专利名称：使用远心光学器件成像荧光信号的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA分析领域。尤其是，本发明涉及用于在多个位点(site)并行成像荧光强度的设备。
背景技术：
本领域的技术人员已知使用荧光技术来分析生物样本的各种应用。在电泳技术的情况下用荧光探针标记蛋白或DNA以在胶体中或在柱中显现它们的电泳谱带。另外，到目前为止多数生物芯片应用基于荧光读出，其中荧光标记靶分子对固定到固体载体上的探针分子的特异性结合被监视。液相中DNA分析的应用包括象双链DNA结合染料SybrGreenI这样的荧光杂交探针或利用两个荧光探针和能量转移的FRET(荧光共振能量转移)探针。液相中荧光技术的一个非常重要的应用是PCR产物的实时量化，也称为实时PCR。
在所有这些情况下，需要一种荧光读取设备来提供某个波长的光以激发化验物的荧光标记并且能够检测以稍微不同的波长发出的、形成所述标记的荧光。所有荧光读取设备的一个主要问题是激发光与染料发出的荧光相比的巨大强度，因此为了精确地监视荧光信号，人们必须保证激发光束不会击中检测器。也就是说，激发光的光程必须至少部分地不同于荧光的光程。
当必须在例如毛细管的液相中仅仅监视一个荧光探针时，荧光原理的实现很简单。在此，例如一个白光源连同一组分色镜和滤光器足以满足所述要求。然而，如果一个以上的荧光标记存在于样本中，则必须监视固体载体上斑点的横向分布或微量滴定板的荧光，因此荧光读取设备的要求更加难以满足。
原则上，存在两种不同的策略来激发和监视各位点的横向分布的荧光。第一种策略是扫描各位点的横向分布，由此相继地一次分析一个个体位点。第二种策略是同时照射各位点的整个分布并且例如在CCD芯片上成像相应的荧光。扫描策略具有的明显缺陷在于要么必须在二维中移动载体(WO 03/069391，DE 10200499)，要么检测器必须相对于载体移动(US 2002/159057)。另一方面，同时照射整个载体的策略的主要困难是保证对各位点的整个分布的均匀照射。各位点的整个分布的均匀照射的另一替代方案是使用光源阵列，由此每个位点被它自己的光源照射。DE 10131687描述了用于在带有多个井的热循环器中使用射束分裂器和用于照射的LED阵列来评价PCR的该策略。DE 10155142描述了荧光信号的暗场监视，其中微阵列也被LED阵列照射，但是在该实施例中不需要射束分裂器。
考虑到要求至少部分地分离激发光束的光程和荧光的光程，再次存在两种不同的可能性。第一种可能性被称为表面照射(epi-illumination)，由此射束分裂器被利用并且激发光束和荧光共享至少一部分光具组。第二种可能性是使用倾斜照射。在此，激发光束以一种方式被布置，使得它与载体表面的法线成某个角度并且激发光束的相应反射在检测系统的接受角之外(例如US 2002/0005493 A1，EP1275954A2)。
US 2003/0011772 A1描述了一种光学装置，该光学装置使用射束分裂器同时观察探针中的多个荧光染料。DE 19748211 A1公开了一种系统，该系统同时使用射束分裂器、场镜和将光聚焦到每个井中的透镜阵列来监视微量滴定板的井中所产生的荧光信号。通过将光成像在光电二极管阵列或CCD芯片上而执行所述检测。在该系统的该实施例中收集的荧光由聚焦透镜的光锥所激发的染料的数量指定，因此取决于所述井的充填水平。WO 99/60381提出了一种用于同时在温度循环块中多个管瓶中监视PCR反应的器械。该器械的光学部件再次包括射束分裂器，场镜，将单个光束聚焦到每个管瓶中的管瓶透镜阵列，和将发射光聚焦到例如CCD检测器上的检测机构。由于管瓶透镜阵列的必要性，个体位点的尺寸和横向密度被限制。JP 2002014044描述了一种荧光装置，该荧光装置用于监视在多个井中产生的荧光。所述光学部件包括射束分裂器和透镜系统以使用平行于所述井的深度方向的光集体地照射所述井。然而，所述图像形成光学系统将所述光聚集到检测机构。US 6,498,690 B1公开了一种使用包括远心透镜的物镜来成像化验物的方法。US 6,246,525 B1提供了一种用于成像样本载体的成像设备，该成像设备包括菲涅耳(Fresnel)透镜。
因此，本发明的目标是提供一种改进的设备，该设备通过朝着均匀照射和精确检测来优化光程而同时监视来自各位点的横向分布的荧光信号。在本发明的一个方面，待解决的问题涉及在监视微量滴定板形式的多路复用的实时PCR中的改进。
发明内容
因此，本发明涉及一种光学器械，该光学器械用于成像多个个体位点的组装(assembly)的荧光，其包括横穿整个所述组装区域的激发以及相应荧光信号的精确成像。
更准确而言，本发明涉及一种光学器械，该光学器械用于同时实时地分析发生在微量滴定板的井中的多个PCR扩增，或者成像微阵列的荧光强度作为特异性靶/探针相互作用的测度。
