Asc作为结肠直肠癌的标记的用途的制作方法

专利名称：Asc作为结肠直肠癌的标记的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及结肠直肠癌的诊断。它公开了含有胱天蛋白酶相关募集结构域的细胞凋亡相关斑点样蛋白(＝ASC)在结肠直肠癌的诊断中的用途。而且，它尤其涉及通过测量样品中的ASC，从源自个体的液体样品诊断结肠直肠癌的方法。ASC的测量可以例如用于结肠直肠癌的早期检测或经历外科手术的患者的监护。
背景技术：
尽管检测和治疗的进展，但癌症仍然是主要的公共健康挑战。在各种类型的癌症中，结肠直肠癌(＝CRC)是西方世界最常见的癌症之一。
结肠直肠癌最经常从腺瘤(息肉)发展成恶性癌。通常根据Dukes氏病期A至D来分类CRC的不同病期。
癌症的分期是疾病关于程度、进展和严重性的分类。其将癌症患者分组，从而可以对预后和选择治疗作出概括。
TNM系统是当前最广泛使用的癌症解剖学程度的分类。该系统代表国际接受的统一分期系统。它有三个基本变量T(原发肿瘤的程度)，N(局部淋巴结状态)以及M(存在或不存在远处转移)。TNM标准由UICC(International Union Against Cancer)公布，1997版本(Sobin，L.H.和Fleming，I.D.，TNM 80(1997)1803-4)。
特别重要的是，CRC的早期诊断转变为好很多的预后。结肠直肠的恶性肿瘤起于良性肿瘤，即腺瘤。因此，在腺瘤病期诊断的那些患者具有最好的预后。在已经存在远处转移时诊断的患者仅有10％的五年生存率，与此相比，如果处理得当，在早至Tis、N0、M0或T1-3；N0；M0病期诊断的患者，在诊断后具有超过90％的五年生存机会。
就本发明来说，CRC的早期诊断指在恶化前状态(腺瘤)或在完全没有转移(既非邻近的也非远处的)的肿瘤病期，即存在腺瘤、Tis、N0、M0或T1-4；N0；M0的病期，进行的诊断。Tis表示原位癌。
更优选地，在CRC尚未完全生长穿过肠壁时进行CRC诊断，且这样既没有脏层腹膜穿孔也没有其它器官或结构受侵，即，在病期Tis、N0、M0或T1-3；N0；M0(＝Tis-3；N0；M0)中作出诊断。
癌症能够越早得到检测/诊断，总生存率就越高。对于CRC，这一点尤其正确。晚期肿瘤的预后差。超过三分之一的患者将在诊断后五年内死于进行性疾病，对应于约40％的五年生存率。目前的治疗仅仅治愈一部分患者，而且对在疾病早期诊断的那些患者显然具有最佳作用。
关于作为公共健康问题的CRC，有必要开发对结肠直肠癌更有效的筛选和预防措施。
目前，关于结肠直肠癌可用的最早检测程序包括使用粪便血液检验或内窥镜检查程序。然而，在检测粪便血液之前一般必须存在显著的肿瘤大小。以愈创木脂为基础的粪便潜血试验的灵敏性约为26％，意味着74％具有恶性病变的患者将仍然未检测到(Ahlquist，D.A.，Gastroenterol.Clin.North Am.26(1997)41-55)。癌变前和癌性病变的显像代表早期检测的最佳方法，但是结肠镜检查是昂贵、具有风险和并发症的侵入性方法(Silvis，S.E.等，JAMA 235(1976)928-930；Geenen，J.E.，等，Am.J.Dig.Dis.20(1975)231-235；Anderson，W.F.等，J.Natl.Cancer Institute 94(2002)1126-1133)。
为了具有临床效用，作为单独标记的新的诊断标记应当至少与本领域已知的最佳单独标记一样好。或者，如果单独或分别与一个或多个其它标记联合使用，一个新的诊断标记应当引起诊断灵敏性和/或特异性的改进。通过检验的接收器工作特性(receiver-operatingcharacterisitics)对其诊断灵敏性和/或特异性进行最佳评价，所述接收器工作特性将在下面详细介绍。
最近，欧洲肿瘤标记研究组(European Group on TumorMarkers)(EGTM)已经综述了生物化学标记在结肠直肠癌中的临床应用(Duffy，M.J.，等，Eur.J.Cancer 39(2003)718-727)。
目前，主要可利用基于检测肿瘤相关糖蛋白癌胚抗原(CEA)的诊断性血液检验来辅助CRC领域的诊断。在从结肠直肠癌、胃癌和胰癌和大部分乳腺癌、肺癌以及头部和颈部癌患者得到的组织样品中，95％样品中CEA升高(Goldenberg，D.M.等，J.Natl.Cancer Inst.(Bethesda)57(1976)11-22)。在非恶性疾病患者中也有过CEA水平升高的报导，而且许多结肠直肠癌患者具有正常的血清CEA水平，特别是在疾病的早期阶段(Carriquiry，L.A.，和Pineyro，A.，Dis.Colon Rectum 42(1999)921-929；Herrera，M.A.等，Ann.Surg.183(1976)5-9；Wanebo，H.J.，等，N.Engl.J.Med.299(1978)448-451)。据报导，从血清或血浆测量的CEA在检测复发中的效用是有争议的，且也未得到广泛应用(Martell，R.E.，等，Int.J.Biol.Markers 13(1998)145-149；Moertel，C.G.等，JAMA 270(1993)943-947)。
根据现有数据，血清CEA测定既不具有灵敏性也不具有特异性来使其用于无症状群体中结肠直肠癌的筛选检验(Reynoso，G.等，JAMA 220(1972)361-365；Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
全血、血清或血浆是临床常规中最广泛使用的样品来源。对有助于可靠的癌症检测或提供早期预后信息的早期CRC肿瘤标记的鉴定，可以产生将大大帮助该疾病诊断和控制的诊断性测定。因此，存在改进CRC的体外评价的急迫的临床需求。由于早期诊断的患者的存活机会大大高于在疾病进展后期得到诊断的患者，所以改进CRC的早期诊断尤其重要。

