专利名称：心力衰竭的生物标志的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及心力衰竭，具体地说，本发明涉及一种通过监测患者的淋巴细胞中β-肾上腺素能受体激酶(βARK1或GRK2)的水平来评估心力衰竭患者的方法。
背景技术：
β-肾上腺素能受体(βAR)直接介导心脏变力性和变时性的交感神经系统控制。成体心肌细胞主要表达β1-AR和β2-AR，其中β1-AR为丰度最大的亚型(＞75％)(Brodde，Basic Res Cardiol.9135-40(1996))。在激动剂结合以后，两种亚型均主要与G蛋白(Gs)偶联，导致心肌细胞中腺苷酰环化酶的激活以及第二信使cAMP的生成增加(Stiles等，Cardiacadrenergic receptors.Annu Rev Med.35149-64(1984))。在慢性人类心力衰竭(HF)中，心室功能的恶化与心脏βAR信号传导的改变相关，所述改变包括β1-AR密度的减少和剩余βAR的功能性解偶联(Rockman等，Nature415206-12(2002))。后一现象称为脱敏，是由G蛋白偶联受体(GPCR)激酶(GRK)对激动剂结合βAR进行磷酸化所触发(Rockman等，Nature415206-12(2002))。β1-AR和β2-AR均能被GRK磷酸化，而在心脏中，主要的GRK似乎为GRK2，也称为βAR激酶(βARK1)(Lefkowitz，Cell.74409-12(1993))。
βARK1(或GRK2)是通过与已激活的异三聚G蛋白的Gβγ亚基结合而定位于膜的胞液酶(Rockman等，Nature 415206-12(2002)，Lefkowitz，Cell.74409-12(1993)；Pierce等，Nat Rev Mol Cell Biol.3639-50(2002))。正如在心肌过表达所述激酶的转基因小鼠中所示范的，βARK1在心脏βAR信号传导和功能的调控中起作用(Koch等，Science 2681350-3(1995))。在这些小鼠中，当βARK1增加3～4倍时，响应βAR刺激的cAMP产生以及心脏收缩性明显减少(Koch等，Science 2681350-3(1995))。此外，对其中βARK1在心脏中的活性或表达降低的小鼠进行的研究表明βAR信号传导和心脏功能的增强(Koch等，Science 2681350-3(1995)，Rockman等，J Biol.Chem.27318180-4(1998))。这些研究首次描述了体内βARK1水平对心脏βAR信号传导的重要依赖性。由于在人类HF以及在动物模型中βARK1的心肌表达和活性的特征性提高，所以βARK1的心肌水平似乎是被主动调节的(Ungerer等，Circulation 87454-63(1993)；Ungerer等，Circ.Res.74206-13(1994)；Maurice等，Am.J.Physiol.276H1853-60(1999)；Anderson等，Hypertension.33402-7(1999)；Rockman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.957000-5(1998)；Ping等，Am J Physiol.273H707-17(1997)；Harris等，Basic Res Cardiol.96364-8(2001))。βARK1的这种增加(2～3倍)似乎是导致在遭危害的心肌中所见到的βAR脱敏作用提高的原因(Rockman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.957000-5(1998)；Ping等，Am J Physiol.273H707-17(1997)；Harris等，Basic Res Cardiol.96364-8(2001)；White等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.975428-33(2000))。由于β-抑制蛋白和GRK3在衰竭的人类心脏中没有改变，所以βARK1似乎是在人类HF中改变的主要βAR调节分子(Ungerer等，Circulation 87454-63(1993)；Ungerer等，Circ.Res.74206-13(1994))。虽然已在一些动物模型中显示GRK5(心肌中另一种主要的GRK)被上调(Ping等，Am J Physiol.273H707-17(1997)；Vinge等，Am.J.Physiol.281H2490-9(2001))，但还未在人类HF中研究GRK5。