本发明的一个主题是一种用于成像来自多个个体位点的荧光信号的光学器械，其包括保持机构1，其用于保持带有多个个体位点3的组装的平面载体2，至少一个发光的光源4，其包括至少一个激发频率，换能器5，其被布置成接收来自所述多个个体位点3的组装的荧光信号，其中该换能器5产生可计算的原始数据，场镜6，其将来自所述光源4的激发光转移到所述多个个体位点3的组装和并且将来自所述多个个体位点3的组装的荧光信号转移到所述换能器5，激发透镜装置10，其将来自所述光源4的激发光转移到所述场镜6，和成像透镜装置11，其将来自所述场镜6的荧光信号转移到所述换能器5，其中所述激发光和来自多个个体位点的荧光信号的所述成像在所述场镜6的物体侧是远心的。
在本发明的上下文中，多个个体位点的组装概括了由两个或多个在空间上分离且横向分布的位点所组成的物体。位点例如可以是微量滴定板的井或载玻片的功能化表面区域。在多数情况下所述多个个体位点的组装将以一致的方式被布置并且为了执行多路复用的分析，每个位点将具有不同的内容。在本发明的范围内，所述组装的所述平面载体是平面固相。在微阵列的情况下，所述组装的所述平面载体是在所述位点被布置处的该平面固相的表面。在微量滴定板的情况下，所述组装的所述平面载体是在所述井的开口被布置处的平面。为了将每个个体位点的位置稳定在光程内的期望位置，所述组装的所述平面载体被保持机构固定。
在本发明的范围内短语光源(LS)包括发出单一频率或多个不同频率的光的发光体。附加地，所述光源可以是一个以上所述发光体的布置。
在本发明的上下文中，换能器(Det)是一种能够将可见光转换成可由诸如CCD芯片这样的计算机处理的电信号的设备。
在本发明的范围内，远心光学器件是具有非常小的孔径的光学器件，因此提供高聚焦深度。也就是说，因为在物体和/图像空间中横穿物体的所有点都平行于光轴，因此远心光学器件的远心光准平行于主光线。所以，利用物体空间中的远心性的激发光学器件或成像光学器件的品质对某个物点离所述光学器件的距离不敏感。远心光学器件的孔径在无穷远处被成像。另外，使用远心光保证了跨光束的良好的横向一致性，并且位于所述组装的中心的位点与位于所述组装的边界的位点相当。在整个本发明中，远心光学器件总是包括场镜。在本发明的上下文中场镜是最接近于物镜的单透镜，其确定了该器械的视场，所述场镜包括一个或多个部件(消色差透镜)，并且与所述装置的附加光学部件组合有助于物体和/或图像空间中的远心性。
本发明的所述场镜将来自所述光源的激发光转移到所述多个个体位点的组装并且将来自所述多个个体位点的组装的荧光信号转移到所述换能器。这并不排除附加光学部件被引入到例如在所述光源和所述场镜之间、在所述场镜和所述换能器之间或在所述场镜和所述多个个体位点的组装之间的射束径迹中。
本发明的另一个方面是一种实时PCR器械，其包括根据本发明的光学器械，和加热和冷却带有一个或多个井的载体的机构，每个井包含能够执行PCR反应的反应混合物。
在本发明的范围内，用于加热和冷却的所述机构包括为了执行核酸的循环PCR扩增而能够以循环方式控制和更改所述多个个体位点的组装的温度的任何机构。优选地，所述保持机构可以与所述多个个体位点的组装的所述平面载体热接触地被加热和冷却。
本发明的又一方面是一种用于成像多个化验物的荧光信号的系统，其包括平面载体2，其包括多个个体化验物的组装，
至少一个发光的光源4，其包括至少一个激发频率，换能器5，其被布置成接收来自所述多个化验物的荧光信号，其中该换能器产生可计算的原始数据，和从所述光源4到所述换能器5的射束径迹，其特征在于，所述多个个体化验物的组装的远心激发和在所述多个个体化验物的组装的每一个单个化验物处产生的所述荧光信号的远心成像。
多个个体化验物的组装概括了由两个或更多个在空间上分离以实现并行分析的化验物组成的物体。这些化验物例如可以在微量滴定板的井中或载玻片的功能化表面区域上被执行。
短语射束径迹在整个本发明中被使用以概括光束从所述光源至少通过所述场镜到达所述多个个体化验物的组装和从所述多个个体化验物的组装至少通过所述场镜到达所述换能器的途中所穿越的所有区域。
本发明的另一个主题是一种用于同时实时地执行和监视多个PCR反应的系统，其包括多井板，其带有多个个体位点，每个位点包含能够执行PCR反应的反应混合物，荧光DNA结合体，和根据本发明的实时PCR器械，其包括根据本发明的光学器械，该光学器械用远心光照射整个所述多井板，并且通过换能器检测来自所述多井板的每一个井的荧光信号，为了产生可计算的原始数据，所述换能器被布置成接收相应的荧光信号。
在整个本发明中，所述荧光DNA结合体都是本领域一些技术人员已知的荧光染料或荧光染料的组装，其可以用于检测扩增的DNA，即例如为双链DNA结合染料、TagMan探针、分子信标、单标记探针或FRET杂交探针。
本发明的又一主题是一种用于扩增、检测和/或量化多个靶DNA序列的方法，其包括提供一种能够执行PCR反应的组合物或反应混合物，使所述反应混合物受热循环方案支配，从而可以发生所述多个靶DNA序列的扩增，以及在多个扩增循环过程之后至少使用荧光DNA结合体和根据本发明的实时PCR器械监视每个DNA序列的存在和数量一次。
