尾猴FcRn的结合力。在pH6时T250Q/M428L组合变体具有最好的改进结合力。虽然它在pH7.4时也具有轻微增强的结合力，但该水平低于来自组1和组2的那些变体的水平。表10.组3变体的动力学和平衡结合力比较。a根据动力学参数计算的KD。b根据平衡结合力试验的计算KD。c在293细胞中表达的蛋白质。在通过动力学和平衡结合力分析的KDs测定之间的相关系数的检验显示，对人FcRn结合力的相关系数是0.966，而对短尾猴FcRn结合力的相关系数是0.902。先前我们报告了，与野生型比较，在pH6时，包含突变N434W，N434F和N434A的无铰链区Fcs的亲和力对人FcRn结合力改进了170倍，9倍和2.7倍。在该实例中，我们在全长4D5抗体环境中观察了这些突变，以及其它突变。通过比较由平衡结合力分析得到的结果，我们发现在pH6时N434W，N434F和N434A表现出对人FcRn的亲和力改进20倍，7倍和2倍。关于对短尾猴FcRn的结合力也观察到相似结果。包含芳香族突变例如N434Y和N434H的其它变体在pH6时表现出对人FcRn的结合力增强9倍和4倍。然而，在pH7.4时N434W，N434Y和N434F变体也均表现出显著增强的对人和短尾猴FcRn的结合力。根据来自N434H的良好结果，以及在pH依赖性Fc-FcRn相互作用中组氨酸残基的重要性(9)，我们决定研究其它环境中的组氨酸突变。采用大鼠Fc-FcRn复合体的结构(9，10)，和假定与人蛋白的同源性，进行组氨酸扫描。此外，对N434H突变与Presta及其同仁鉴定的T370A和E380A突变(4)的组合进行了研究。通过BIAcore分析显示pH6时结合力改进，而在pH7.4时结合力无增加的变体包括G385H，D312H，N315H，和N434H。没有任何新组氨酸突变，或组氨酸组合突变，在pH6时表现出对FcRn结合力的改进较大程度高于单独的N434H突变带来的改进。然而，组合突变在pH7.4时全部表现出显著增强FcRn结合力。组合了两个或多个组氨酸突变的其它变体可以提供增强的与FcRn的pH依赖性结合力。此外，受His突变影响的位点的鉴定提示其它氨基酸取代的新位点。最后，我们还研究了IgG1分子环境中由Hinton及其同仁报道的突变(3)。虽然他们已报告在IgG2分子的环境中，pH6时对于T250Q，M428L和T250Q/M428L增强结合力分别为3倍，7倍和28倍，我们发现在IgG1环境中更适度的增强，分别增强3倍，3倍和5倍。关于针对短尾猴FcRn的结合力也观测到相似结果。单一变体表现出在pH7.4时不能增强对人或短尾猴FcRn结合力，而双重变体仅表现出轻微增强的结合力。在该研究中，我们定量了若干Fc变体在pH6和pH7.4时对人和短尾猴FcRn的亲和力。对于给定分子而言，我们已经测定了在人和短尾猴FcRn之间的总体亲和力和亲和力改进是相似的。通过ELISA和BIAcore测定的基于pH6时结合力改进变体的分级大体上是一致的；然而，pH7.4时结合力的评估值有时是存在差异的。这些差异可能是在所用不同固定操作中FcRn或IgG行为差异所导致的。实施例6的参考文件1.Ghetie，V.，andWard，E.S.(2000)AnnuRevImmunol18，739-7662.Ghetie，V.，andWard，E.S.(1997)ImmunolToday18，592-5983.Hinton，P.R.，Johlfs，M.G.，Xiong，J.M.，Hanestad，K.，Ong，K.C，Bullock，C，Keller，S.，Tang，M.T.，Tso，J.Y.，Vasquez，M.，andTsurushita，N.(2004)JBiolChem279，6213-62164.Shields，R.L.，Namenuk，A.K.，Hong，K.，Meng，Y.G.，Rae，J.，Briggs，J.，Xie，D.，Lai，J.，Stadlen，A.，Li，B.，Fox，J.A.，andPresta，L.G.(2001)JBiolChem116，6591-66045.Dall′Acqua，W.F.，Woods，R.M.，Ward，E.S.，Palaszynski，S.R.，Patel，N.K.，Brewah，Y.A.，Wu，H.，Kiener，P.A.，andLangermann，S.(2002)JImmunol169，5171-51806.Johnsson，B.，Lofas，S.，andLindquist，G.(1991)AnalBiochem198，268-2777.Karlsson，R.，Michaelsson，A.，andMattsson，L.(1991)JImmunolMethods145，229-2408.8.BIAcore，Inc.(1991)BIAcoreMethodsManual，Piscataway，NJ9.Martin，W.L.，West，A.P.，Jr.，Gan，L.，andBjorkman，P.J.(2001)MolCell7，867-87710.Burmeister，W.P.