发明内容
本发明的任务是，研究是否可以鉴定用于评价CRC的生物化学标记。
令人惊讶的是，已发现标记ASC的使用至少可以部分地克服从本领域技术水平已知的问题。
本发明因此涉及通过生物化学标记体外评价结肠直肠癌的方法，其包含a)测量样品中ASC的浓度，和b)使用步骤(a)中测定的浓度，评价结肠直肠癌。
本发明的另一个优选的实施方案是评价结肠直肠癌的方法，其包含下述步骤a)在适合对ASC特异性的结合剂和ASC之间形成复合物的条件下，使从个体获得的液体样品接触所述结合剂，和b)将(a)中形成的复合物的量与结肠直肠癌的评价相关联。
本发明的另一个优选的实施方案涉及通过生物化学标记体外评价结肠直肠癌的方法，其包含测量样品中ASC的浓度和结肠直肠癌的一种或多种其它标记的浓度，并使用测定的浓度评价结肠直肠癌。
本发明还涉及包含至少ASC和CYFRA21-1的标记组在CRC的评价中的用途。
本发明还涉及包含至少ASC和NSE的标记组在CRC的评价中的用途。
本发明还提供了用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含至少分别特异性地测量ASC和CYFRA21-1所需的试剂，和任选的用于实现测量的辅助试剂。
本发明还提供了用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含至少分别特异性地测量ASC和NSE所需的试剂，和任选的用于实现测量的辅助试剂。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及体外评价结肠直肠癌的方法，其包含下述步骤a)测量样品中ASC的浓度，b)任选地测量样品中结肠直肠癌的一种或多种其它标记的浓度，和c)使用在步骤(a)和任选的步骤(b)中测定的浓度，评价结肠直肠癌。
如本文所使用的，下面术语的每一个在本部分中具有与它相关的含义。
冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用于指一个(种)或超过一个(种)(即至少一个(种))冠词的语法上的对象。作为实例，“一种标记”指一种标记或超过一种标记。
术语“标记”或“生物化学标记”在本文中用于指要用作分析患者实验样品的靶的分子。这样的分子靶的实例是存在于样品中的蛋白或多肽本身以及抗体。在本发明中用作标记的蛋白或多肽预期包括所述蛋白的任意变体以及所述蛋白或所述变体的片段，特别是免疫学上可检测的片段。本领域的技术人员可认识到，受到损害(例如，在炎症过程中)的由细胞释放的蛋白或存在于胞外基质中的蛋白，可被降解或切割成这样的片段。以无活性形式合成某些标记，其可以随后通过蛋白水解来激活。如熟练的技术人员将明白的，蛋白或其片段也可以作为复合物的部分而存在。这样的复合物也可以用作本发明意义上的标记。标记多肽的变体由相同基因编码，但是它们的PI或分子量(MW)或二者不同(例如，作为可变mRNA或前mRNA加工的结果，例如可变剪接或限制性蛋白水解)，且另外或可选择地，可以源自有差别的翻译后修饰(例如，糖基化、酰化和/或磷酸化)。
术语“评价结肠直肠癌”用于指，本发明的方法将(单独地或与其它标记或变量一起，例如，UICC(UICC(International UnionAgainst Cancer)，Sobin，L.H.，Wittekind，Ch.(编)，TNMClassification of Malignant Tumours，第5版，1997)所述的标准)，例如，辅助医师确定或证实是否存在CRC，或辅助医师进行预后、检测复发(外科手术后患者的随访)和/或监控治疗，尤其是化疗。
术语“样品”在本文中用于指为体外评价目的而得到的生物学样品。在本发明的方法中，样品或患者样品优选地可以包含任意的体液。优选的试验样品包括血、血清、血浆、尿、唾液和滑液。优选的样品是全血、血清、血浆或滑液，其中血浆或血清是最优选的。如熟练的技术人员将明白的，体外进行任意的这种评价。此后抛弃患者样品。患者样品单独地用于本发明的体外方法，且患者样品材料不再输回到患者体内。一般地，样品是液体样品，例如，全血、血清或血浆。
在优选的实施方案中，本发明涉及通过生物化学标记体外评价CRC的方法，其包含测量样品中的ASC浓度，和使用测定的浓度评价CRC。
“含有胱天蛋白酶相关募集结构域的细胞凋亡相关斑点样蛋白”(ASC)也称作“甲基化诱导的沉默的靶1”(TMS1)(Swiss-PROTQ9ULZ3)，其特征在于SEQ ID NO1给出的序列。该序列翻译成理论分子量21,627 Da和理论等电点pH 6.29。
胱天蛋白酶相关募集结构域(CARD)介导衔接蛋白如APAF1(细胞凋亡蛋白酶激活因子1)和参与细胞凋亡的胱天蛋白酶前体形式(例如，CASP 9)之间的相互作用。ASC是含有CARD的衔接蛋白家族的成员。
通过免疫筛选前髓细胞(promyelocytic)细胞系，Masumoto等分离了编码ASC的cDNA。推论的195-氨基酸蛋白含有N-末端热蛋白-样结构域(PYD)和87-残基C-末端CARD。蛋白印迹分析显示了22-kDa蛋白的表达，并表明ASC可以通过增加白血病细胞系对抗癌药物的细胞凋亡刺激的易感性，具有促细胞凋亡(proapoptotic)活性(Masumoto，J.，等，J.Biol.Chem.274(1999)33835-33838)。
Conway等的甲基化-敏感的限制PCR和甲基化-特异性的PCR(MSP)分析表明，ASC的沉默与外显子1周围的CpG岛的过度甲基化有关，且DNMT1(DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶-1)的超表达促进过度甲基化和ASC的沉默。乳腺癌细胞系(而不是正常的乳房组织)表现出ASC的完全甲基化，且不表达ASC信号。ASC在乳腺癌细胞系中的表达抑制生长，并减少存活集落的数目。Conway等的结论是，ASC在促进胱天蛋白酶-依赖性的细胞凋亡中起作用，且ASC的超表达抑制乳腺癌细胞的生长(Conway，K.E.，等，Cancer Research 60(2000)6236-6242)。
McConnell和Vertino显示，ASC的诱导型表达抑制细胞增殖，并诱导可以被胱天蛋白酶抑制剂阻断的DNA断裂。免疫荧光显微镜术证实，细胞凋亡的诱导造成CARD-依赖性的从弥散性细胞质表达向球形核周聚集体的变化(McConnell，B.B.，和Vertino，P.M.，CancerResearch 60(2000)6243-6247)。
Moriani等不仅在乳腺癌细胞中而且还在胃癌中观察到了ASC基因的甲基化。他们提出了ASC基因的异常甲基化在涉及促细胞凋亡的ASC基因的下调的乳腺癌和胃癌的发展中的直接作用(Moriani，R.，等，Anticancer Research 22(2002)4163-4168)。
Conway等检查了用于TMS1甲基化的初生乳房组织，并将结果与健康组织中的甲基化相对比(Conway K.E.，等，Cancer Research60(2000)6236-6242)。Levine等发现，ASC沉默与特定CpG位点的甲基化无关，但是与ASC CpG岛的密集甲基化有关。排它地含有甲基化的ASC拷贝的乳腺肿瘤细胞系不表达ASC，而在部分甲基化的细胞系中，ASC的表达水平与存在于细胞群体中的甲基化ASC等位基因的百分比直接相关(Levine，J.J.，等，Oncogene 22(2003)3475-3488)。
Virmani等检查了肺癌和乳腺癌组织中的ASC的甲基化状态。他们发现，ASC的异常甲基化存在于46％乳腺癌细胞系和32％乳腺肿瘤组织中。甲基化罕见于非恶性乳腺组织中(7％)(Virmani，A.，等，Int.J.Cancer 106(2003)198-204)。
Shiohara等发现，ASC的上调与人嗜中性粒细胞中的炎症和细胞凋亡密切相关(Shiohara，M.，等，Blood 98(2001)229a)。
Masumoto等观察到了在上皮细胞和白细胞中大量表达的ASC的高水平(Masumoto，J.，等，Journal Histochem.Cytochem.49(2001)1269-1275)。
对技术人员显而易见的是，本发明不应该解释为局限于SEQ IDNO1的全长蛋白ASC。ASC的生理或人工片段、ASC的二级修饰以及ASC的等位基因变体也包括在本发明中。人工片段优选包括合成地或由重组技术产生的肽，该肽至少包含一个具有诊断重要性的表位，该表位由至少6个邻接的氨基酸组成，这6个氨基酸衍生自SEQID NO1公开的序列。这样的片段可以有利地用于抗体的产生，或者作为免疫测定的标准。人工片段更优选包含至少两个适于建立夹心免疫测定的目的表位。
根据本发明的评价方法基于得自个体的液体样品。与本领域已知的方法不同，使用特异性结合试剂从该液体样品特异性地测量ASC。
特异性结合试剂为，例如，ASC受体、结合ASC的凝集素或ASC抗体。特异性结合试剂对其相应的靶分子具有至少107l/mol的亲和力。特异性结合试剂优选对其靶分子具有108l/mol的亲和力，或甚至更优选109l/mol的亲和力。技术人员将理解，使用术语特异性的表示样品中存在的其它生物分子不与ASC的特异性结合试剂发生显著的结合。优选地，与除靶分子之外的生物分子结合的水平导致与靶分子亲和力的仅10％，更优选仅仅5％或更低的结合亲和力。最优选的特异性结合试剂将同时满足上述关于亲和力和特异性的最小标准。
特异性结合试剂优选是与ASC反应的抗体。术语抗体指多克隆抗体、单克隆抗体、这类抗体的片段、以及包含抗体结合结构域的遗传构建体。
可以使用保留了上述特异性结合试剂标准的任何抗体片段。使用现有技术水平方法产生抗体，例如Tijssen(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays 11(1990)全书，尤其第43-78页；Elsevier，Amsterdam)中所说明的。另外，熟练的技术人员充分认识到，以免疫吸附剂为基础的方法可以用于抗体的特异性分离。使用这些方法，可以加强多克隆抗体的质量并因此加强其在免疫测定中的性能(Tijssen，P.，见上，第108-115页)。