βAR信号传导的分子异常与人类HF的发病机理的相关性，以及可能更重要的是与HF结果的相关性并未被完全理解。βAR信号传导的重要方面是该系统在循环白血细胞中的特性似乎反映出在实体组织中观察到的特性。1986年，这在心脏中首次观察到(Brodde等，Science 2311584-5(1986))以及许多其他报告也已使用淋巴系统来研究βAR信号传导以及来外推至心脏βAR系统(Bristow等，Clin.Investig.70S105-13(1992)；Jones等，J.Cardiovasc.Pharmacol.8562-6(1986)；Sun等，Crit.Care Med.241654-9(1996)；Dzimiri等，Clin Exp Phamacol Physiol.23498-502(1996))。
最近在实验模型中积累了许多数据，这些数据提示在衰竭的心肌中增加的βARK1表达和活性可有助于HF的发病(Rockman等，Nature415206-12(2002))。本发明至少部分上是源自以下研究经设计用于研究在人类HF的发展和严重性中心脏βAR信号传导和βARK1活性的价值。这些研究已证明血液βARK1水平和心脏(右心房)βARK1水平以直接方式相关。本发明因此提供了一种通过监测淋巴细胞βARK1含量和活性对HF的严重性进行评估的方法。
发明内容
本发明涉及一种通过监测HF患者的淋巴细胞中βARK1水平对所述HF患者的状况进行评估的方法。淋巴细胞中βARK1水平的提高与心脏βARK1水平的提高相关并与不利预后有关。
本发明的目的和优点通过以下描述将会很清楚。
图1A-1C。(图1A)显示通过视紫红质体外磷酸化所测定的可溶性GRK活性与通过蛋白免疫印迹法所检测的βARK1表达之间的正相关性的图表。(图1B)显示在外植的衰竭人类心脏的LV活组织检查样品的心脏膜中可溶性GRK活性与腺苷酰环化酶活性的异丙基肾上腺素(ISO)刺激之间的逆相关性的图表。通过超过基础刺激的％ISO响应标绘腺苷酰环化酶的活性(n＝24，P＜0.05)。(图1C)在相同样品中使用类似方法，观察到在βAR密度和βAR信号传导(超过基础刺激的经ISO刺激的腺苷酰环化酶活性，n＝24，P＜0.0001)之间的正相关。
图2A和2B。(图2A)显示在HF患者的心脏中(右心房活组织检查样品)和淋巴细胞中的βARK1表达之间的正相关性的图表。通过蛋白免疫印迹法评估βARK1表达并且数据以任意的密度测定单位表示。(图2B)源自蛋白免疫印迹的代表性放射自显影图，其显示从同一组患有不同程度的心室机能障碍的人类HF患者(#37和#53)得到的淋巴细胞提取液中和右心耳的提取液中的βARK1表达。
图3A-3C。(图3A)显示在HF患者中评估的可溶性GRK活性与心脏功能(％LV注射分数(EF))的反比关系(n＝55，p＜0.02)的图表。(图3B)使用45％LVEF的截止值，将55名HF患者分为两组。表现心脏功能下降的患者也具有较高的淋巴细胞可溶性GRK活性，*p＜0.05(不成对Student’st-检验)。(图3C)当根据患者的NYHA HF分类将所述患者分级时，淋巴细胞可溶性GRK活性有显著、渐进的增加。
图4A和4B。在LVAD植入以及随后心脏移植时从衰竭的人类LV中获得成对样品，并测量βARK1蛋白(图4A)和mRNA(图4B)(n＝12)。(图4A)显示了代表性蛋白质印迹的LVAD前(核心)和LVAD后(LV)的样品的βARK1免疫印迹结果(平均值±SEM)。(+)对照是纯化的βARK1。*，p＜0.005与LVAD前的值相比。(图4B)使用SYBR绿色荧光方法，相同样品(n＝12)的实时定量RT-PCR(反转录-聚合酶链式反应)。*，p＜0.05与LVAD前的值相比。(成对Student’s t-检验)图5A和5B。(图5A)在LVAD前后(n＝4对)的心脏样品中发现的心脏可溶性GRK活性(平均值±SEM)。可溶性心脏溶解物按所述进行纯化并与[32P-ATP]温育，纯化的杆状外侧片段膜富含GPCR视紫红质(Rho)(Choi等，J.Biol.Chem.27217223-17229(1997)；Iaccarino等，Circulation981783-1789(1998))。在插入图中显示的是凝胶电泳后磷光体掺入到Rho中的放射自显影。*，p＜0.05与LVAD前的值相比(t检验)。(图5B)来自成对的LVAD前后LV样品(n＝4)的心脏溶解物中的膜AC活性。所示数据为超过基础活性的％ISO刺激的平均值±SEM，显示出βAR响应性的显著增加。p＜0.05与LVAD前相比。
图6A和6B。(图6A)获自于LVAD植入前(前)和外植后(后)的两名患者的血液样品中的淋巴细胞βARK1蛋白水平。上述蛋白印迹的平均数据在柱状图中显示。纯化的βARK1是(+)对照。(图6B)在LVAD前(核心)和LVAD后(LV)的成对样品中的心脏GRK5蛋白水平。数据是以扫描的蛋白印迹的相对密度测定单位表示的n＝15对样品的平均值±SEM。以纯化GRK5为(+)对照，代表性的免疫印迹显示在插入图中。
具体实施例方式
本发明涉及一种通过测量淋巴细胞βARK1水平对患有HF的患者进行评估的方法。本发明源自于证明了血液和心脏βARK1水平与GRK活性以正向方式相关的研究。因此，淋巴细胞βARK1含量可作为监测心脏βARK1水平并提供心肌βAR信号传导和HF严重性的指示的简单易行的方法。可以监测βARK1水平和/或活性以评估HF疗法的进展，βARK1水平的升高是与HF患者的βAR响应性的丧失以及不利预后相联系的。