能够执行PCR反应的所述组合物或反应混合物在整个本发明中包括缓冲剂、核苷酸、酶、引物和荧光DNA结合体。
热循环方案是定义所述PCR组合物的序时温度处理、解链和退火温度、扩增循环的数量以及加热和冷却的时间的方案。
图1是根据本发明的光学器械的一个实施例的示意图。
图2是根据本发明的光学器械的另一个实施例的示意图。
具体实施例方式
本发明的一个方面是一种用于成像来自多个个体位点的荧光信号的光学器械，其包括保持机构1，其用于保持带有多个个体位点3的组装的平面载体2，至少一个发光的光源4，其包括至少一个激发频率，换能器5，其被布置成接收来自所述多个个体位点3的组装的荧光信号，其中该换能器5产生可计算的原始数据，场镜6，其将来自所述光源4的激发光转移到所述多个个体位点3的组装和并且将来自所述多个个体位点3的组装的荧光信号转移到所述换能器5，激发透镜装置10，其将来自所述光源4的激发光转移到所述场镜6，和成像透镜装置11，其将来自所述场镜6的荧光信号转移到所述换能器5。
其中所述激发光和来自多个个体位点的荧光信号的所述成像在所述场镜6的物体侧是远心的。
本领域的技术人员知道大量的器械能够用于成像荧光信号。如果所述光学器械应能够同时成像多个个体位点的组装的荧光信号，例如微量滴定板的井或微阵列的斑点，则人们必须保证在所述组装的中心以及在所述组装的边界处的染料的激发以及荧光信号的成像是相当的。而且，即使满足了跨所述光束的强度分布均匀的要求，为了保证所述载体作为一个整体是在所述成像光学器件和在所述激发光学器件的焦平面中，所述平面载体的对准仍很重要。当类似于微量滴定板的情况、所述载体具有深度时，另外产生了一些特殊问题。
解决上述问题的一个方案是使用远心光学器件。在一个远心光学器件中，焦平面位于无穷远并且从每个物点发出的主光线平行于光轴。因此，有限视场内的所有物点被观察到具有相同的透视和相同的强度，换句话说，所述远心光学器件具有大的场深度和均匀的激发或成像型面。
远心光学器件可以由其数值孔径(NA)表征，该数值孔径应当尽可能地小以实现高的聚焦深度NA＝n·sin A，其中n是介质的折射率，A是孔径角。如果类似于微量滴定板的情况，个体位点的组装具有某个深度，那么高的聚焦深度是极其重要的。
为了设计一种用于各位点的横向分布的远心激发和来自所述位点的荧光信号的远心成像的光学器械，人们必须考虑几个方面。单独从聚焦深度的方面来看，NA值应当尽可能地小。另一方面，用于成像光学器件的小NA值对应于低劣的成像分辨率，而用于激发光学器件的小NA值对应于用于激发的照射功率的浪费。
如果所述远心光学器械应当可用于整个频率范围，那么所述光学器件必须也是消色差的。对于荧光成像自身，由于荧光成像必须具有合适的缩放比例以在所述换能器上正确地再生各位点的横向分布，因此甚至必须应付更多的要求。另外，类似球面像差或色差、彗差、散光或像场弯曲这样的像差必须被控制。
存在创建远心光学器件的几种方式。通常，远心光学器件是多元件透镜设计，其中一个以上的透镜被连续地布置在射束径迹中。远心光学器件可以被准备成在物体平面中是远心的或者在图像平面中是远心的，或者同时在这两个平面中是远心的，一个所谓的双远心光学器件。而且，有可能用远心光照射物体和/或以远心方式监视物体。通常提供一种在物体平面中具有远心性的光学器件就足够了，因为这已经保证了整个物体在横向以及在第三维中的均匀照射和从所述物体辐射的光的精确收集。
从现有技术水平来看，已知器械使用用于成像荧光信号的远心光学器件，但是通常例如通过背面照射、倾斜照射或通过渐逝场而以非远心方式执行激发。在整个本发明中，多个个体位点的激发以及来自多个个体位点的荧光信号的成像都是以远心方式执行的。
图1和图2显示了根据本发明的优选实施例的两个光学器械的示意图，其将在下面进行详细说明。
所有远心光学器件的中心部分是场镜。该透镜最接近于物体并且确定该器械的视场的直径。所以，当多个个体位点的组装在一个大面积上分布时，该透镜的直径倾向于尺寸增大。场镜以单件式(一个单透镜)或例如包括粘在一起的两个透镜的消色差透镜的形态存在。可以用于本发明的特殊场镜是菲涅耳透镜。菲涅耳透镜具有特殊的复数曲率，在至少一个光学有效表面上具有多个锥形区域，其提供了与场镜相同的远心属性。在多数情况下，菲涅耳透镜仅仅具有一个带有多个锥形区域的表面，所述表面被垂直于光轴的平面表面支撑，因此与正常的场镜相比它们更薄。在特殊情况下，菲涅耳透镜被提供为附加地具有弯曲支承表面或者在所述透镜的两侧上具有多个锥形区域。另外，菲涅耳透镜有时由塑料制造，因此它们比玻璃制造的大场镜更便宜。但是另一方面，尤其考虑对比度和串扰时，这些菲涅耳透镜的图像质量低于正常的场镜，这是因为在带有不连续曲率的透镜的那些点处发生光散射。
在一个优选的实施例中，根据本发明的光学器械进一步包括对于至少一个激发频率是透明的而对于所述荧光信号的频率是反射的射束分裂器7，或者包括对于至少一个激发频率是反射的而对于所述荧光信号的频率是透明的射束分裂器。