为达到在本发明中公开的成绩，已使用在兔中产生的多克隆抗体。然而，显然也可以使用来自不同物种，例如大鼠或豚鼠的多克隆抗体，以及单克隆抗体。由于具有恒定特征的单克隆抗体能够以任何需要量产生，所以它们代表了临床常规测定开发中的理想工具。在根据本发明的方法中，ASC的单克隆抗体的产生和使用是另一个优选的实施方案。
技术人员现在将理解，ASC已鉴定为用于CRC诊断中的标记，可以使用可选的途径以达到能够与本发明成绩相比的结果。例如，可以使用可选的策略以产生抗体。除了别的的以外，这些策略包含使用合成肽，该肽代表用于免疫的ASC表位。或者，可以使用DNA免疫接种，也称为DNA疫苗接种。
为了测量，在适于形成结合试剂ASC-复合物的条件下，将从个体获得的液体样品与ASC特异性结合试剂温育。由于技术人员不进行任何创造性努力就可以轻易地确定这类适宜的温育条件，所以这样的条件无需说明。
作为本发明公开的方法的最后步骤，测量复合物的量，并将其与CRC的诊断关联。技术人员将理解，测量特异性结合试剂ASC-复合物量的许多方法都在有关教科书中得到详细说明(参阅，例如TijssenP.，见上，或Diamandis等编(1996)Immunoassay，Academic Press，Boston)。
优选以夹心型测定形式检测ASC。在这类测定中，使用第一种特异性结合试剂将ASC捕获于一侧，且在另一侧使用第二种特异性结合试剂，该试剂经过标记，可以直接或间接检测。
如上所述，已令人惊讶地发现，可以在从个体样品获得的液体样品中测量ASC。在CRC评价中，不需要组织和活组织检查样品来应用标记ASC。
在优选的实施方案中，以血清为液体样品材料，实施根据本发明的方法。在另一个优选的实施方案中，以血浆为液体样品材料，实施根据本发明的方法。在另一个优选的实施方案中，以全血为液体样品材料，实施根据本发明的方法。
另外，也可以使用技术人员已知的各种方法准备粪便，以产生液体样品。这些由粪便产生的液体样品也代表了根据本发明的优选实施方案。
本发明的发明人已经令人惊讶地能在体液样品中检测到蛋白ASC。更惊讶的是，他们能够证实，ASC在从个体获得的液体样品中的存在可以与结肠直肠癌评价关联。优选地，ASC抗体用于定性(ASC是否存在)或定量(确定ASC的量)免疫测定。
已经证实，测量蛋白ASC的水平在CRC领域非常有用。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及作为标记分子的蛋白ASC在从个体得到的液体样品评价结肠直肠癌中的用途。
诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，例如，在感染性疾病中。在所有其它情况下，正确的诊断可能非常困难，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在CRC的情况下。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的疾病，例如在CRC领域中，没有生物化学标记的诊断是100％特异性且同时100％灵敏性的。相反地，使用生物化学标记来以某种可能性或预测值评价疾病的存在与否。因此，在常规的临床诊断中，通常综合考虑各种临床症状和生物学标记来诊断、治疗和拉制潜在的疾病。
可以单独地测定生物化学标记，或者，在本发明的优选的实施方案中，可以使用基于芯片或珠的阵列技术，同时测量它们。然后，使用每种标记的单独截止值，独立地解释生物标记的浓度，或者可以组合它们进行解释。
在本发明的另一个优选的实施方案中，在包含下述步骤的方法中，进行根据本发明的结肠直肠癌的评价a)测量样品中ASC的浓度，b)任选地测量样品中结肠直肠癌的一种或多种其它标记，和c)使用在步骤(a)中测定的浓度和任选的在步骤(b)中测定的浓度，评价结肠直肠癌。
优选地，通过测量ASC浓度和一种或多种其它标记的浓度，并使用ASC浓度和一种或多种其它标记的浓度评价CRC，来进行评价CRC的方法。
本发明也涉及通过生物化学标记体外评价CRC的方法，其包含，测量样品中ASC的浓度和CRC的一种或多种其它标记的浓度，并使用测定的浓度评价CRC。
根据实施例部分显示的数据，标记ASC在单变量分析(在约90％的特异性)中对CRC具有54.7％的灵敏性。在CRC的评价中，标记ASC在一个或多个下述方面是有益的筛选；诊断辅助；预后；化疗的监控，和随访。
筛选CRC是发达国家男性和女性的第二最常见的恶性肿瘤。因为它的高患病率、它的长期无症状阶段和存在恶化前病变，CRC满足许多筛选标准。显然，与FOB测试或内窥镜检查相比，具有可接受的灵敏性和特异性的血清肿瘤标记更适用于筛选。
实施例部分给出的数据证实，单独的ASC不足以允许进行普通筛选，例如，有危险患CRC的群体。最可能地，循环中的单个生物化学标记不能满足筛选目的所要求的灵敏性和特异性标准。相反，必须预见到在CRC筛选中必须使用标记组。在本发明中确立的数据表明，标记ASC将形成适用于筛选目的的标记组的主要部分。本发明因此涉及ASC作为用于CRC筛选目的的CRC标记组的一种标记的用途。本发明的数据还表明，标记的某些组合在CRC的筛选中是有利的。因此，本发明还涉及包含ASC和CYFRA21-1的标记组、或包含ASC和NSE的标记组、或包含ASC和CYFRA21-1和NSE的标记组在筛选CRC目的中的用途。
诊断辅助手术前的CEA值具有有限的诊断价值。尽管如此，欧洲肿瘤标记委员会(European Committee on Tumor Markers)(ECTM)建议，应当在外科手术前测量CFA，以确立基线值和评价预后。因为根据本发明的数据，ASC作为单一标记可能至少是与CEA一样好的单一标记或甚至更优越，所以必须预见到，ASC可以用作诊断辅助，尤其是通过在外科手术前确立基线值。
本发明因而也涉及ASC在CRC外科手术前确立基线值中的用途。
预后确定CRC患者的预后的黄金标准是，Dukes氏定义的疾病的扩展、TNM或其它分期系统，如果要将标记(例如CEA)用于预测结果，它必须提供比现有的分期系统所提供的更强的预后信息，提供独立于现有系统的信息，或提供在由现有标准定义的特定亚群内的预后数据，例如在Dukes氏B或结节阴性的患者中。
最近，美国癌症联合委员会(American Joint Committee onCancer)(AJCC)一致会议提出，CEA应当加入结肠直肠癌的TNM分期系统中。应当如下命名CEA水平CX，不能评价CEA；CO，CEA未升高(＜5μg/l)，或CEA1，CEA升高(＞5μg/l)(Compton，C.，等，Cancer 88(2000)1739-1757)。
由于单独的ASC明显有助于区分CRC患者和健康对照或健康对照+非恶性的结肠疾病，所以必须预见到，它将辅助评价患有CRC的患者的预后。手术前的ASC水平最可能与CRC的一种或多种其它标记和/或TNM分期系统相组合，如AJCC为CEA所提议的。在优选的实施方案中，ASC用于CRC患者的预后。
化疗的监控许多报告已经描述了CEA在监控晚期CRC患者的治疗中的用途(综述见，Refs.Duffy，M.J.，Clin.Chem.47(2001)625-630；Fletcher，R.H.，Ann.Int.Med.104(1986)66-73；Anonymous，J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)。其中的大多数是回顾性的、非随机化的，且包含少数患者。这些研究表明a)CEA水平降低同时接受化疗的患者通常具有比CEA水平不降低的那些患者更好的结果，和(b)对于几乎所有的患者，CEA水平的升高与疾病进展有关。
由于实施例部分显示的数据，所以必须预见到，在化疗的监控方面，ASC将至少是与CEA一样好的标记。本发明因此也涉及ASC用于监控处于化疗中的CRC患者的用途。
随访大约50％经历外科手术切除的患者的目的是治愈、转移性疾病的更迟复发(Berman，J.M.，等，Lancet 355(2000)395-399)。这些复发的大多数在诊断的前2-3年内发生，且通常局限在肝、肺或局部区域(locoregional area).由于复发性/转移性疾病总是致命的，所以大量的研究已经集中在它的早期鉴别上，以及因而潜在地可治疗的阶段。结果，许多这样的患者经历手术后的监护计划，这经常包括使用CEA的常规监控。
已经显示，使用CEA的系列监控以约80％的灵敏性和约70％的特异性检测复发性/转移性疾病，并提供5个月的平均超前时间(lead-time)(综述见，Duffy，M.J.，等，同上，和Fletcher，R.H.，同上)。而且，CEA是无症状患者的复发的最常见的指示剂(Pietra，N.，等，Dis.Colon Rectum 41(1998)1127-1133和Graham，R.A.，等，Ann.Surg.228(1998)59-63)，且在检测潜在地可治愈的复发性疾病方面，比放射学更节省成本。关于复发/转移的位点，CEA对于肝转移的检测最灵敏(几乎100％)。另一方面，CEA对于诊断局部区域的复发不太可靠，灵敏性仅仅是约60％(Moertel，C.G.，等，Jama 270(1993)943-7)。
作为患者便利、疾病检测的成本和效率之间的折衷，EGTM组和ASCO组一样(Anonymous，J.Clin.Oncol.14(1996)2843-2877)提出，在原始诊断后，可以每2-3个月进行一次CEA测试，持续至少3年。3年后，以更低的频率进行测试，例如每6个月。但是没有证据支持该测试频率。