根据本发明，可以从患者中收集淋巴细胞并分析βARK1蛋白水平、GKR活性和/或βARK1 mRNA含量。更具体地说，可以收集患者血液并利用例如EDTA抗凝。可以通过Ficoll梯度(Chuang等，J.Biol.Chem.2676886-6892(1992))或其他简便手段分离淋巴细胞。然后，可将淋巴细胞进一步处理或冰冻保藏(例如在-80℃)。
可以使用多种方法中的任一种测定βARK1蛋白水平。例如，可以使用含去污剂的缓冲液处理和溶解淋巴细胞(Iaccarino等，Circulation981783-1789(1998))以及通过ELISA(酶联免疫吸附测定)技术检测胞液提取物中的βARK1蛋白水平(Oppermann等，J.Biol.Chem.2748875-8885(1999))或者使用βARK1特异性抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)的蛋白印迹法。适宜的抗体的实例包括来自Santa Cruz Biotechnology的多克隆抗体(C-20)(目录编号SC-561)和抗例如位于βARK1的羧基端的表位的单克隆抗体(Oppermann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 937649(1996))。这些抗体例如通过Upstate(例如，克隆C5/1，目录编号05-465)市售。免疫反应性βARK1的定量可通过使用例如ImageQuant软件扫描所得放射自显影胶片实现。作为另外一种选择，βARK1的可视化可以使用标准的增强化学发光法(Iaccarino等，Circulation 981783-1789(1998))实现，所用试剂盒是市售的。测定βARK1蛋白水平的其他方法包括ELISA法和免疫荧光法(Oppermann等，J.Biol.Chem.2748875-8885(1999))。尽管以上使用淋巴细胞进行参考，也有可能使用血清测量βARK1水平。
除βARK1蛋白水平以外，胞液GRK活性也可以在细胞提取物中进行分析(Iaccarino等，Circulaion 981783-1789(1998))。尽管可以使用任何简便的方法，但优选的是基于使用[γ-32P]-ATP的富含视紫红质的杆状外侧片段膜的光依赖性磷酸化的分析法(Iaccarino等，Circulation981783-1789(1998)；Iaccarino等，Hypertension 33396-401(1999)；Iaccarino等，J.Amer.Coll.Cardiol.3855-60(2001)；Choi等，J.Biol.Chem.27217223-17229(1997))。可溶性GRK活性主要表示βARK1活性。(也参见De Blasi等，J.Clin.Invest.95203-210(1995))。除视紫红质外，还可以使用合适的肽底物分析GRK2活性(Pitcher等，J.Biol.Chem.27124907-24913(1996))。
如上所述，本发明方法也可以基于淋巴细胞中βARK1 mRNA水平的测定。可以使用多种方法中的任一种测定βARK1 mRNA，这些方法包括Northern印迹分析(参见，例如，De Blasi等，J.Clin.Invest.95203-210(1995))或使用SYBR绿色荧光方法的实时定量RT-PCR(Most等，J.Clin.Invest.出版中(2004年12月))。
通过对上文的阅读应当理解，本发明方法可以用在初始患者筛查阶段，其中将患者淋巴细胞中存在的βARK1蛋白、mRNA和/或活性水平与对照(非疾病患者)水平进行比较。可用的数据指出βARK1蛋白的正常(对照)水平大约为100ng/ml全血。超过对照水平约50％以上的增加可以被认为是“高”的。在实践中，βARK1水平可与患者的基础心脏功能相关。还可以通过对各种疗法(例如药物疗法)开始后不同时间点的βARK1蛋白、mRNA和/或活性的淋巴细胞水平进行比较，可使用本发明的方法来跟踪患者的状态(例如治疗介入后)。本发明因此提供了一种监测治疗法(例如，使用ACE抑制剂、AT1拮抗剂和β-阻断剂)和过程(包括βAR阻断)对βAR信号传导的效果的方法。当时机出现时(例如在心脏手术过程中)，可以获取心肌组织样品以确保血液和组织βARK1水平之间的相关性。
在以下实施例中提供的数据证明了在人类心脏的βAR功能障碍的情况下βARK1的关键相关性。具体地说，所述数据指出测定血液样品中的βARK1可以用于监测该GRK在心肌中的相对表达水平。此外，在人类HF患者中的淋巴细胞βARK1含量和活性似乎可以跟踪疾病的严重性并因此可用于预后应用。
在以下的非限制性实施例中可以更详细地描述本发明的某些方面。