，Huber，A.H.，andBjorkman，P.J.(1994)Nature372，379-383参考文件本申请中引用的参考文件，包括专利，公开的申请和其它申请，由此引入作为参考。除非另有描述，实施本发明应采用所述领域技术人员知晓的分子生物学常规技术等。所述技术在现有技术中有充分的解释。例如参见，MolecularCloningALaboratoryManual，(J.Sambrooketal，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，N.Y.，1989)；CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubeletal，eds.，1987updated)；EssentialMolecularBiology(T.Browned.，IRLPress1991)；GeneExpressionTechnology(Goeddeled.，AcademicPress1991)；MethodsforCloningandAnalysisofEukarvoticGenes(A.Bothwelletal.eds.，BartlettPubl.1990)；GeneTransferandExpression(M.Kriegler，StocktonPress1990)；RecombinantDNAMethodologyII(R.Wuetal.eds.，AcademicPress1995)；PCRAPracticalApproach(M.McPhersonetal.，IRLPressatOxfordUniversityPress1991)；OligonucleotideSynthesis(M.Gaited.，1984)；CellCultureforBiochemists(R.Adamsed.，ElsevierSciencePublishers1990)；GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.Miller&M.Caloseds.，1987)；MammalianCellBiotechnology(M.Butlered.，1991)；AnimalCellCulture(J.Pollardetal.eds.，HumanaPress1990)；CultureofAnimalCells，2ndEd.(R.Freshneyetal.eds.，AlanR.Liss1987)；FlowCytometryandSorting(M.Melamedetal.eds.，Wiley-Liss1990)；MethodsinEnzvmology系列(AcademicPress，Inc.)；WirthM.andHauserH.(1993)；ImmunochemistryinPractice，3rdedition，A.Johnstone&R.Thorpe，BlackwellScience，Cambridge，MA，1996；TechniquesinImmunocytochemistry，(G.Bullock&P.Petruszeds.，AcademicPress1982，1983，1985，1989)；HandbookofExperimentalImmunology，(D.Weir&C.iBlackwell，eds.)；CurrentProtocolsinImmunology(J.Coliganetal.eds.1991)；Immunoassay(E.P.Diamandis&T.K.Christopoulos，eds.，AcademicPress，Inc.，1996)；Goding(1986)MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice(2ded)AcademicPress，NewYork；EdHarlowandDavidLane，AntibodiesAlaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork，1988；AntibodyEngineering，2ndedition(C.Borrebaeck，ed.，OxfordUniversityPress，1995)；和AnnualReviewofImmunology系列；AdvancesinImmunology系列。权利要求1.分离的多肽，所述多肽包括至少含有Asn434取代为Trp(N434W)的氨基酸取代的变体IgGFc区。2.权利要求1的多肽，其中所述变体Fc在pH6.0结合人FcRn的亲和力高于天然序列IgGFc区，并且在pH7.4的结合亲和力低于在pH6.0的结合亲和力。3.权利要求2的多肽，其中在pH6.0对人FcRn的结合亲和力至少高于天然序列Fc区的20倍。4.权利要求1的多肽，其中所述多肽在灵长类血清中的半衰期高于含有天然序列Fc区的多肽。5.权利要求4的多肽，其中灵长类是人或短尾猴。6.权利要求1的多肽，其中所述多肽是免疫粘附素。