如上面关于现有技术水平的讨论所表明的，外科手术后CRC患者的随访是适当生物化学标记的最重要的应用领域之一。由于ASC在研究的CRC患者中的高灵敏性，所以预见到单独的或与一种或多种其它标记相联合的ASC将极大地有助于CRC患者的随访，尤其是外科手术后CRC患者的随访。包含ASC和CRC的一种或多种其它标记的标记组在CRC患者的随访中的用途，代表本发明的另一个优选的实施方案。
本发明公开了，且因此在优选的实施方案中涉及，ASC分别在CRC的诊断领域或在CRC的评价中的用途。
在另一个优选的实施方案中，本发明涉及与结肠直肠癌的一种或多种标记分子相联合的作为结肠直肠癌的标记分子的ASC在从个体得到的液体样品评价结肠直肠癌中的用途。在这点上，表述“一种或多种”代表1-20，优选1-10，优选1-5，更优选3或4。ASC和一种或多种其它标记形成CRC标记组。
因而，本发明的优选的实施方案是，与结肠直肠癌的一种或多种标记分子相联合的作为结肠直肠癌的标记分子的ASC在从个体得到的液体样品评价结肠直肠癌中的用途。可以与ASC的测量相组合的优选选择的其它CRC标记是NSE、CYFRA21-1、NMMT、CA19-9、CA72-4和/或CEA。进一步优选地，在CRC的评价中使用的标记组包含ASC和选自NSE、CYFRA21-1和NMMT的至少一种其它标记分子。
在下面更详细地讨论了优选地与ASC相组合或形成包含ASC的CRC标记组的部分的标记。
NSE(神经元特异性烯醇化酶)糖酵解酶烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油酸水解酶，EC4.2.1.11，分子量约80kD)以多种二聚体同工型存在，其包含3种免疫学上不同的亚基，称作α、β和γ。烯醇化酶的α-亚基存在于哺乳动物的许多类型的组织中，而β-亚基主要见于心脏和横纹肌肉系统中。烯醇化酶同工型αγ和γγ称作神经元特异性烯醇化酶(NSE)或γ-烯醇化酶，主要在神经元和神经内分泌细胞以及源自它们的肿瘤中可以高浓度地检测到(Lamerz R.，NSE(Neuronen-spezifische Enolase)，γ-Enolase.InThomas L(ed)Clinical Laboratory Diagnosis，TH-Books，Frankfurt，1stEnglish Edition 1998979-981，5.deutsche Auflage 19981000-1003)。
NSE被描述为监控小细胞支气管癌的首选标记(Lamerz R.，同上)，而对于非小细胞支气管癌，CYFRA21-1优于NSE(Ebert W.，等，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem 32(1994)189-199)。
升高的NSE浓度见于60-81％小细胞支气管癌病例中。
NSE与转移的位点或脑转移没有关联，但是与临床病期(即疾病的程度)有好的关联。
作为对化疗的响应，首个治疗周期后24-72小时，NSE水平暂时升高，其原因是肿瘤细胞的溶解。在此后一周内或在首个治疗周期结束时，血清值快速降低(其在治疗前升高)。相反地，治疗的非应答者表现出恒定升高的水平，或不能落入参考范围内。在缓解过程中，80-96％患者具有正常值。在复发的情况下，发现升高的NSE值。在有些情况下，该升高的发生具有1-4个月的潜伏期，且经常是指数的(倍增时间为10-94天)，且与存活时间段相关联。在监控小细胞支气管癌的治疗和疾病进程的过程中，NSE可以用作单一预后因子和活性标记诊断灵敏性93％，阳性预测值92％(Lamerz R.，同上)。
在成神经细胞瘤中，在62％患病儿童中发现超过30ng/ml的NSE血清值。中值随疾病的病期而升高。病理性NSE值的量级或频率和疾病病期之前存在显著的关联；与无病的存活存在负关联。
68-73％精原细胞瘤患者具有临床上显著的NSE升高(LamerzR.，同上)。与该疾病的临床进程存在有用的关联。
NSE也已经在其它肿瘤中测量到在22％病例(在所有病期的癌)中，非肺的恶性疾病表现出大于25ng/ml的值。脑肿瘤(例如神经胶质瘤、脑膜瘤(miningioma)、神经纤维瘤和神经鞘瘤)仅仅有时伴有升高的血清NSE值。在原发性脑肿瘤或脑转移和恶性黑素瘤和嗜铬细胞瘤中，升高的NSE-值可以发生在CSF(脑脊液)中。对于14％限于器官的和46％转移性肾癌，已经报道了升高的NSE浓度，其与作为独立的预后因子的等级相关联。
在良性疾病中，已经在良性肺病和脑病患者中发现了升高的血清NSE浓度(＞12ng/ml)。已经在脑血管脑膜炎、弥散性脑炎、脊髓小脑变性、脑缺血、脑梗死、脑内血肿、蛛网膜下腔出血、颅脑损伤、炎性脑病、器质性癫痫、精神分裂症和Jakob-Creutzfeld病中发现了升高的值，主要在液体中(Lamerz R.，同上)。
根据生产商的说明书，使用Roche产品号12133113，已经在Elecsys分析仪上测量了NSE。
CA19-9糖抗原19-9使用单克隆抗体1116-NS-19-9，定义了测量的CA19-9值。测量了具有约10,000道尔顿的分子量的糖脂上的1116-NS-19-9-反应性决定簇。该粘蛋白相当于Lewis-a血型决定簇的半抗原，且是许多粘膜细胞的组分(Koprowski，H.，等，Somatic Cell Genet 5(1979)957-971)。
3-7％群体具有Lewis a-阴性的/b-阴性的血型构型，且不能表达具有反应性决定簇CA19-9的粘蛋白。当解释该发现时，必须予以考虑。
粘蛋白发生在胎儿胃、肠和胰上皮中。低浓度也可见于肝、肺和胰的成年组织中(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，BoeringerMannheim，目录号1536869(engl)，1320947(dtsch).ISBN 3-926725-07-9 dtsch/engl.，Juergen Hartmann Verlag，Marloffstein-Rathsberg(1993)；Herlyn，M.，等，J.Clin.Immunol 2(1982)135-140)。
CA19-9测定值可以辅助有差别地诊断和监控胰癌患者(灵敏性70-87％)(Ritts，R.E.，Jr.，等，Int.J.Cancer 33(1984)339-345)。肿瘤块和CA 19-9测定值之间没有关联。但是，具有大于10,000U/mL的CA19-9血清水平的患者几乎总是具有远端转移。
CA19-9的测定不能用于胰癌的早期检测(Steinberg，W.M.，等，Gastroenterology 90(1986)343-349)。
在肝胆癌中，CA19-9值提供50-75％的灵敏性。在胃癌的情况下，推荐同时测定CA72-4和CEA。在结肠直肠癌中，单独测定CEA是足够的；仅仅在罕见的CEA-阴性的情况下，CA19-9的测定是有用的。
由于粘蛋白排它地通过肝排泄，所以在有些情况下，甚至轻微的胆汁郁积也导致明显升高的CA19-9血清水平。升高的CA19-9值也见于许多良性和炎性的胃肠道和肝疾病中，以及囊性纤维化中。
根据生产商的说明书，使用Roche产品号11776193，已经在Elecsys分析仪上测量了CA19-9。
CEA癌胚抗原CEA是一种单体糖蛋白(分子量约180.000道尔顿)，其含有约45-60％的可变糖组分(Gold，P.和Freedman，S.O.，J.Exp Med 121(1965)439-462)。
CEA，如AFP，属于在胚胎和胎儿时间段生成的癌胎(carcinofetal)抗原组。CEA基因家族由2个亚组中的约17个活性基因组成。第一组含有CEA和非特异性的交叉反应抗原(NCA)；第二组含有妊娠特异性的糖蛋白(PSG)。
CEA主要见于胎儿胃肠道和胎儿血清。它也以微量存在于健康成年人的肠、胰和肝组织中。出生后，CEA的形成受到抑制，且因此在健康成年人中几乎难以测量到血清CEA值。
在结肠直肠腺癌的情况下，经常发现高CEA浓度(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，同上)。轻微至中等CEA升高(很少＞10ng/mL)发生在20-50％肠、胰、肝和肺的良性疾病中(例如肝硬化、慢性肝炎、胰腺炎、溃疡性结肠炎、Crohn氏病、肺气肿)(Stieber，P.和Fateh-Moghadam，A.，同上)。吸烟者也具有升高的CEA值。
CEA测定的主要指示是结肠直肠癌的随访和治疗控制。
不推荐CEA测定用于一般群体的癌症筛选。正常范围内的CEA浓度不能排除恶性疾病的可能存在。
在Roche Diagnostics生产的测定中的抗体与CEA反应，且与胎粪抗原(NCA2)反应(如同几乎所有的CEA方法一样)。与NCA1的交叉反应性是0.7％(Hammarstrom，S.，等，Cancer Res.49(1989)4852-4858和Bormer，O.P.，Tumor Biol.12(1991)9-15)。
根据生产商的说明书，使用Roche产品号11731629，已经在Elecsys分析仪上测量了CEA。
CYFRA21-1“CYFRA21-1”的测定特异性地测量存在于循环中的细胞角蛋白19的可溶片段。CYFRA 21-1的测量通常是基于两种单克隆抗体的(Bodenmueller，H.，等，Int.J.Biol.Markers 9(1994)75-81)。在来自德国Roche Diagnostics的CYFRA 21-1测定中，使用了两种特异性的单克隆抗体(KS19.1和BM19.21)，并测量具有约30,000道尔顿分子量的细胞角蛋白19的可溶片段。
细胞角蛋白是形成上皮中间丝的亚基的结构蛋白。迄今已经鉴别出20种不同的细胞角蛋白多肽。由于它们的特异性分布模式，它们非常适用作肿瘤病理学的区分标记。完整的细胞角蛋白多肽溶解度低，但是在血清中可以检测到可溶片段(Bodenmueller，H.，等，同上)。
CYFRA21-1是非小细胞肺癌(NSCLC)的非常确定的标记。CYFRA 21-1的主要指示是监控非小细胞肺癌(NSCLC)的进程(Sturgeon，C.，Clinical Chemistry 48(2002)1151-1159)。