射束分裂器通常是分色镜，其取决于光的波长而通过或反射所述光，因此它可以被用于将光束的两个成分在空间上分离成不同的方向。如果必须带有某些旋光涂层，则这样的分色镜可以由玻璃或塑料制造。它们以薄箔或棱镜的形式存在。
为了应用于光学器械中以成像荧光信号，该分色镜必须对于激发光是反射的而对于荧光是透明的(图2)或者相反(图1)。从所述光源发出的光分离成包含一个或多个激发频率的光束和带有具有它频率的光束有助于保证荧光染料不会被短波长破坏并且例如由所述载体的激发而产生的不期望背景辐射被减小。来自所述多个个体位点的光分离成包含至少一个激发频率的成分和包含荧光信号的成分避免了带有高强度的激发光的反射击中所述换能器。这极大地提高了信噪比。
在本发明的另一个优选的变型中，所述场镜产生垂直于所述多个个体位点的组装的载体的激发光束。
激发光束垂直于所述多个个体位点的组装的载体也产生了垂直于所述组装的载体的反射光束。但是由于所述射束分裂器，该反射光束与荧光信号分离并且不会击中所述换能器。在例如多滴定板作为所述多个个体位点的组装的情况下，所述垂直激发光束具有的优点是它能够穿透所述井的深度。另一方面，如果激发光束以大于0°的入射角到达所述载体，那么所述井的壁将隐藏所述井内部的全部照射并且仅仅一部分荧光染料可以被激发。而且，当使用倾斜的激发光束时，所述井内荧光染料激发的量取决于充填水平。
在进一步优选的变型中，根据本发明的光学器械进一步包括激发滤光系统8，该系统能够将来自所述光源的至少一个激发频率转移到所述多个个体位点的组装，同时阻止多个其它频率。
这样的附加激发滤光系统甚至可以在射束分裂器之前阻止来自光源的某些频率。如果所述光源包括其频率不能通过所述射束分裂器与所述激发频率分离的光，那么这是必要的。一种合适的激发滤光系统例如被称为滤光轮，其包括一定数量的、具有不同光学性质的单个滤光器。使用这样的滤光轮提供了一种简单的手段来改变激发频率。特殊的激发滤光系统例如是吸收红外(IR)频率或紫外(UV)光的滤光器。这样的特殊激发滤光系统可以以诸如薄膜滤光器这样的分离的光学部件的形式实现或者以所述装置的其它光学部件上的旋光涂层的形式实现。
在进一步优选的实施例中，根据本发明的光学器械进一步包括成像滤光系统9，该系统能够将来自所述多个个体位点的组装的荧光信号转移到所述换能器，而同时阻止具有激发频率的光。
这样的附加成像滤光系统还可以在射束分裂器之后阻止在所述多个个体位点产生的或者来自所述激发反射的某些频率。如果在所述多个个体位点产生其频率不能通过所述射束分裂器来与所述激发频率分离的光，那么这是必要的。再次，一种合适的成像滤光系统是一个包含不同滤光器的滤光轮。与激发滤光系统的情况类似，特殊的成像滤光系统可例如是红外(IR)滤光器或紫外(UV)滤光器。该特殊成像滤光系统可以以诸如薄膜滤光器这样的分离的光学部件的形式实现或者以所述装置的其它光学部件上的旋光涂层的形式实现。另一种成像滤光系统是避免检测器检测到散射光的滤光系统。
如上所述，根据本发明的光学器械包括激发透镜装置10，所述激发透镜装置将来自所述光源4的光转移到所述场镜6。
这意味着，使用包括场镜6和激发透镜装置10的激发光学器件，来自所述光源的光被成像在所述多个个体位点的组装上。所述激发光学器件在场镜6的物体侧提供远心激发光，因此是远心激发光学器件。所述激发透镜装置包括至少一个透镜，优选地至少有三个透镜，以便朝着更好地利用光源功率而增加激发的孔径。如果透镜的数量应当被减小，则所述激发透镜装置可以包括非球面。优选地，为了独立于激发波长而实现跨所述多个个体位点的组装的均匀强度分布，所述远心激发光学器件被设计成是消色差的。
在本发明的另一个实施例中，所述光源发出包括多个频率的光，优选地所述光源是白光源，最优选地所述光源是气体放电灯，例如氙灯或汞灯，或者诸如钨丝灯这样的白炽灯。
在本发明的又一个实施例中，所述光源发出带有单一频率的光，优选地所述光源是激光器，最优选地所述光源是LED。
使用发出具有不同频率的光的光源所具有的优点在于仅仅通过改变滤光组，所述光源可以用于不同的荧光染料，所述滤光组由射束分裂器组成，且如果需要，也包括激发滤光系统和/或成像滤光系统。为了容易地从一个荧光染料切换到另一个，优选地使用滤光轮作为包含一定量的滤光器的激发滤光系统和/或成像滤光系统。在另一方面，如果所述光源发出仅仅具有单一频率的光，该滤光器组的要求容易满足，但是所述光学器械被固定到有限量的荧光染料。
在本发明的一个实施例中，光源窗具有旋光涂层，该旋光涂层用作特殊的激发滤光系统以吸收IR和/或UV光。
在本发明的进一步优选的变型中，所述光源包括一个以上的发光体的组合，优选地一个以上的激光器的组合，最优选地一个以上的LED的组合。
在该优选的实施例中，为了提供带有一个以上的激发频率的根据本发明的光学器械，不同发光体的组装被使用。带有两个不同光源的根据本发明的一个实施例在图2中示出，其中每个光源具有其自己的激发滤光系统8、激发透镜装置10和射束分裂器7。
在根据本发明的另一变型中，所述光源进一步包括用于选择一个或多个所述发光体的设备。