实施例1实验细节研究群体研究了三组患者。第一个组由24名由于严重功能性恶化而进行心脏移植的患者组成，并具有表1中所示的临床特征表示(组1)。第二个组包括55名患有不同程度的心脏功能障碍的允许进入重症监护病房的患者(组3)。在该组中，10名患者进行了选择性的心脏手术(表1，组2)。所有程序均遵照规定方针进行。
表1在本研究中所分析的患者的临床特征
心肌样品在血液缓冲的心脏麻痹后，在24名患有由于缺血性或扩张性心肌炎导致的HF的患者的心脏移植期间，从衰竭的心脏获得透壁的左心室(LV)组织(≈2g湿重)样品。从正在进行心脏外科手术(主动脉冠状动脉旁路移植术或者瓣膜置换术)的组2的患者也获得右心耳(≈200mg湿重)。在取样后立即将所有样品放置在冰冷盐水中，清洗后在液氮中冷冻并保存在-80℃。
外周淋巴细胞样品收集血液并用EDTA抗凝。对于组2患者，在手术前一天收集血液。使用HISTOPAQUE-1077(Sigma)通过Ficoll梯度分离淋巴细胞，冷冻并保存在-80℃直至进行分析的当日(Bristow等，Clin.Investig.70S105-13(1992)Sun等，Crit.Care Med.241654-9(1996)。
βAR密度和膜腺苷酰环化酶活性分析如以前所述从心肌活组织检查样品或淋巴细胞制备粗制心肌膜(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998)；Iaccarino等，Hypertension33396-401(1999))。使用非选择性βAR配体[125I]-CYP通过放射性配体结合来测定βAR密度，并且在基础条件下，或者在100μmol/L异丙基肾上腺素(ISO)或10mmol/L NaF和cAMP存在下，使用标准方法对膜腺苷酰环化酶活性和cAMP进行定量(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998)；Iaccarino等，Hypertension 33396-401(1999))。
蛋白免疫印迹如以前所述，在免疫沉淀(IP)以后使用去污剂增溶的心脏提取物进行βARK1的心肌水平的免疫检测(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998)；Iaccarino等，Hypertension 33396-401(1999))。使用单克隆抗-GRK2/GRK3抗体(C5/1，Upstate Biotechnology)进行IP(免疫沉淀)，然后使用特异性βARK1(GRK2)多克隆抗体(C-20，(目录编号SC-561)，Santa CruzBiotechnology)进行蛋白印迹(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998)；Iaccarino等，Hypertension 33396-401(1999)；Iaccarino等，J.Amer.Coll.Cardiol.3855-60(2001))。通过扫描所述放射自显影胶片和使用ImageQuant软件(Molecular Dynamics)进行免疫反应性βARK1的定量(Iaccarino等，J.Amer.Coll.Cardiol.3855-60(2001))。
GRK活性分析在2mL不含去污剂的冰冷溶解缓冲液中，通过心脏组织或者淋巴细胞的均质化制备提取物。胞液部分和膜部分通过离心分离，然后使用[γ-32P]-ATP通过富含视紫红质的杆状外侧片段膜的光依赖性磷酸化测定胞液部分中的可溶性GRK活性(100μg～150μg蛋白)(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998)；Iaccarino等，Hypertension 33396-401(1999)；Iaccarino等，J.Amer.Coll.Cardiol.3855-60(2001)；Choi等，J.Biol.Chem.27217223-17229(1997))。可溶性GRK活性主要代表βARK1活性，βARK1表达的变化与βAR信号传导的改变相关(Choi等，J.Biol.Chem.27217223-17229(1997))。
统计分析使用Windows版本用的Systat 7.0软件进行统计分析。数值以平均数±SEM给出。为比较各组，使用不成对Student’s t检验。使用线性回归检验分析来研究变量间的相关性。当F检验的p值小于0.05时认为相关性显著。还在向前逐步多元回归分析中使用βAR密度、GRK活性和腺苷酰环化酶活性作为系数计算了βAR密度和GRK活性对腺苷酰环化酶活性的效果。