7.权利要求1的多肽，进一步包含Fc区中一个或多个氨基酸取代，所述取代导致所述多肽与含有天然序列Fc区的抗体相比，表现至少一种下列特性FcγR结合力增强，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)增强，补体依赖性细胞毒作用(CDC)增强，CDC减弱，ADCC和CDC功能增强，ADCC增强但CDC功能减弱，FcRn结合力和血清半衰期增强。8.权利要求1的多肽，进一步包括IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸取代，所述残基位点选自D265A、S298A/E333A/K334A、K334L、K322A、K326A、K326W、E380A和E380A/T307A，其中所述残基的编号是如Kabat所述的EU标号。9.分离的抗体，所述抗体包括至少含有Asn434取代为Trp(N434W)的氨基酸取代的变体IgGFc区。10.权利要求9的抗体，其中所述变体IgGFc在pH6.0结合人FcRn的亲和力高于天然序列IgGFc区，并且在pH7.4的结合亲和力低于在pH6.0的结合亲和力。11.权利要求10的抗体，其中所述变体Fc在pH6.0对人FcRn的结合亲和力至少高于天然序列IgGFc区的20倍。12.权利要求9的抗体，其中所述抗体是嵌合的、人源化或人的抗体。13.权利要求12的抗体，其中所述抗体是IgG1。14.权利要求9的抗体，其中所述抗体进一步包含Fc区中一个或多个氨基酸取代，所述取代导致所述多肽与含有天然序列Fc区的抗体相比，表现至少一种下列特性FcγR结合力增强，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)增强，补体依赖性细胞毒作用(CDC)增强，CDC减弱，ADCC和CDC功能增强，ADCC增强但CDC功能减弱，FcRn结合力和血清半衰期增强。15.权利要求9的抗体，其中所述抗体进一步包含IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸取代，所述残基位点选自D265A、S298A/E333A/K334A、K334L、K322A、K326A、K326W、E380A和E380A/T307A，其中所述残基的编号方式是如Kabat所述的EU标号。16.权利要求9的抗体，其中所述抗体结合的抗原选自CD20，Her2，BR3，TNF，IgE和CD11a。17.权利要求16的抗体，其中所述抗体结合人CD20并且包含选自下列序列的VH序列a.SEQIDNO.2；b.SEQIDNO.42；和c.SEQIDNO.45而且其中L链包含SEQIDNO.1的VL序列或SEQIDNO.26的全长序列。18.权利要求16的抗体，其中所述抗体结合人CD20并且包含如图10所示的来自SEQIDNO.24的C2B8VL序列以及来自SEQIDNO.25的VH序列。19.权利要求16的抗体，其中所述抗体结合VEGF并且包含VL和VH序列，所述VL和VH序列选自SEQIDNO.7的VL序列和SEQIDNO.8的VH序列；SEQIDNO.9的VL序列和SEQIDNO.10的VH序列；和SEQIDNO.11的VL序列和SEQIDNO.12的VH序列。20.权利要求16的抗体，其中所述抗体结合Her2并且包含VL和VH序列，所述VL和VH序列选自SEQIDNO.3的VL序列和SEQIDNO.4的VH序列；SEQIDNO.5的VL序列和SEQIDNO.6的VH序列。21.权利要求16的抗体，其中所述抗体结合人CD11a并且包含SEQIDNO.13的VL序列或SEQIDNO.15的全长L链，以及SEQIDNO.14的VH序列。22.权利要求16的抗体，其中所述抗体结合人IgE并且包含VL和VH序列，所述VL和VH序列选自SEQIDNO.47的VL序列和SEQIDNO.48的VH序列；SEQIDNO.49的VL序列和SEQIDNO.50的VH序列；SEQIDNO.51的VL序列和SEQIDNO.52的VH序列；SEQIDNO.53的VL序列和SEQIDNO.54的VH序列。23.包含权利要求1的多肽或权利要求9的抗体，以及载体的组合物。24.分离的核酸，该核酸编码权利要求9的抗体。25.表达载体，该表达载体编码权利要求1的多肽。26.分离的宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求24的核酸。27.权利要求26的宿主细胞，所述宿主细胞产生权利要求9的抗体。28.产生权利要求9的抗体的方法，包括培养权利要求27的产生多肽的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述多肽。29.制品，所述制品包括容器及其中包含的组合物，其中所述组合物包含权利要求1的多肽。30.权利要求29的制品，进一步包括指示所述组合物可以用于治疗非何杰金氏淋巴瘤的包装插页。31.