高CYFRA21-1血清水平指示着非小细胞肺癌患者的晚期肿瘤病期和较差预后(van der Gaast，A.，等，Br.J.Cancer 69(1994)525-528)。正常的或仅仅轻微升高的值不能排除肿瘤的存在。
CYFRA21-1血清水平快速下降至正常范围，证明成功的治疗。恒定的CYFRA21-1值或CYFRA21-1值的轻微的或仅仅缓慢的降低，指示着肿瘤的不完全去除、或具有对应的治疗和预后结果的多种肿瘤的存在。通过升高的CYFRA21-1值，经常可以比临床症状学和成像方法更早地显示疾病的进展。
已经接受，肺癌的初步诊断应当基于临床症状学、成像或内窥镜方法和手术中的发现。肺中不清楚的圆形病灶以及＞30ng/mL的CYFRA21-1值，以高可能性指示着原发性支气管癌的存在。
CYFRA21-1也适用于肌侵入性(myoinvasive)膀胱癌的进程监控。相对于良性肺病(肺炎、结节病、结核病、慢性支气管炎、支气管哮喘、肺气肿)，CYFRA21-1表现出良好的特异性。
轻微升高的值(最高达10ng/mL)罕见于明显的良性肝病和肾衰竭中。与性别、年龄或吸烟无关。CYFRA21-1的值也不受妊娠的影响。
最近已经发现，CYFRA21-1也可以在乳腺癌领域中用于检测疾病复发和评价治疗功效(Nakata，B.，等，British J.of Cancer(2004)1-6)。
根据生产商的说明书，使用Roche产品号11820966，已经在Elecsys分析仪上测量了CYFRA21-1。
如上面进一步提及的，CYFRA21-1是NSCLC领域的确定的标记。当开发和确立NSCLC的CYFRA21-1时，已经使用了源自某些非恶性肺病患者的非恶性疾病对照。已经认为，这对于区分良性和恶性肺病是重要的(H.Bodenmüller，等，同上)。
仅仅最近才可能检测源自CRC患者的样品中的显著百分比的标记CYFRA21-1.另外，CYFRA21-1在从个体得到的这种液体样品中的存在，可以用于评价结肠直肠癌。特别地，认为与其它标记CYFRA21-1的组合是CRC领域非常有用的标记。
NNMT蛋白烟酰胺N-甲基转移酶(NNMT；Swiss-PROTP40261)具有29.6kDa的表观分子量和5.56的等电点。
NNMT催化烟酰胺和其它吡啶的N-甲基化。该活性对于许多药物和异生素化合物的生物转化是重要的。据报道，该蛋白主要在肝中表达，并位于细胞质中。已经从来自人肝的cDNA克隆了NNMT，且其含有792-核苷酸可读框，其编码具有29.6kDa的计算分子量的264-氨基酸蛋白(Aksoy，S.，等，J.Biol.Chem.269(1994)14835-14840)。关于该酶在人癌症中的潜在作用，文献中知之甚少。在一篇论文中，将升高的肝NNMT酶活性报道为小鼠癌性恶病质的标记(Okamura，A.，等，Jpn.J.Cancer Res.89(1998)649-656)。在一篇近期的报告中，证实了在辐射敏感的细胞系中，辐射引起的NNMT基因的下调(Kassem，H.，等，Iht.J.Cancer 101(2002)454-460)。
最近已经发现(WO 2004/057336)，NNMT可以用于评价CRC。在WO 2004/057336中描述的免疫测定，已经用于测量本研究的样品(CRC，健康对照和非恶性结肠病)。
如熟练的技术人员会明白的，存在许多使用两种或更多种标记的测量的方式，以改善在研究中的诊断问题。在一个非常简单的、但是仍然经常有效的方案中，如果样品对至少一种研究的标记是阳性的，则假定是阳性结果。这可以是例如当诊断感染性疾病(如AIDS)时的情况。
但是，经常地，评价标记的组合。优选地，数学地组合为标记组的标记(例如ASC、CYFRA21-1和NSE)测得的值，并将组合的值与潜在的诊断问题相关联。通过任何适当的现有技术水平数学方法，可以组合标记值。众所周知的将标记组合与疾病相关联的数学方法使用下述方法，如判别式分析(DA)(即线性的-、二次的-、规则化的-DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类符)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林(Random Forest)方法、Boosting/Bagging方法)、广义线性模型(即逻辑回归)、基于主组分的方法(即SIMCA)、广义累加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练的技术人员会无问题地选择适当的方法来评价本发明的标记组合。优选地，用于将本发明的标记组合与例如是否存在CRC相关联的方法选自DA(即线性的-、二次的-、规则化的判别式分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻分类符)、PLS(偏最小二乘法)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、Boosting方法)或广义线性模型(即逻辑回归)。关于这些统计学方法的细节，参见下面的文献Ruczinski，I.，等，J.of Computational and GraphicalStatistics，12(2003)475-511；Friedman，J.H.，J.of the AmericanStatistical Association 84(1989)165-175；Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，Friedman，Jerome，The Elements of Statistical Learning，Springer Series in Statistics，2001；Breiman，L.，Friedman，J.H.，Olshen，R.A.，Stone，C.J.(1984)Classification and regression trees，CaliforniaWadsworth；Breiman，L.，Random Forests，MachineLearning 45(2001)5-32；Pepe，M.S.，The Statistical Evaluation ofMedical Tests for Classification and Prediction，Oxford StatisticalScience Series，28(2003)；和Duda，R.O.，Hart，P.E.，Stork，D.G.，Pattern Classification，Wiley Interscience，2nd Edition(2001)。
本发明的一个优选的实施方案是，使用生物学标记的潜在组合的最优化的多变量截止值，并辨别状态A和状态B，例如病态和健康。在这类分析中，标记不再是独立的，而是形成标记组。可以确定，组合ASC、NSE和CYFRA 21-1的测量，确实与健康对照相比，或者，如也评价的，与健康对照加非恶性疾病对照相比，特别地提高CRC诊断准确度。特别地，后一发现非常重要，因为非恶性疾病患者可能要求与CRC患者完全不同的治疗。
测试的精确性最好由其接收器工作特性(ROC)说明(特别见Zweig，M.H.和Campbell，G.，Clin.Chem.39(1993)561-577)。ROC曲线图是在整个观察数据范围内连续变化决定阈值(decisionthresh-hold)产生的所有灵敏性/特异性对的图。
实验室检验的临床性能依赖于其诊断精确性、或将受试者正确分类为临床相关亚群的能力。诊断精确性测量了检验将研究的受试者的两种不同状况正确区分的能力。这类状况为例如健康和疾病或良性对恶性疾病。
在每个病例中，ROC图通过在决定阈值的全部范围将灵敏性对1-特异性作图，描述了两种分布之间的重叠。在y轴上是灵敏性或真阳性率[定义为(真阳性试验结果数)/(真阳性数+假阴性试验结果数)]。它也指疾病或状况存在的确定性。它从受影响的亚群单独计算。在x轴上是假阳性率或1-特异性[定义为(假阳性结果数)/(真阴性数+假阳性结果数)]。它是特异性的指标，并完全从未受影响的亚群计算。因为使用来自两个不同亚群的检验结果，完全独立地计算真和假阳性率，所以ROC图不依赖于样品中疾病的患病率。ROC图上的每点代表对应于特定决定阈值的灵敏性/1-特异性对。具有最佳辨别力的检验(在结果的两个分布中没有重叠)具有经过左上角的ROC图，在左上角，真阳性率为1.0，或者100％(理想的灵敏性)，且假阳性率为0(理想的特异性)。没有辨别力的检验的理论图(两组结果的同样分布)为从左下角至右上角的45°对角线。大多图介于这两个极端之间。(如果ROC图完全落在45°对角线之下，则容易通过将“确定性”标准从“高于”反转为“低于”来矫正这种情况，反之亦然。)从定性上，图越接近左上角，检验的总精确度就越高。
定量实验室检验诊断精确度的一个方便的目标是通过单独的数字表达其性能。最普通的全面测量是ROC图下的面积。按照惯例，该面积总是≥0.5(如果不是，则可以反转决定规则使其≥0.5)。值在1.0(两组检验值的理想分离)和0.5(在两组检验值之间没有明显的分布差异)之间变化。该面积不仅依赖于该图的特定部分，例如最接近对角线的点或在90％特异性的灵敏性，也依赖于全图。这是对ROC图有多么接近理想ROC图(面积＝1.0)的定量的说明性表达。
组合测量ASC和其它新近发现的标记(如CYFRA21-1或NMMT)或已知的标记(如CEA和NSE)或其它待发现的CRC标记，分别导致且将导致CRC评价的其它提高。
三种标记ASC、CYFRA21-1和NSE的组合，显著提高CRC的诊断准确度。
提供下列实施例、参考文献、序列表和附图以帮助对本发明的理解，其真实范围于附加的权利要求中提出。应当理解，可以在不偏离本发明精神的情况下，在提出的方法中进行修饰。