结果衰竭人类心肌中的β-肾上腺素能信号传导在其移植手术期间取得心脏组织的患者(组1)的临床特征列在表1中。首次评估βARK1在来自这些衰竭心脏样品的胞液提取物中的表达和活性，发现βARK1蛋白和体外GRK活性之间有正相关性(R＝0.609，P＜0.05；n＝24)(图1A)。由于动物实验研究中已表明心肌βARK1水平能显著影响心脏中的βAR信号传导(Koch等，Science 2681350-1353(1995)；Rockman等，J Biol.Chem.27318180-18184(1998))，评估了心脏膜中βAR介导的腺苷酰环化酶活性和胞液βARK1活性之间的关系。也评估了相同的衰竭心脏活体检查样品中的βAR密度和cAMP生成之间的关系。首先，发现了可溶性GRK活性和βAR响应性之间的明显逆相关性。如图1B所描述，当GRK活性越大时，βAR信号传导(正如通过ISO刺激的腺苷酰环化酶活性所测定的)受到抑制。此外，正如所预料的，发现在ISO介导的cAMP生成和心肌βAR密度之间有正相关性(图1C)。因此，正如线性回归分析所指出的，βAR密度和GRK活性均明显影响cAMP的生成(F＝31.861，p＜0.001；βAR密度T6,285，p＜0.001；GRK活性T-3,311，p＜0.005)。
为了验证改变的心肌β-肾上腺素能信号传导与人类HF的结果之间是否有任何关系，以及验证βARK1活性是否与疾病的严重性相关联，测量了LV活组织检查样品中的可溶性GRK活性，并比较了以下不同时期的患者间的水平，所述不同时期为从最初的HF诊断到进行心脏移植的介入或者LV辅助设备的植入。在该分析中使用的人群由来自组1(表1)的15名HF快速发展(＜2年)的患者。任意选择所述时间段是为了避免在具有更长病史的患者体内发生的适应性机制的任何混淆效果。在该组中，5名患者需要在诊断后7个月之内进行介入，并且在所述患者中，心脏可溶性GRK活性(46±10fmol Pi/mg蛋白/min)明显高于在来自于其他10名患者的心肌提取物中所发现的心脏可溶性GRK活性(30±2fmol Pi/mg蛋白/min)(p＜0.005，t检验)，所述其他10名患者在最初HF诊断后7～24个月间进行介入。有趣的是，在这相同的两组中，心肌βAR密度(41±13fmol/mg膜蛋白对比38±4fmol/mg膜蛋白)或者腺苷酰环化酶活性没有差别。因此，虽然该小样本量相对较小并且由此选择截留条件，但是这些数据提示心肌βARK1可以是比βAR密度或偶联更适宜的疾病严重性和/或进展风险的预测指标。
HF中外周淋巴细胞中的β-肾上腺素能信号传导所检验的假设是βAR系统特别是白血细胞中βARK1是否可以用作在衰竭心肌中看到的βAR系统的替代者。为验证心脏淋巴细胞和外周淋巴细胞间在GRK活性方面是否有任何相关性，测量了组2患者(表1)的患者中来自手术活组织检查样品的右心耳中和淋巴细胞中的βARK1的表达。这些患者进行了冠状动脉疾病手术或瓣膜置换并基本上为NYHA类1-3HF。如图2A所示，发现心肌βARK1和淋巴细胞βARK1之间的表达具有正相关性，指示了该GRK的淋巴细胞水平反映了心脏表达。具体地说，当βARK1水平在心肌中升高时，这在淋巴提取物中也明显。该情况的实例显示在两名具有不同疾病严重性的HF患者(图2B)中。
根据该观察，淋巴细胞βARK1表达和GRK活性分析扩展到更多具有不同心脏功能程度的患者，所述心脏功能程度的范围从正常到明显降低(由超声波心动描记术检测)。这些患者(组3)的特征列在表1中。通过用LV射血分数(LVEF，％)相对可溶性淋巴细胞GRK活性作图可以具体地说明淋巴细胞βARK1含量是否与心脏功能相关。如图3A所示，55名所述患者的血液中的LVEF和βARK1活性之间存在统计上明显的逆相关性。当将该组以45％LVEF为功能性截留点分为两组时可以更清楚地看到这一点。在来自于LV功能较差的患者的白血细胞中，胞液GRK活性明显较高(图3B)。相似的是，观察到GRK活性随NYHA功能性分类而逐步增加(图3C)。没有考虑这些患者中的所有其他变量，例如运动耐量、特殊的药物治疗或其他的心脏功能测量，使用LVEF似乎指出在具有较弱心室功能的患者中，具有在外周淋巴细胞中可测量出的较高的心脏βARK1活性水平。
总而言之，上述研究着眼于GRK、βARK1(或GRK2)在人类HF中的作用并提供了三种主要的新观察结果1)证实在衰竭人类心脏中增加的心脏βARK1水平与降低的βAR信号传导相关；2)直接证实利用外周淋巴细胞可以监测心脏βARK1水平和GRK活性；以及3)提示增加的βARK1可能与更快的HF进展和不利的临床后果相关联。这些数据指出在最初筛查HF时测量HF患者中该GRK的血液水平的有用性。
动物模型中的一些研究已提供了以下机制的详细分析，通过所述机制βARK1参与到βAR信号传导的解偶联和HF的发作中(Rockman等，Nature 415206-12(2002)。与之对比，仅有两项研究描述了在来自于外植时的衰竭人类心脏的解剖样品中的βARK1水平的增加(Ungerer等，Circulation 87454-63(1993)；Ungerer等，Circ.Res.74206-13(1994)。通过评估来自于外植时获取的类似的LV活组织检查样品的βARK1和βAR信号传导，发现在βARK1和GRK活性和βAR信号传导之间具有逆相关性。这是支持已有知识(即在心肌βAR密度和响应βAR刺激时的心脏cAMP生成间存在正相关性)的重要信息。