治疗特征在于B细胞表达CD20的B细胞肿瘤或恶性肿瘤的方法，包括向患有所述B细胞肿瘤或恶性肿瘤的患者施用治疗有效量的权利要求17的人源化CD20结合性抗体。32.权利要求31的方法，其中所述B细胞肿瘤是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或淋巴细胞为主型何杰金氏病(LPHD)。33.治疗慢性淋巴细胞性白血病的方法，包括向患有所述白血病的患者施用治疗有效量的结合人CD20的权利要求17的抗体，其中所述抗体进一步包含氨基酸取代K326A或K326W。34.缓解B细胞调节性自身免疫性疾病的方法，包括向患有所述疾病的患者施用治疗有效量的权利要求16或17的CD20结合性抗体。35.权利要求34的方法，其中所述自身免疫性疾病选自类风湿性关节炎、青少年型类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、韦格纳病、炎性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少症、多发性硬化症、银屑病、IgA肾病、IgM多发性神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏综合征、斯耶格伦氏综合征和肾小球肾炎。36.治疗血管发生相关病症的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的权利要求19的抗体。37.治疗HER2表达性癌症的方法，包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的权利要求20的抗体。38.治疗LFA-1介导的病症的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的权利要求21的抗体。39.治疗IgE介导的病症的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的权利要求22的抗体。40.分离的多肽，所述多肽包括含有Asn434取代为Tyr(N434Y)的至少一个氨基酸取代的变体IgGFc区，其中所述多肽不进一步含有选自H433R，H433S，Y436H，Y436R，Y436T的氨基酸取代。41.分离的多肽，所述多肽包括含有Asn434取代为Phe(N434F)的至少一个氨基酸取代的变体IgGFc区，其中所述多肽不进一步含有H433K、Y436H、M252Y、S254T或T256E的氨基酸取代。42.分离的多肽，所述多肽包括含有Asn434取代为His(N434H)的至少一个氨基酸取代的变体IgGFc区。43.权利要求40、41或42任一项的多肽，其中所述变体IgGFc在pH6.0结合人FcRn的亲和力高于天然序列IgGFc区，并且在pH7.4的结合亲和力低于在pH6.0的结合亲和力。44.权利要求40、41或42任一项的多肽，其中所述多肽是抗体。45.权利要求44的多肽，其中所述抗体是嵌合的、人的或人源化的抗体。46.权利要求45的多肽，其中所述IgG是人IgG1。47.权利要求44的多肽，其中所述抗体结合抗原，所述抗原选自CD20、HER2、BR3、TNF、VEGF、IgE和CD11a。48.权利要求42的多肽，其是结合HER2的抗体。49.权利要求48的多肽，其中所述抗体包括VL和VH序列，所述VL和VH序列选自SEQIDNO.3的VL序列和与其配对的SEQIDNO.4的VH序列；SEQIDNO.5的VL序列和与其配对的SEQIDNO.6的VH序列。50.权利要求48的多肽，其中所述HER2结合性抗体进一步包括在Fc区中一个或多个氨基酸取代，所述取代导致所述多肽与含有天然序列Fc区的抗体相比，至少表现一种下列特性FcγR结合力增强，抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)增强，补体依赖性细胞毒作用(CDC)增强，CDC减弱，ADCC和CDC功能增强，ADCC增强但CDC功能减弱，FcRn结合力和血清半衰期增强。51.权利要求48的多肽，进一步包括在IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸的取代，所述残基位点选自D265A、S298A/E333A/K334A、K334L、K322A、K326A、K326W、E380A和E380A/T307A，其中所述残基的编号方式是如Kabat所述的EU标号。52.权利要求48的多肽，进一步包括IgGFc区中T307A/E380A的氨基酸取代。53.权利要求52的多肽，其中所述抗体包括和与其配对的SEQIDNO.6的VH序列配对的SEQIDNO.5的VL序列，而且所述抗体在pH6.0与人FcRn的结合力至少比亲本抗体曲妥单抗高40倍。54.权利要求48的多肽，进一步包括T289H或N315H的氨基酸取代。55.权利要求40、41或42的任一项的多肽，其中所述多肽是免疫粘附素。56.