图1该图显示了以乳腺肿瘤样品上样的二维凝胶(左侧)，和以匹配的对照样品上样的凝胶(右侧)。这些凝胶放大部分中的圆形指示蛋白ASC的位置。在健康组织中，以同样的方法不能检测到该蛋白。ASC在二维凝胶中迁移，对应的等电点为约pH6，且表观分子量为约22kDa。
图2根据表1的对照患者的血清和血浆样品(见实施例4)中的ASC定量的分布。A疾病对照，n＝87；B健康对照，n＝317。图中的水平线指示着597pg/ml的截止值。
图3ASC的测量值的分布。关于对照患者的集合，截止值线对应着597pg/ml和90％的特异性(表1)。AUICC I，n＝33；BUICC II，n＝23；CUICC III，n＝21；DUICC IV，n＝23；E腺瘤，n＝27。
图4CEA的测量值的分布。关于对照患者的集合，截止值线对应着4ng/ml和90％的特异性(表1)。AUICC I，n＝33；BUICCII，n＝23；CUICC III，n＝21；DUICC IV，n＝23；E腺瘤，n＝28.
图5该图显示了ASC的ROC-曲线结肠直肠癌对健康对照(实线；ROC88％)，结肠直肠癌对健康对照和疾病对照(虚线；ROC83％)和结肠直肠癌对健康对照、疾病对照和其它癌症。x-轴指示着通过从1减去特异性值计算出的值。y-轴指示着灵敏性。在两种情况下，1的值对应100％。结肠直肠癌109样品。健康对照317样品。疾病对照87样品。其它癌症272样品。
图6该图显示了ASC、CYFRA21-1和NNMT的ROC-曲线结肠直肠癌对健康对照和疾病对照。ASC由实线指示，CYFRA21-1由点线指示，而NNMT由虚线指示。x-轴指示着通过从1减去特异性值计算出的值。y-轴指示着灵敏性。在两种情况下，1的值对应100％。结肠直肠癌109样品。健康对照317样品。疾病对照87样品。其它癌症272样品。
图7该图显示了ASC、CEA、CA19-9和NSE的ROC-曲线结肠直肠癌对健康对照和疾病对照。ASC由实线指示，CEA由点线指示，CA19-9由虚线指示，NSE由不规则的虚线指示。x-轴指示着通过从1减去特异性值计算出的值。y-轴指示着灵敏性。在两种情况下，1的值对应100％。结肠直肠癌109样品。健康对照317样品。疾病对照87样品。其它癌症272样品。
具体实施例方式
缩写ABTS2，2’-叠氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐BSA 牛血清清蛋白cDNA互补DNACHAPS (3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸盐)DMSO二甲亚砜
DTT 二硫苏糖醇EDTA 乙二胺四乙酸ELISA酶联免疫吸附测定HRP 辣根过氧化物酶IAA 碘乙酰胺IgG 免疫球蛋白GIEF 等电聚焦IPG 固定pH梯度LDS 十二烷基硫酸锂MALDI-TOF基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间质谱MES 基，2，4，6-三甲苯基OD 光密度PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳PBS 磷酸缓冲盐水PI 等电点RTS 快速翻译体系SDS 十二烷基硫酸钠实施例1鉴定作为可能的癌标记的ASC使用来自乳腺肿瘤患者的患病组织和正常组织的样品初步验证ASC后，检验其它癌症、且尤其是结肠直肠癌的标记(见下面的表6)。另外，分析了来自结肠直肠癌患者的血清和血浆样品。结果，对于这类癌症，数据显示了ASC作为生物化学标记的效用。
实施例2产生标记蛋白ASC的抗体产生癌症标记蛋白ASC的多克隆抗体，用于进一步通过免疫检测测定，例如蛋白印迹和ELISA，使用所述抗体测量ASC的血清和血浆和血液水平。
重组蛋白表达和纯化为了产生ASC抗体，进行该蛋白的重组表达以获得免疫原。使用RTS100表达系统和大肠杆菌(E.coli)的组合，进行表达。在第一步中，分析DNA序列，并使用“ProteoExpert RTS E.coli HY”系统获得高产量cDNA沉默突变变体推荐和各自的PCR引物序列。该系统是以网络为基础的商业服务(www.proteoexpert.com)。使用推荐的引物对，利用“RTS 100 E.coli Linear Template GenerationSet，His-tag”(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，Cat.No.3186237)系统，从cDNA产生线性PCR模板，以用于编码ASC蛋白的核苷酸序列的体外转录和表达。对于蛋白印迹检测和随后的纯化，表达的蛋白含有His-标记。鉴定最佳的表达变体。根据生产商的说明书执行从PCR到表达和检测的所有步骤。根据生产商的说明书，将各自的PCR产物克隆到pBAD TOPO载体(Invitrogen，Karlsruhe，德国，Cat.No.K 4300/01)中，所述PCR产物含有所有必需的T7调节区域(启动子、核糖体结合位点和T7终止子)。对于使用T7调节序列的表达，将构建体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中(Studier，F.W.等，Methods Enzymol.185(1990)60-89)，且分批培养转化的细菌以表达蛋白，每批1L。
按照标准程序，在Ni-螯合柱上进行His-ASC融合蛋白的纯化。简要地说，通过离心，将1 L含有His-ASC融合蛋白表达载体的细菌培养物沉淀。在裂解缓冲液中将细胞沉淀重悬，随后使用Ultra-Turrax匀浆，所述裂解缓冲液含有磷酸盐，pH8.0，7M氯化胍(guadinium chloride)，咪唑和硫甘油。通过高速离心使不溶材料沉淀，并将上清液应用于Ni螯合层析柱。使用几个床体积的裂解缓冲液洗涤柱子，随后使用含有磷酸盐，pH8.0和尿素的缓冲液洗涤。最后，在酸性条件下，使用含有SDS的磷酸盐缓冲液洗脱结合的抗原。
合成血蓝蛋白-肽-缀合物，以用于产生抗体使用异双功能化学(马来酰亚胺/SH-化学)进行合成。将选择的含有半胱氨酸的ASC-肽偶联到来自似鲍罗螺(Concholepasconcholepas)的3-马来酰亚胺基己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MHS)激活的血蓝蛋白(Sigma，B-8556)上。
在100mM NaH2PO4/NaOH，pH7.2中，制备10mg/ml的血蓝蛋白。每ml血蓝蛋白中加入100μl MHS(12.3mg，溶于DMSO中)，并温育1小时。对100mM NaH2PO4/NaOH，pH6.5透析样品过夜，并用透析缓冲液调至6mg/ml。将选择的含有半胱氨酸的ASC-肽溶于DMSO(对于1500道尔顿的肽，5mg/ml)。每ml MHS-激活的血蓝蛋白(6mg/ml)加入20μl 100mM EDTA，pH7.0和100μl选择的含有半胱氨酸的ASC-肽。1小时后，通过每ml反应混合物中加入10μl 0.5M半胱氨酸/HCl，封闭剩余的马来酰亚胺基团。该制剂不经进一步纯化，用于免疫接种。
重组融合蛋白表达和纯化为了产生ASC抗体，进行SlyD-ASC融合蛋白的重组表达以获得免疫原，这类似于Scholz，C.，等，J.Mol.Biol.345(2005)1229-1241所述的方法。因此，构建了含有编码SlyD-(GGGS)5-GGG-IEGR-ASC-GGGS-HHHHHH的基因的表达载体。为了纯化和蛋白印迹检测，该构建体含有羧基末端His-标记(HHHHHH)。在SlyD和ASC之间，插入额外的GS-接头((GGGS)5-GGG)和因子Xa的切割位点(IEGR)。在T5-启动子控制下的大肠杆菌中进行表达。
在第一步中，使用载体pSO60(携带编码SlyD-(GGGS)5-GGG-SlyD的表达盒的pET24)作为模板进行PCR。使用引物1(SEQID NO2)和引物2(SEQ ID NO3)，得到单SlyD，其分别携带在5’-末端的EcoRI-位点和核糖体结合位点、和在3’-末端的BamHI-位点、IEGR-编码序列和SacI-位点。将产生的PCR-产物作为EcoRI/SacI-片段克隆进pQE80L(Qiagen，Hilden)，从而得到pQE80-SlyD。
其次，从作为模板的pBC14(携带ASC的pET24)扩增ASC。使用引物3(SEQ ID NO4)和引物4(SEQ ID NO5)，插入在5’-末端的BamHI-位点和IEGR-编码序列、以及在3’-末端的GGGS-HHHHHH-编码序列和额外的HindIII-位点。
将该PCR-产物作为BamHI/HindIII片段克隆进pQE80-SlyD，从而得到最终的表达构建体(pQE80-SlyD-ASC)。根据生产商的说明书，进行所有PCR-和克隆-步骤。
为了在T5启动子控制下的表达，用最终构建体转化大肠杆菌C600细胞(Stratagene，Heidelberg)。以每批1升，培养表达菌株，以用于蛋白生产。
按照标准程序，在Ni-螯合柱上进行His-SlyD-ASC融合蛋白的纯化。简要地说，通过离心，将1L含有SlyD-ASC-His-融合蛋白的表达载体的细菌培养物沉淀。将细胞沉淀重悬在裂解缓冲液中，随后使用Ultra-Turrax匀浆，所述裂解缓冲液含有Tris/HCl，pH8，CHAPS，EDTA和溶菌酶。通过加入氯化镁和DNA酶，酶促降解DNA。通过离心，沉淀内含体。将沉淀溶于磷酸盐缓冲液，pH8.0，7M氯化胍，并装载于Ni-螯合柱上。用几个床体积的磷酸盐缓冲液，pH8.0，7M氯化胍，洗涤柱。然后，将磷酸盐缓冲液，pH8.0，7M氯化胍替换为磷酸盐缓冲液，pH8.0，NaCl，以诱导基质结合的蛋白的重新折叠。使用磷酸盐缓冲液，pH8.0，NaCl，咪唑，洗脱重新折叠的融合蛋白。