这些数据提示在人类心脏βAR功能障碍的情况中βARK1的关键相关性。在βAR信号传导中涉及的关键调控过程是受体脱敏和内化，这是由βARK1或其他GRK对βAR进行磷酸化所触发的(Rockman等，Nature 415206-12(2002)；Lefkowitz，Cell.74409-12(1993)；Pierce等，Nat Rev Mol Cell Biol.3639-50(2002))。其他机制也可能促成HF中的βAR功能障碍，所述机制例如环化酶抑制性G蛋白Gi的α亚基(Gαi)的上调，以及腺苷酰环化酶异构体的表达改变(Bristow等，J.Amer.Coll.Cardiol.2261A-71A(1993))。然而，由于如下事实，即发现在衰竭心脏中，在βAR响应性和GRK活性间明显地逆相关性，因此βARK1似乎在人类心肌βAR调节和功能中起关键作用。
本研究的另一个明显发现是证实在淋巴细胞和心脏(右心耳)的βARK1表达和活性之间存在正相关性。因此测量血液样品中的βARK1可用于监测该GRK在心肌中的相对表达水平。首先由Brodde等假设了使用淋巴细胞来监测心脏中的药物诱导或疾病诱导的βAR改变的可能性(在人类中难以获得心脏)(Science 2311584-5(1986))，并进一步由其他人实现(Feldman等，J.Clin.Invest.79290-4(1987))。已由多个研究组提出了监测HF患者的淋巴细胞中βAR信号传导的组分的用途，然而关于测量淋巴细胞中G蛋白、βAR密度和cAMP的最终用途方面的数据是冲突的(Brodde等，Science 2311584-5(1986)；Feldman等，J.Clin.Invest.79290-4(1987)；Maisel等，Circulation 811198-204(1990)；Gros等，J ClinInvest.992087-93(1997))。关于GRK，已有证据表明增加的淋巴细胞βARK1是包括高血压等一些心血管病理的特征，这支持了在心脏和淋巴细胞βAR系统间的表现型间发(Feldman等，J.Clin.Invest.792904(1987)；Maisel等，Circulation 811198-204(1990)；Gros等，J.Clin.Invest.992087-93(1997))。本研究通过提供新发现加强了该状况，所述新发现为该系统能用于研究关键的βAR调控分子βARK1以及与其相关的可溶性GRK活性。此外，人类HF患者中的淋巴细胞βARK1含量和活性似乎可跟踪疾病的严重性。虽然目前的数据还不支持使用淋巴细胞GRK监测作为个体患者后果的预测指标，但其的确是HF患者的最初筛查和跟踪调查中的潜在有用标志。
负责淋巴细胞和心肌中βAR系统进行类似改变的机制还不确定。最近来自于Brodde及其合作者(Werner等，Basic Res.Cardiol.96290-8(2001))的数据显示HF中的βAR阻断(在动物中降低心脏βARK1和提高信号传导的治疗(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998))也能提高对淋巴细胞中儿茶酚胺的功能性和免疫性应答(Wemer等，Basic Res.Cardiol.96290-8(2001))。通过这些淋巴细胞中βAR系统的信号传导得以提高而不管对心脏功能的影响如何(Werner等，Basic Res.Cardiol.96290-8(2001))。这些数据支持以下概念，即淋巴细胞和心脏中的GRK系统以类似方式受到调控。已知长期暴露于儿茶酚胺诱导βAR信号传导异常，例如βAR下调，且已知HF与增加的循环去甲肾上腺素相关(Bristow等，J.Amer.Coll.Cardiol.2261A-71A(1993))；Hasking等，Circulation 73615-21(1986))。重要的是，在HF患者中，免疫应答可受交感神经系统调节，并且其根本机制似乎涉及β2-AR(Murray等，Circulation 86203-13(1992))，这可通过在HF患者中增强的肾上腺素刺激而发生(Kaye等，Am.J.Physiol.269H182-8(1995))。由于心肌βARK1在响应慢性肾上腺素能激活时被上调(Iaccarino等，Circulation 981783-1789(1998)；Iaccarino等，Hypertension 33396-401(1999)；Iaccarino等，J.Amer.Coll.Cardiol.3855-60(2001)；Iaccarino等，Hypertension 38255-260(2001))，一种可能性是增加的循环儿茶酚胺(即去甲肾上腺素和肾上腺素)能通过β1-AR和β2-AR刺激的方式触发淋巴细胞和心脏中的βARK1表达的提高。然而，需要在使用βAR拮抗剂治疗的HF患者中进一步探讨该假设以确定在心脏和循环白血细胞中的βAR的慢性儿茶酚胺活化的阻断是否的确能影响βARK1的表达。这些进一步的临床研究对于更好地阐述淋巴细胞βARK1活性和心肌肾上腺素能响应性之间的关系也是非常重要的。令人感兴趣的是，这已经在长期暴露于卡维地洛和阿替洛尔的小鼠的心脏中(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998))和使用β-阻断剂治疗的HF猪中(Ping等，J.Clin.Invest.951271-80(1995))的情况下得以显示确实是这样的。体外研究表明β-阻断剂通过减少βARK1 mRNA和蛋白来降低βARK1的表达(Iaccarino等，Circulation 981783-9(1998))。