权利要求40、41或42的任一项的多肽，进一步包括在Fc区中一个或多个氨基酸取代，所述取代导致所述多肽与含有天然序列Fc区的抗体相比，至少表现一种下列特性FcγR结合力增强，ADCC增强，CDC增强，CDC减弱，ADCC和CDC功能增强，ADCC增强但CDC功能减弱。57.权利要求40、41或42的任一项的多肽，进一步包括在IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸取代，所述残基位点选自D265A、S298A/E333A/K334A、K334L、K322A、K326A、K326W、E380A和E380A/T307A，其中残基的编号方式是如Kabat所述的EU标号。58.组合物，所述组合物包含权利要求40、41、42或48任一项的多肽以及载体。59.分离的核酸，所述分离的核酸编码权利要求40、41、42或48任一项的多肽。60.分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求53的核酸。61.权利要求60的宿主细胞，所述宿主细胞产生权利要求40、41、42或48任一项的多肽。62.生产权利要求42的多肽的方法，包括培养产生权利要求42的多肽的权利要求61的宿主细胞，和从细胞培养物中回收所述多肽。63.制品，所述制品包括容器及其中包含的组合物，其中所述组合物包含权利要求40、41、42或48任一项的多肽。64.治疗HER2表达性癌症的方法，包括向患有所述癌症的患者施用治疗有效量的权利要求48的抗体。65.权利要求64的方法，其中所述抗体包括VL和VH序列，所述VL和VH序列选自SEQIDNO.3的VL序列和与其配对的SEQIDNO.4的VH序列；和SEQIDNO.5的VL序列和与其配对的SEQIDNO.6的VH序列。66.分离的多肽，所述多肽包括含有Lys334取代为亮氨酸(K334L)的至少一个氨基酸取代的变体IgGFc区。67.权利要求66的多肽，其中所述变体Fc结合人FcγRIII的亲和力高于天然序列IgGFc区。68.权利要求66的多肽，所述多肽在人效应细胞存在时表现出抗体依赖性细胞毒性作用高于含有天然序列IgGFc区的多肽。69.权利要求66的多肽，所述多肽进一步包括在Fc区中一个或多个氨基酸取代，所述取代导致所述多肽与含有天然序列Fc区的抗体相比，至少表现一种下列特性FcγR结合力增强，ADCC增强，CDC增强，CDC减弱，ADCC和CDC功能增强，ADCC增强但CDC功能减弱，FcRn结合力和血清半衰期增强。70.权利要求66的多肽，所述多肽进一步包括在IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸的取代，所述残基位点选自D265A、S298A/E333A、K322A、K326A、K326W、E380A和E380A/T307A，其中残基的编号方式是如Kabat所述的EU标号。71.权利要求66的多肽，所述多肽是嵌合的、人源化的或人的IgG抗体。72.人源化CD20结合性抗体，所述抗体含有，除Fc区中的N434被W、Y、F或A取代之外，SEQIDNO.39的L链序列和SEQIDNO.40的H链序列。73.组合物，该组合物包含权利要求72的抗体以及载体。74.分离的核酸，该核酸编码权利要求73的抗体。75.宿主细胞，该宿主细胞包含权利要求74的核酸。76.治疗特征在于B细胞表达CD20的B细胞肿瘤或恶性肿瘤的方法，包括向患有所述B细胞肿瘤或恶性肿瘤的患者施用治疗有效量的权利要求72的人源化CD20结合性抗体。77.缓解B细胞调节性自身免疫性疾病的方法，包括向患有所述病症的患者施用治疗有效量的权利要求72的人源化CD20结合性抗体。78.筛选多肽的方法，所述多肽与含有天然序列IgGFc区的多肽相比，在pH6.0与FcRn的结合亲和力强，而且在pH7.4的结合亲和力低于在pH6.0的结合亲和力，所述方法包括在噬菌体上表达候选多肽，提供在固体基质上固定的人FcRn，使噬菌体颗粒与基质上的人FcRn结合，通过多次洗涤除去没有结合的噬菌体微粒，每次洗涤的严格性递增，然后在pH7.4洗脱剩余的结合的噬菌体。79.分离的抗HER2抗体，所述抗体包括SEQIDNO.5的VL序列、SEQIDNO.6的VH序列和含有Asn434取代为Ala(N434A)的至少一个氨基酸取代的变体IgGFc区。80.权利要求79的抗体，所述抗体进一步包括在IgGFc区中残基位点的一个或多个氨基酸的取代，所述残基位点选自D265A、S298A/E333A/K334A、K334L、K322A、K326A、K326W、E380A和E380A/T307A，其中残基的编号方式是如Kabat所述的EU标号。全文摘要本发明提供具有氨基酸修饰的IgGFc区的多肽，由于其IgGFc区中的氨基酸修饰，所述多肽具有改变的效应子功能。文档编号G01N33/53GK101052654SQ200580035826公开日2007年10月10日申请日期2005年8月19日优先权日2004年8月19日发明者亨利·B·洛曼,卡梅利亚·W·亚当斯,乔纳森·S·马文,萨曼莎·利恩,玉茹·G·孟申请人:健泰科生物技术公司