抗ASC单克隆抗体的生产a)小鼠的免疫接种使用100μg ASC、融合蛋白或血蓝蛋白-肽-缀合物(见上面)腹膜内初次免疫12周龄A/J小鼠。初次免疫六周后，继之以另外两次腹膜内免疫，这两次免疫间隔一个月。在此过程中，向每只小鼠施用吸附至氢氧化铝的100μg ASC或血蓝蛋白-肽-缀合物、以及109个百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)。随后，在融合前第三和第二天，每只小鼠使用100μg ASC或血蓝蛋白-肽-缀合物的PBS缓冲液溶液静脉内进行最后两次免疫。
b)融合和克隆将根据a)免疫的小鼠脾细胞与根据Galfre，G.和Milstein，C.，Methods in Enzymology 73(1981)3-46的骨髓瘤细胞融合。在此过程中，将约1×108个免疫的小鼠脾细胞与2×107个骨髓瘤细胞(P3X63-Ag8-653，ATCC CRL1580)混合并离心(10分钟，300×g，4℃)。以不含胎牛血清(FCS)的RPMI1640培养基将细胞洗涤一次，并在50ml锥形管中于400×g再次离心。弃上清液，轻敲以温和地松散细胞沉淀，经移液添加并混合1ml PEG(分子量4000，Merck，Darmstadt)。于37℃水浴1分钟后，于室温在4-5分钟时间段内逐滴添加5ml不含FCS的RPMI1640。然后在大约1分钟内逐滴添加5ml含有10％FCS的RPMI1640，充分混合，以培养基(RPMI 1640+10％FCS)填充至50ml，随后于4℃以400×g离心10分钟。将沉淀的细胞置于含10％FCS的RPMI1640培养基中，并接种于次黄嘌呤-重氮丝氨酸选择培养基(100mmol/l次黄嘌呤，1μg/ml重氮丝氨酸于RPMI 1640+10％FCS中)。白细胞介素6作为生长因子以100U/ml添加于培养基中。
约10天后，将原代培养物对特异性抗体进行检验。使用荧光激活细胞分选仪将ASC阳性原代培养物克隆到96孔细胞培养板中。在此过程中，白细胞介素6再次作为生长添加剂以100U/ml添加于培养基中。
c)从细胞培养物上清液中分离免疫球蛋白以每毫升1×105个细胞的密度，将获得的杂交瘤细胞接种到含有10％FCS的RPMI1640培养基中，并于发酵罐(Thermodux Co.，Wertheim/Main，Model MCS-104XL，Order No.144-050)中增殖7天。在培养物上清液中获得平均浓度为每毫升100μg的单克隆抗体。使用蛋白化学中的常规方法(例如根据Bruck，C.等，Methods inEnzymology 121(1986)587-695)，从培养物上清液中纯化该抗体。
多克隆抗体的产生a)免疫接种为了免疫接种，以1∶1比率制备蛋白溶液(100μg/ml ASC、融合蛋白或血蓝蛋白-肽-缀合物)和完全弗氏佐剂的新鲜乳剂。在1、7、14和30、60和90天，以1ml乳剂免疫各兔。抽出血液，并将所得的抗ASC血清用于实施例3和4中说明的进一步实验。
b)通过辛酸和硫酸铵的依次沉淀，从兔血清纯化IgG(免疫球蛋白G)以4体积乙酸盐缓冲液(60mM，pH4.0)稀释1体积兔血清。以2M Tris碱调节pH至4.5。在剧烈搅动下逐滴添加辛酸(25μl/ml稀释样品)。30分钟后，将样品离心(13000×g，30分钟，4℃)，弃沉淀，并收集上清液。通过添加2M Tris碱将上清液pH调节至7.5并过滤(0.2μm)。
通过在剧烈搅动下逐滴添加4M硫酸铵溶液至2M的终浓度，将上清液中的免疫球蛋白沉淀。通过离心收集沉淀的免疫球蛋白(8000×g，15分钟，4℃)。
弃上清液。以10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl溶解沉淀并彻底透析。将透析液离心(13000×g，15分钟，4℃)并过滤(0.2μm)。
多克隆兔IgG的生物素化在10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl中制备10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(3.6mg/ml溶于DMSO中)。于室温30分钟后，将样品在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上层析。收集含有生物素化IgG的级分。根据相同程序将单克隆抗体生物素化。
多克隆兔IgG的洋地黄毒苷化(digoxygenylation)在10mM NaH2PO4/NaOH，30mM NaCl，pH7.5中制备10mg/ml多克隆兔IgG。每毫升IgG溶液添加50μl洋地黄毒苷-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(Roche Diaghostics，Mannheim，德国，Cat.No.1333054)(3.8mg/ml溶于DMSO中)。于室温30分钟后，将样品在Superdex200(10mM NaH2PO4/NaOH，pH7.5，30mM NaCl)上层析。收集含有洋地黄毒苷化的IgG的级分。根据相同程序，将单克隆抗体以洋地黄毒苷标记.
实施例3检测人血清和血浆样品中ASC的蛋白印迹使用德国Invitrogen，Karlsruhe的试剂和设备，进行SDS-PAGE和蛋白印迹。在还原NuPAGE(Invitrogen)LDS样品缓冲液中1∶20稀释人血浆样品，并于95℃加热5分钟。在MES运行缓冲系统中的4-12％NuPAGE凝胶(Bis-Tris)上，运行10μl等分试样。使用Invitrogen XCell IITMBlot Module(Invitrogen)和NuPAGE转移缓冲系统，将凝胶分离的蛋白混合物印迹于硝化纤维素膜上。于PBS/0.05％Tween-20中将膜洗涤3次，并以SuperBlock封闭缓冲液(Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)封闭。在SuperBlock封闭缓冲液中稀释生物素化的第一抗体(0.01-0.2μg/ml)，并与膜温育1小时。在PBS/0.05％Tween-20中将膜洗涤3次。使用链霉抗生物素蛋白-HRP-缀合物(20mUABTS/ml，溶于SuperBlock封闭缓冲液中)，标记特异性结合的生物素化的第一抗体。温育1小时后，在PBS/0.05％Tween-20中将膜洗涤3次。使用化学发光的底物(SuperSignal West Femto Substrate，Pierce Biotechnology，Inc.，Rockford，IL，USA)和放射自显影胶片，检测结合的链霉抗生物素蛋白-HRP-缀合物。曝光时间从10分钟至过夜。
实施例4测量人血清和血浆样品中ASC的ELISA为了检测人血清或血浆中的ASC，开发了夹心法ELISA。为了捕获和检测抗原，分别使用生物素和洋地黄毒苷缀合等分试样的抗ASC多克隆抗体(见实施例2)。
将链霉抗生物素蛋白包被的96孔微孔滴定板与100μl生物素化的抗-ASC多克隆抗体温育60分钟，后者以10μg/ml溶于10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。温育后，以0.9％NaCl，0.1％Tween 20将板洗涤3次。然后，将孔与作为标准抗原的重组蛋白(见实施例2)的连续稀释液或稀释的患者液体样品温育2小时。ASC结合后，使用0.9％NaCl，0.1％Tween-20将板洗涤3次。为了结合的ASC的特异性检测，将孔与100μl洋地黄毒苷化的抗-ASC多克隆抗体温育60分钟，后者以10μg/ml溶于10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中。此后，将板洗涤3次以去除未结合的抗体。在下一步中，在10mM磷酸盐，pH7.4，1％BSA，0.9％NaCl和0.1％Tween-20中，将孔与20mU/ml抗-洋地黄毒苷-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国，目录号1633716)温育60分钟。随后使用相同缓冲液将板洗涤3次。为了检测抗原-抗体复合物，将孔与100μl ABTS溶液(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国，目录号11685767)温育，并于30-60分钟后使用ELISA读出器在405nm测量OD。
实施例5标记评价，灵敏性和特异性；ROC分析，以评价关于诊断准确度的临床效用通过分析从充分表征的患者群体得到的各液体样品，评价准确度。对照集合A(见表1)含有317位个体，其包含271位血液供体和46位已经经过结肠镜检查的患者。对照集合B包含87位患有非癌性疾病的患者。
109位结肠直肠癌患者(集合C)包含不同病期的肿瘤(表2，表4)。而且，在分析中包含27个癌前病期样品(集合D)。为了分析关于其它癌症的特异性，在样品群体中包含272位具有其它肿瘤的患者(集合E)。群体总结在表2中；表3提供了胃肠癌患者的细节。
通过ElecsysSystems免疫测定分析仪的可商业得到的测定(Roche Diagnostics，CA19-9-测定目录号11776193，CYFRA21-1测定目录号11820966，CEA-测定目录号1731629)，测量CA19-9、CYFRA21-1和CEA。使用实施例4的方法和WO2004/057336所述的抗体，测量NNMT。已经开发了自制夹心免疫测定，以用于ASC的测量。该测定以微量滴定板的形式进行。使用链霉抗生物素蛋白-包被的微量滴定板。在该夹心测定中，使用生物素化的ASC多克隆抗体作为捕获抗体，且使用洋地黄毒苷化的ASC多克隆抗体作为第二种特异性的结合配偶体。最后，通过抗-洋地黄毒苷辣根过氧化物酶缀合物和适当的过氧化物酶底物，显现形成的夹心复合物。
表1患者集合，对照