用于选择所述发光体中的一个的设备可以以不同的方式实现。一种可能性是使用可转动镜使被选择的发光体的光注入到所述光程中。另一种可能性是为了将被选择的发光体的光注入到所述光程中而移动所述发光体的布置。
除了场镜6、激发滤光系统8、激发透镜装置10和射束分裂器7外，根据本发明的远心激发光学器件还可以包括几个附加的部件。在一个实施例中所述远心激发光学器件附加地包括光导，并且为了将来自所述光源的光转移到所述光学系统的光学部件，来自所述光源的光被耦合到所述光导。使用光导便可能耦合来自不同光源的光并且同时将该组合的光转移到所述光学部件。所有类型的光导可应用于本发明的目的。可能的光导例如为流体光导、纤维光导或纤维光导束。在本发明的一个实施例中，所述光导的一端或两端具有用作特殊激发滤光系统以吸收IR和/或UV光的旋光涂层。
在根据本发明的又一实施例中，所述远心激发光学器件进一步包括混光器以混合来自于所述光源的光并且将所述混光器的被照射表面成像到所述多个个体位点的组装上。
混光器是带有非常均匀地照射的表面的设备，其可以被用作光源以提供在整个横截面上具有均匀强度分布的光。混光器是由光学透明材料制造的稍长的实体，其中所述实体的边界平行于所述光程。也就是说，混光器是一种光纤。被注入所述混光器的光在所述光学透明材料的内表面上经历多次全反射，所述内表面在所述光纤的一端产生非常均匀地被照射的横截面积。所述光学透明材料的内界面的全反射简单地基于在所述界面处折射率的改变或者可由折射涂层支持。所述混光器的长度对其横截面积的比率对于照射均匀性来说是重要的。所述比率优选地大于2。
来自所述光源的光，尤其来自所述混光器的一端的横截面积的光通过使用包括场镜6和激发透镜装置10的远心激发光学器件而被成像在所述多个个体位点的组装上。所以，在本发明的该实施例中，用激发光学器件执行所述多个个体位点的激发，所述激发光学器件在所述场镜6的物体位点是远心的。
根据本发明的光学器械也适于化学发光和生物发光的成像。由于在这些情况下不需要激发光，因此可以省略光源4、激发透镜装置10和激发滤光系统8。
在进一步优选的变型中，根据本发明的光学器械进一步包括光束折叠单元，所述单元包含一个、两个或更多的折叠式反射镜，所述折叠单元折叠来自所述光源的光和来自所述多个个体位点的组装的荧光信号。
在本发明的范围内光束折叠单元是提供一个长光程、而同时仅仅需要有限量空间的单元。为了从所述激发光学器件调整所述数值孔径，可以修改的一个参数是光必须经过的光程。扩大该光程会减小所述数值孔径。所以，如果期望小孔径满足场深度要求和均匀强度分布，则所述光程将较长。由于大型器械不符合条件，所述折叠式反射镜可以用于实现一个长的光程并且同时限制器械尺寸。
如之前所述，根据本发明的光学器械包括成像透镜装置11，所述成像透镜装置11将来自所述场镜6的光转移到所述换能器5。
这意味着在所述多个个体位点的组装处产生的荧光信号被包括场镜6和成像透镜装置11的远心成像光学器件成像在换能器5上。在本发明的其它实施例中，所述远心成像光学器件例如进一步包括光束折叠单元和/或特殊成像滤光系统9。
所述远心成像光学器件必须在所述换能器的尺寸和所述多个个体位点的组装的空间尺寸上进行优化。与激发透镜装置11的情况一样，成像透镜装置11包括至少一个透镜，优选地为至少5个透镜的组装。所述成像透镜装置需要大量的透镜，因为与所述激发光学器件相比，成像光学器件必须应付甚至更高的要求。所述荧光成像必须具有合适的缩放比例以便在所述换能器上正确再生各位点的横向分布。另外，类似球面像差或色差、彗差、散光、像场的特殊错误或弯曲这样的像差必须被控制。由于荧光信号成像到所述换能器上，因此用一种成像光学器件执行所述荧光成像，所述成像光学器件仅仅在场镜6的物体位点是远心的。
在根据本发明的光学器械的进一步的优选变型中，所述成像透镜装置11耦合到所述换能器5以形成成像单元12。
注意在本发明的该优选实施例中，所述远心成像光学器件不同于标准物镜，其中所有透镜以限定方式被布置和固定以形成物镜并且所述物镜作为整体放置在所述换能器和所述物体之间。恰恰相反的是，在本发明的该优选的实施例中，所述成像透镜装置11耦合到所述换能器5，从而形成成像单元12。为了满足关于成像分辨率和精度的要求，成像透镜装置和换能器的定位尤其重要。在该实施例中，在优化位置被固定之前通过优化所述成像透镜装置和所述换能器之间的位置而满足这些要求。所述成像透镜装置和所述换能器之间的所述耦合在整个预定的使用中被保持并且仅仅当所述定位的重新优化成为必要时被释放。
在根据本发明的光学器械的实施例中，所述换能器包括半导体器件或优选地电荷耦合器件。
在本发明的上下文中，换能器是能够将光转换成可由计算机处理的电信号的一种设备。这可以由半导体设备实现，该半导体设备所具有的带隙小于与待检测的荧光信号对应的能量。通过所述设备的照射在所述半导体的传导带中产生的电子产生可测量的信号，该信号可以被转化成可计算的数据。这些半导体设备的例子是光电二极管或电荷耦合器件(CCD)。
根据本发明的光学器械的进一步优选的变型是一种光学器械，其中所述组装的个体位点是井，所述激发光平行于所述井的侧壁并且充填所述井的溶液包括荧光染料。