在HF的动物模型中，心脏GRK活性上调是频繁地(Maurice等，Am.J.Physiol.276H1853-60(1999)；Anderson等，Hypertension.33402-7(1999)；Rockman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.957000-5(1998)；Ping等，Am J Physiol.273H707-17(1997)；Harris等，Basic Res Cardiol.96364-8(2001)；Iaccarino等，J.Amer.Coll.Cardiol.3855-60(2001)；Akhter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.9412100-5(1997)；Asai等，J.Clin.Invest.104551-8(1999)；Cho等，J.Biol.Chem.27422251-6(1999))，但并非总是(Dorn等，Mol.Pharmacol.57278-87(2000))被观察到。该观察结果可能提示该激酶在HF中的不同作用。在本研究中，观察到降低的心脏性能(例如LVEF)并不总是与增加的βARK1水平相关。然而，所述数据指出βARK1与HF中(如在缺血性患者中)更多负面结果相关，较高的心脏GRK活性与更快速进展的HF相关。这些在人类中的发现与最近在转基因小鼠中的研究类似，其中增加的βARK1表达和活性与严重的心肌症和早期死亡率相关(Iaccarino等，J.Amer.Coll.Cardiol.3855-60(2001))。在以下发现中可能最好地描述代表在人类HF被监测的分子的βARK1预测疾病严重性的情况，所述发现是随着NYHA HF类别的升高，βARK1显著地逐渐更高。这与脑钠尿肽(BNP)所显示的类似(Lee等，J.Card Failure 8149-54(2002))。重要的是，类似BNP，淋巴细胞中βARK1的表达和活性代表了对于人类HF来说，新型的易于获得的生物标志。总体而言，所述数据指出测量淋巴细胞βARK1水平对评估患有HF的患者是有用的。涉及更大群体的研究可用于阐明βARK1在HF中的预测性作用。
实施例2已进行了涉及使用已经历LV机械辅助装置(LVAD)植入手术的患者的心脏的研究。这些患者通常在数月之内经历了心脏移植并因此在去负荷(unloading)前后可以获得心脏样品。重要的是，使用LVAD作为“移植桥梁”已显示出可导致衰竭心肌的恢复，这是被称为反向重塑的过程(Zafeiridis等，Circulation 98656-662(1998))。由于先前的研究已显示将心脏结构和功能归一化为包括改善的βAR响应性等的LVAD后反向重塑的特征(Zafeiridis等，Circulation 98656-662(1998))，所以假定在该过程中可能涉及到βARK1。已在LVAD前后的人类LV样品中测定心脏βARK1mRNA、蛋白和GRK活性。通过使用成对样品，可具体地研究LVAD支持前后在相同心脏中的βARK1。初始结果清楚地表明在一段时间的去负荷后，衰竭心脏中的βARK1减少(图4)。
如蛋白印迹所示(图4A)，虽然LVAD前βARK1蛋白量是变化的，但是在LVAD介导的去负荷后存在明显的降低。在这些患者中使用LVAD的平均时间为2个月。使用SYBR绿色荧光方法通过实时RT-PCR定量βARK1 mRNA，并且这也显示在人类HF中去负荷后βARK1表达的明显降低(图4B)。βARK1 mRNA和蛋白均降低大约50％。
也检查了LVAD之前和之后的成对人类HF样品组中的心脏GRK活性和βAR信号传导，初步结果显示在图5中。与mRNA和蛋白的结果一致(图5)，可溶性心脏GRK针对GPCR底物视紫红质的体外活性在LVAD后的LV中明显降低。以前已记载心脏提取物中的可溶性GRK活性几乎完全来自于βARK1(Iaccarino等，Circulation 981783-1789(1998))。由于这些样品中的膜ISO刺激的AC活性明显提高，所以较低的βARK1活性似乎在去负荷后的肌细胞恢复中发挥重要作用(图5B)。因此，如上所述，在外植的衰竭人类心脏中(图1A)，心脏GRK活性与βAR信号传导和响应性之间存在逆相关性。