表2患者集合，癌症患者


表3患者集合，具有其它胃肠癌症的患者

表4结肠直肠癌-疾病的病期

图2总结了用对照(表1)血清和血浆样品得到的数据。该图表明，比健康对照更多的疾病对照样品表现出高ASC值。考虑该发现，将截止值定义为所有对照(即健康和疾病对照)的90％百分位。
特别地关于疾病对照，表5对比了标记ASC的特异性和NNMT、CA19-9、CEA和CYFRA21-1的特异性。关于ASC，每种其它标记的截止值定义为所有对照的90％百分位。
表5ASC和其它肿瘤标记在疾病对照(患者集合B)中的特异性

通过测试诊断出患有其它癌症的患者的血清和血浆样品，评价ASC的特异性。将特异性与使用的其它标记相对比。表6总结了结果。
表6ASC和其它肿瘤标记关于其它癌症(患者集合E)的特异性

为了评价ASC的灵敏性，分析诊断出患有不同病期的CRC的患者的血清和血浆样品。表7a/b和8总结了结果。在图3和图4中，分别显示了ASC和CEA的测量值的分布。
表7a关于结肠直肠癌的灵敏性

表7b关于癌前病期的灵敏性

根据Zweig，M.H.，和Campbell，同上，进行ROC分析。经曲线下面积(AUC)测量发现，ASC区分结肠直肠癌组和健康对照组中的患者的辨别能力(88％)，至少与测试的其它标记一样好或甚至更好。当比较结肠直肠癌集合和所有对照(包括疾病对照)时，ASC的辨别能力仍然至少等于(即使不胜过)标记CYFRA 21-1。另外，ASC的辨别能力显著胜过NNMT。结果参见表8和图5和6。
表8ROC分析

从显示的数据可以清楚看出，除了指示肿瘤以外，ASC在肠疾病对照中也升高。尽管对肠疾病对照的特异性更低，但结肠癌样品和对照(健康+疾病)之间的区分胜过常规的肿瘤标记CEA和CA19-9。
实施例6标记组如实施例5所显示的，对于作为结肠标记组的一个成员进行的评价，ASC是有前途的候选物，其与一种或多种其它标记相组合。为此，进行初步的多变量分析。
使用规则化的判别式分析(RDA)，它是普通判别式分析的一般化，即二次的-和线性的判别式分析(McLachlan，G.J.，DiscriminantAnalysis and Statistical Pattern Recognition，Wiley Series inprobability and mathematical statistics，1992)，生成分类算法。在RDA中，使用协方差矩阵的平常最大可能性(插入(plug-in))估计的替代方案。这些替代方案的特征在于2个参数(λ，γ)，它们的值根据单独的情况定制，其通过共同地使基于样品的将来错分类危险估计最小化来实现(Friedman，J.H.，Regularized DiscriminantAnalysis，J.of the American Statistical Association 84(1989)165-175)。作为一种替代方法，Support Vector Machines算法(Hastie，Trevor，Tibshirani，Robert，Friedman，Jerome，The Elements ofStatistical Learning，Springer Series in Statistics，2001)可以被拟合以得到可比较的分类结果。RDA分析是基于106份CRC样品和404份健康/疾病对照的。
从分类问题的最佳单一标记开始，并在90％特异性水平时的灵敏性增加不再有显著改变时结束，逐步构建标记组。为了得到集中的分布，用自然对数(log)函数转化每一种单一标记。
表9提供了通过对比CRC样品和健康/疾病对照样品得到的RDA数据，其中特异性设定在90％。应当指出，ASC在所有测试的肿瘤标记中具有最好的ROC曲线下面积。
表9单变量分析

表10和11显示了多变量分析的结果。令人惊讶地，对2、3、4和5种不同标记的最佳组合的搜索，导致下述观察，即包含CEA(以及CA19-9)的组合显得较次。在本样品集合的基础上发现的最佳组合包括CYFRA21-1、NSE和ASC。在表11中示例地解释了该结果，该表反映了包含CEA的不同组合的结果。
表10多变量分析(1)

表11多变量分析(2)；预选的标记ASC、NNMT、CEA

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序列表<110>Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG<120>ASC作为结肠直肠癌的标记的用途<130>23111<150>EP05008660.2<151>2005-04-20<150>EP04030619.3<151>2004-12-23<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>195<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>MISC_FEATURE<223>含有CARD的细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC)<400>1Met Gly Arg Ala Arg Asp Ala Ile Leu Asp Ala Leu Glu Asn Leu Thr1 5 10 15Ala Glu Glu Leu Lys Lys Phe Lys Leu Lys Leu Leu Ser Val Pro Leu20 25 30Arg Glu Gly Tyr Gly Arg Ile Pro Arg Gly Ala Leu Leu Ser Met Asp35 40 45Ala Leu Asp Leu Thr Asp Lys Leu Val Ser Phe Tyr Leu Glu Thr Tyr
50 55 60Gly Ala Glu Leu Thr Ala Asn Val Leu Arg Asp Met Gly Leu Gln Glu65 70 75 80Met Ala Gly Gln Leu Gln Ala Ala Thr His Gln Gly Ser Gly Ala Ala85 90 95Pro Ala Gly Ile Gln Ala Pro Pro Gln Ser Ala Ala Lys Pro Gly Leu100 105 110His Phe Ile Asp Gln His Arg Ala Ala Leu Ile Ala Arg Val Thr Asn115 120 125Val Glu Trp Leu Leu Asp Ala Leu Tyr Gly Lys Val Leu Thr Asp Glu130 135 140Gln Tyr Gln Ala Val Arg Ala Glu Pro Thr Asn Pro Ser Lys Met Arg145 150 155 160Lys Leu Phe Ser Phe Thr Pro Ala Trp Asn Trp Thr Cys Lys Asp Leu165 170 175Leu Leu Gln Ala Leu Arg Glu Ser Gln Ser Tyr Leu Val Glu Asp Leu180 185 190Glu Arg Ser19权利要求
1.体外评价结肠直肠癌的方法，其包含下述步骤a)测量样品中含有胱天蛋白酶相关募集结构域的细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的浓度，b)任选地测量样品中结肠直肠癌的一种或多种其它标记的浓度，和c)将在步骤(a)中测定的浓度和任选地在步骤(b)中测定的浓度与结肠直肠癌的诊断相关联。
2.根据权利要求1的方法，其进一步特征在于，所述样品选自血清、血浆和全血。
3.根据权利要求1和2中的任一项的方法，其进一步特征在于，所述一种或多种其它标记选自NSE、CYFRA 21-1、NNMT、CA19-9、CA72-4和CEA。
4.根据权利要求3的方法，其进一步特征在于，所述一种或多种其它标记是CYFRA21-1。
5.根据权利要求3的方法，其进一步特征在于，所述一种或多种其它标记是NSE。
6.作为标记分子的蛋白ASC在评价结肠直肠癌中的用途。
7.包含ASC和结肠直肠癌的一种或多种其它标记的标记组在评价结肠直肠癌中的用途。
8.根据权利要求7的标记组的用途，其中所述一种或多种其它标记选自NSE、CYFRA21-1、NNMT、CA19-9、CA72-4和CEA。
9.根据权利要求8的标记组的用途，所述标记组包含至少ASC、CYFRA21-1和NSE。
10.用于执行根据权利要求2的方法的试剂盒，其包含特异性地测量ASC和结肠直肠癌的一种或多种其它标记所需的试剂。
全文摘要
本发明涉及结肠直肠癌的诊断。它公开了蛋白ASC(含有胱天蛋白酶相关募集结构域的细胞凋亡相关斑点样蛋白)在结肠直肠癌的诊断中的用途。它还涉及通过测量样品中的ASC，从源自个体的液体样品诊断结肠直肠癌的方法。ASC的测量可以例如用于结肠直肠癌的早期检测或诊断。
文档编号G01N33/574GK101088012SQ200580044558
公开日2007年12月12日 申请日期2005年12月22日 优先权日2004年12月23日
发明者H·安德里斯, M·-L·哈格曼, J·卡尔, U·库纳特, G·佩斯特林 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司