所述光学器械的进一步优选变型的例子是用于同时监视发生在微量滴定板的单个井中的PCR(聚合酶链式反应)扩增的设备。为了独立于所述井内的充填高度而照射所述井的整个内部，激发光平行于所述井的侧壁。由于用于激发以及用于荧光成像的远心光学器件被使用，所以从所述板的中心的井得到的结果与从所述板的边界处的井得到的结果相当。
在单个井中执行PCR扩增的情况下，所有荧光体可作为特异性地结合到双链核酸的荧光染料而被应用。在本发明的上下文中，这些荧光染料被称为荧光DNA结合体，其中如果它们结合到双链DNA，则所述荧光DNA结合体是提供特征荧光的分子或一对分子。在实时PCR监视的领域中以下的检测形式是公知的DNA结合染料形式(例如SybrGreenI)、TaqMan探针、分子信标、单标记探针(SLP)形式或FRET杂交探针。
根据本发明的光学器械的又一优选实施例是一种光学器械，其中所述组装的所述个体位点是平面载体上的斑点并且荧光染料附着到所述斑点。
光学器械的该优选实施例的例子是用于同时成像来自平面阵列的不同斑点的荧光信号的设备。在一个特定实施例中这样的阵列是DNA阵列，其中横向限制区域被具有不同序列的DNA探针功能化。在该情况下，如果例如互补DNA链被荧光染料标记，则根据本发明的光学器械可以监视与包含核酸的样本的杂交事件。作为样本中DNA分子的标记的替代，也可以通过双链核酸结合荧光染料来显现杂交事件。
本发明也涉及实时PCR器械，其包括
根据本发明的光学器械，和加热和冷却具有一个或多个井的载体的机构，每个井包含能够执行PCR反应的反应混合物。
在本发明的范围内，用于加热和冷却的所述机构包括为了执行核酸的循环PCR扩增而能够以循环方式控制和改变所述多个个体位点的组装的温度的任何机构。每个PCR循环包括几个不同的步骤降低温度的退火步骤，在相对低温的酶扩增步骤连同使用荧光染料的检测步骤和在高温的解链步骤。
本发明进一步涉及一种用于成像多个化验物的荧光信号的系统，其包括平面载体2，其包括多个个体化验物的组装，至少一个发光的光源4，其包括至少一个激发频率，换能器5，其被布置成接收来自所述多个化验物的荧光信号，其中该换能器产生可计算的原始数据，和从所述光源4到所述换能器5的射束径迹，其特征在于，所述多个个体化验物的组装的远心激发和在所述多个个体化验物的组装的每一个单个化验物处产生的所述荧光信号的远心成像。
多个个体化验物的组装概括了由两个或更多在空间上分离以实现并行分析的化验物组成的物体。这些化验物例如可以在微量滴定板的井中或载玻片的功能化表面区域上被执行。在多数情况下所述多个个体化验物的组装将以一致的方式被布置并且为了执行多路复用的分析，每个化验物将具有不同的内容。在DNA微阵列的情况下，所述阵列的每个斑点用具有某个序列的寡聚物进行功能化，其中在免疫测定的情况下所述阵列的每个斑点例如用具有不同亲合力的蛋白进行功能化。在微量滴定板的情况下在每个井中例如执行不同的PCR。
在根据本发明的用于成像多个化验物的荧光信号的系统的一个优选实施例中，所述系统进一步包括场镜，其中所述射束径迹两次通过所述场镜。
在根据本发明的用于成像多个化验物的荧光信号的系统的另一个优选实施例中，所述系统进一步包括成像透镜装置11，其中所述成像透镜装置11耦合到所述换能器5以形成成像单元12。
在根据本发明的用于成像多个化验物的荧光信号的系统的又一个优选实施例中，所述系统进一步包括对于至少一个激发频率是透明的而对于所述荧光信号的频率是反射的射束分裂器7，或者包括对于至少一个激发频率是反射的而对于所述荧光信号的频率是透明的射束分裂器7。
根据本发明的用于成像多个化验物的荧光信号的系统的又一个优选实施例进一步包括激发滤光系统和/或成像滤光系统，所述激发滤光系统能够将来自所述光源的至少一个激发频率转移到所述多个个体位点的组装并且同时阻止多个其它频率，所述成像滤光系统能够将来自所述多个个体位点的组装的荧光信号转移到所述换能器并且同时阻止具有激发频率的光。
本发明的另一个方面涉及一种用于同时实时地执行和监视多个PCR反应的系统，其包括多井板，其带有多个个体位点，每个位点包含能够执行PCR反应的反应混合物，荧光DNA结合体，和实时PCR器械，其包括根据本发明的光学器械，该光学器械用远心光照射整个所述多井板，并且通过换能器检测来自所述多井板的每一个井的荧光信号，所述换能器被布置成接收相应的荧光信号，以便产生可计算的原始数据。
通常，存在用于实时检测扩增的DNA的荧光DNA结合体的两种形式，其中以下是本领域中公知和常用的a)DNA结合染料形式由于双链扩增产物的数量通常超过原始存在于待分析的样本中的核酸的数量，因此可以使用双链DNA特异性染料，仅仅当它们结合到双链DNA时，在用合适波长进行激发后其表现出增强的荧光性。优选地，仅仅可以使用那些类似于SybrGreen I这样的不影响PCR反应效率的染料。
现有技术中已知的所有其他方式要求设计一个荧光标记的杂交探针，其仅在结合到它的靶核酸后发出荧光。