也希望能确定在LVAD治疗的患者的血液中发现的βARK1水平是否与其心脏水平相关，以及淋巴细胞βARK1是否可用于监测LVAD术后功能性的改善或者是否可有助于预测机械去负荷后心肌的恢复。已开始在制备自LVAD患者的淋巴细胞中测量βARK1。在LVAD植入前从患者获取血液样品和淋巴细胞，然后在外植和心脏移植时再次获取血液样品和淋巴细胞。两组LVAD患者样品中的初步结果显示在表6A中。与心脏βARK1蛋白类似，βARK1的淋巴细胞水平在两个月的LVAD支持后大量降低。
最后，在HF的动物模型中的许多研究已显示与βARK1类似，GRK5也被上调，因此它在心脏信号传导和功能中发挥重要作用并对HF是重要的。已在15对LVAD前和后的心脏样品中测量了GRK5表达水平，在去负荷后没有发现GRK5蛋白水平的改变(图6B)。实时PCR也显示LVAD后GRK5表达水平没有改变。这些结果支持以下结论，即βARK1是参与心脏βAR信号传导和功能的调控的关键GRK，并且对HF是重要的。
总而言之，上述数据证明在衰竭人类心脏中，LVAD支持与βARK1mRNA、蛋白和GRK活性的水平降低相关，而所述βARK1 mRNA、蛋白和GRK活性的水平降低是可以在这些患者的淋巴细胞中重现的，LVAD支持提供了一种可能的机制以在所述衰竭心脏的机械去负荷后恢复βAR信号传导和反向重塑。
***以上引用的所有文献和其他信息源特此以参考的方式全文引入。
权利要求
1.一种监测患者中的心脏β-肾上腺素能受体激酶(βARK1)水平的方法，该方法包括监测所述患者淋巴细胞中的βARK1水平，其中，βARK1的淋巴细胞水平的改变指示所述患者中心脏βARK1水平的改变。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述淋巴细胞中的βARK1水平是通过分析所述淋巴细胞中的βARK1蛋白水平而测定的。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述βARK1蛋白水平是通过ELISA来分析的。
4.如权利要求2所述的方法，其中，所述βARK1蛋白水平是通过使用βARK1特异性抗体的蛋白印迹法来分析的。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述淋巴细胞中的βARK1水平是通过分析所述淋巴细胞中的βARK1 mRNA水平而测定的。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述βARK1 mRNA水平通过定量RT-PCR来分析。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述患者患有心力衰竭。
8.一种监测心力衰竭患者的心脏功能的方法，该方法包括比较在第一时间点和第二时间点的所述患者淋巴细胞中的βARK1水平，其中，与所述第一时间点相比，在所述第二时间点的淋巴细胞βARK1水平的降低指示在所述第二时间点所述患者的心脏功能改善，并且其中，与所述第一时间点相比，在所述第二时间点的淋巴细胞βARK1水平的提高指示在所述第二时间点所述患者的心脏功能降低。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述第一时间点和第二时间点分别在对所述患者进行心力衰竭治疗之前和之后，其中，与所述第一时间点相比，在所述第二时间点的所述淋巴细胞βARK1水平没有变化或者有提高指示对所述治疗没有响应。
10.一种监测患者中βARK1活性的心脏水平的方法，该方法包括监测所述患者淋巴细胞中的βARK1活性水平，其中，βARK1活性的淋巴细胞水平的改变指示所述患者中βARK1活性的心脏水平的改变。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述患者患有心力衰竭。
12.一种监测心力衰竭患者的心脏功能的方法，该方法包括比较在第一时间点和第二时间点的所述患者淋巴细胞中的βARK1活性水平，其中，与所述第一时间点相比，在所述第二时间点的淋巴细胞βARK1活性水平的降低指示在所述第二时间点所述患者的心脏功能改善，并且其中，与所述第一时间点相比，在所述第二时间点的淋巴细胞βARK1活性水平的提高指示在所述第二时间点所述患者的心脏功能降低。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述第一时间点和第二时间点分别在对所述患者进行心力衰竭治疗之前和之后，其中，与所述第一时间点相比，在所述第二时间点的所述淋巴细胞βARK1水平没有变化或者有提高指示对所述治疗没有响应。
全文摘要
本发明涉及心力衰竭的生物标志。本发明大体上涉及心力衰竭，具体地说，本发明涉及一种通过监测来自心力衰竭患者的淋巴细胞中的β－肾上腺素能受体激酶(βARK1)的水平来评估心力衰竭患者的方法。
文档编号G01N33/543GK101084439SQ200580044066
公开日2007年12月5日 申请日期2005年11月4日 优先权日2004年11月8日
发明者沃尔特·J·科赫, 吉多·亚卡里诺 申请人:杜克大学