b)TaqMan探针单链杂交探针用两个成分标记。当用合适波长的光激发第一成分时，根据荧光共振能量转移的原理，吸收的能量被转移到被称为淬火剂的第二成分。在PCR反应的退火步骤期间，所述杂交探针结合到靶DNA并且在随后的延长期被Taq聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性降解。结果受激荧光成分和淬火剂在空间上彼此分离，因此可以测量第一成分的荧光发射(US 5,538,848)。
c)分子信标这些杂交探针也用第一成分和淬火剂标记，所述标记优选地位于所述探针的两端。作为所述探针的二级结构的结果，两种成分在溶液中在空间接近。当杂交到靶核酸之后两种成分彼此分离，从而在用合适波长的光激发之后，可以测量第一成分的荧光发射(US 5,118,801)。
d)单标记探针(SLP)形式该检测形式由用单个荧光染料在5’-或3’-端标记的单个寡核苷酸构成(WO 02/14555)。两个不同的设计可以用于寡标记G-淬火探针和硝基吲哚去淬火探针。
在G-淬火探针实施例中，荧光染料在寡5’-或3’-端连接到C。如果两个G’s位于与C相反的靶链上并且处于互补寡核苷酸探针旁侧的位置1，则当探针被杂化到靶时，荧光显著减弱。
在硝基吲哚去淬火探针实施例中，荧光染料在寡核苷酸的5’-或3’-端连接到硝基吲哚。硝基吲哚在某种程度上减小了自由探针的荧光信令。当所述探针被杂交到靶DNA时荧光由于去淬火作用而增加。
e)FRET杂交探针FRET杂交探针测试形式尤其有用于所有类型的同质杂交化验(Matthews，J.A.，和Kricka，L.J.，Anal.Biochem.《分析生物化学》169(1988)1-25页)。其特征在于一对两个单链杂交探针，它们同时被使用并且与扩增的靶核酸的相同链的相邻位点互补。两个探针都用不同荧光成分标记。当用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移的原理，第一成分将吸收的能量转移到第二成分，使得当两个杂交探针结合到待检测的靶分子的相邻位置时，可以测量第二成分的荧光发射。
当退火到靶序列时，所述杂交探针的位置必须以头接尾的布置，彼此非常接近。通常，第一探针的被标记3’-端和第二探针的被标记5’-端之间的间隙尽可能地小，即1-5碱基。这允许FRET供体化合物和FRET受体化合物紧密接近，其典型地为10-100埃。
替代监视FRET受体成分的荧光增加，也可能作为杂交事件的定量测量而监视FRET供体成分的荧光减小。
尤其是，为了检测扩增的靶DNA，FRET杂交探针形式可以用于实时PCR。在实时PCR领域的所有已知检测形式中，FRET杂交探针形式已被证明是高灵敏度、精确且可靠的(WO 97/46707；WO 97/46712；WO97/46714)。然而，合适的FRET杂交探针序列的设计有时候可受到待检测的靶核酸序列的特殊特征限制。
作为利用两种FRET杂交探针的另一选择，也可能使用荧光标记的引物和仅仅一个被标记的寡核苷酸探针(Bernard，P.S.等，Anal.Biochem.《分析生物化学》255(1998)101-107页)。在这一点上，它可以任意选择，而无论所述引物是否用FRET供体或FRET受体化合物标记。
本发明进一步涉及一种用于扩增、检测和/或量化多个靶DNA序列的方法，其包括提供一能够执行PCR反应的组合物或反应混合物，使所述反应混合物受热循环方案支配，从而可以发生所述多个靶DNA序列的扩增，以及在多个扩增循环之后至少使用荧光DNA结合体和根据本发明的实时PCR器械监视每个DNA序列的存在和数量一次。
在下面提供例子、参考文献和附图以帮助理解本发明，本发明的实际范围在后附的权利要求中阐述。应当理解可以在所述的过程中进行修改而不脱离本发明的精神。
例子在具体描述中说明以及在图2(仅仅带有一个光源)中示出的一种光学器械按如下被配置。所述远心激发光学器件被调整以处理450-650nm的频率并且所述远心成像光学器件处理500-740nm的频率。所述光源是氙灯，且作为换能器，使用了有1024×1344像素的冷却式2/3”CCD芯片。所述光学器械被设计成成像83mm×117mm的面积，从而可以使用带有96个井(距离9mm；直径5mm)和384个井(距离4.5mm；直径3mm)的微量滴定板(MTP)。对于某些荧光染料，用于激发和成像的合适波长由滤光轮调整。
所述远心激发光学器件在所述光源的侧面上具有0.35的数值孔径，在所述MTP的侧面上具有0.014的数值孔径。所述光源被布置成垂直于所述CCD芯片并且所述激发光束必须通过一射束分裂器而朝向所述MTP，该射束分裂器对必要的激发频率是反射的而对包含在来自所述光源的光中的其它频率是透明的。来自所述射束分裂器的激发光束垂直于所述MTP并且跨所述物场(88mm×122mm)具有10％以下的强度变化。所述成像光学器件在物体侧也具有0.014的孔径，和对800mm物像距离具有-0.075的再生比例。使用两个折叠式反射镜实现了该大距离。所述成像光学器件具有+/-3mm的场深度。由于激发，所使用的射束分裂器对于在所述MTP井中产生的荧光信号是透明的。
参考文献列表Bernard，P.S.等的Anal.Biochem.《分析生物化学》255(1998)101-107页DE 10131687DE 10155142DE 10200499DE 19748211 A1EP 1275954 A2JP 2002014044Matthews，J.A.和Kricka，L.J.的Anal.Biochem.《分析生物化学》169(1988)1-25页US 2002/0005493 A1US 2002/159057US 2003/0011772 A1US 5,118,801US 5,538,848US 6,246,525 B1US 6,498,690 B1WO 02/14555WO 03/069391WO 97/46707WO 97/46712WO 97/46714WO 99/6038权利要求
1.一种用于成像来自多个个体位点的荧光信号的光学器械，其包括保持机构(1)，其用于保持带有多个个体位点(3)的组装的平面载体(2)；至少一个发光的光源(4)，其包括至少一个激发频率；换能器(5)，其被布置成接收来自所述多个个体位点(3)的组装的荧光信号，其中该换能器(5)产生可计算的原始数据；场镜(6)，其将来自所述光源(4)的激发光转移到所述多个个体位点(3)的组装和并且将来自所述多个个体位点(3)的组装的荧光信号转移到所述换能器(5)；激发透镜装置(10)，其将来自所述光源(4)的激发光转移到所述场镜(6)；成像透镜装置(11)，其将来自所述场镜(6)的荧光信号转移到所述换能器(5)，其中所述激发光和来自多个个体位点的荧光信号的所述成像在所述场镜(6)的物体侧是远心的。
2.根据权利要求1所述的光学器械，进一步包括对于至少一个激发频率是透明的而对于所述荧光信号的频率是反射的射束分裂器(7)，或者包括对于至少一个激发频率是反射的而对于所述荧光信号的频率是透明的射束分裂器。
3.根据权利要求1-2所述的光学器械，其中所述成像透镜装置(11)耦合到所述换能器(5)以形成成像单元(12)。
4.根据权利要求1-3所述的光学器械，其中所述组装的所述个体位点是井，所述激发光平行于所述井的侧壁，并且充填所述井的溶液包括荧光染料。
5.根据权利要求1-3所述的光学器械，其中所述组装的所述个体位点是平面载体上的斑点并且荧光染料附着到所述斑点。
6.一种实时PCR器械，其包括根据权利要求1-5的光学器械；加热和冷却带有一个或多个井的载体的机构，每个井包含能够执行PCR反应的反应混合物。
7.一种用于成像多个化验物的荧光信号的系统，其包括平面载体(2)，其包括多个个体化验物的组装；至少一个发光的光源(4)，其包括至少一个激发频率；换能器(5)，其被布置成接收来自所述多个化验物的荧光信号，其中该换能器产生可计算的原始数据；从所述光源(4)到所述换能器(5)的射束径迹，其特征在于所述多个个体化验物的组装的远心激发和在所述多个个体化验物的组装的每一个单个化验物处产生的所述荧光信号的远心成像。
8.根据权利要求7所述的系统，进一步包括成像透镜装置(11)，其中所述成像透镜装置(11)耦合到所述换能器(5)以形成成像单元(12)。
9.根据权利要求7-8所述的系统，进一步包括场镜，其中所述射束径迹两次通过所述场镜。
10.根据权利要求7-9所述的系统，进一步包括对于至少一个激发频率是透明的而对于所述荧光信号的频率是反射的射束分裂器(7)，或者包括对于至少一个激发频率是反射的而对于所述荧光信号的频率是透明的射束分裂器(7)。
11.一种用于同时实时地执行和监视多个PCR反应的系统，其包括多井板，其带有多个个体位点，每个位点包含能够执行PCR反应的反应混合物；荧光DNA结合体；根据权利要求6的实时PCR器械，其包括根据权利要求1-5的光学器械，该光学器械用远心光照射整个多井板，并且通过一换能器检测来自所述多井板的每一个井的荧光信号，所述换能器被布置成接收相应的荧光信号，以便产生可计算的原始数据。
12.一种用于扩增、检测和/或量化多个靶DNA序列的方法，其包括提供一能够执行PCR反应的组合物或反应混合物；使所述反应混合物受热循环方案支配，从而可以发生所述多个靶DNA序列的扩增；在多个扩增循环之后至少使用荧光DNA结合体和根据权利要求6的实时PCR器械监视每个DNA序列的存在和数量一次。
全文摘要
本发明涉及DNA分析领域，尤其是，本发明针对用于在多个位点并行成像荧光强度作为DNA杂交的测度的设备。更特别地，本发明针对一种用于成像多路复用实时PCR或读出DNA微阵列的设备。
文档编号G01N21/64GK1808204SQ20061000505
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月17日 优先权日2005年1月18日
发明者M·古特昆斯特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司