专利名称：一种检测微囊藻毒素mc－lr的酶联免疫试剂盒及其检测方法
技术领域：
一种检测微囊藻毒素MC-LR的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，用于自然环境中水体、饮用水和藻类制品中微囊藻毒素(简称MC-LR)含量的检测。
背景技术：
藻毒素(Microcystins，简称MCYST或MC)已成为环境水体中被普遍关注的污染物之一，中国科学院《2002年科学发展报告》中专门论述了淡水中“水华”造成的最大危害是饮用水源受到威胁。藻毒素通过食物链影响人类的健康，蓝藻“水华”的次生代谢产物MC能损害肝脏，具有促癌效应，直接威胁人类的健康和生存。100多年来，藻毒素引起的人畜中毒事件引起了世界范围内的关注，加拿大，英国，美国，澳大利亚，南非等国都有报道。我国环境白皮书公布的《环境问题的现状资料》中资料十达赉湖“祸水”揭秘，指出近30年来达赉湖地区的人畜中毒死亡事件都是“微囊藻毒素”引起的。国内外许多文献都报道了藻毒素与原发性肝癌的相关性。
由于目前缺乏防止藻类“水华”发生的有效措施，因此要预防和消除藻毒素对人畜的危害，监测和控制藻毒素在饮用水中的限量是行之有效的方法。国家《生活饮用水水质卫生规范》中规定MC-LR的限值为0.001mg/L，而要保证饮用水中藻毒素的限值，建立快速，灵敏的藻毒素分析方法至关重要。
藻毒素是一种七肽，为单环结构，1位是D-丙氨酸，2，4位是可变的左旋氨基酸基团，6位是γ连接的D-氨基酸，3位是特殊的氨基酸β连接的D-红细胞-β-甲基天门冬氨酸(MeAsp)，5位是(2S，3S，8S，9S)-3-氨基-9-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯基-4，6-二烯酸(Adda)，7位是N-甲基脱氢丙氨酸(Mdha)，整个结构可写作(-D-Ala-L-D-MeAsp-L-Z-Adda-D-Glu-Mdha-)。不同种类的MC的化学组成主要区别在于2，4位的2种左旋氨基酸的不同和MeAsp、Mdha基团的甲基化或去甲基化。2，4位氨基酸也是不同亚型的藻毒素的命名依据，最常见的是MC-LR，其中L代表亮氨酸、R代表精氨酸，因此，分析方法的研究也主要针对MC-LR来建立的。
目前，国内外检测MC-LR的方法有以下几类。(一)化学分析法包括薄层色谱法(TLC)，液相色谱法(LC)，液-质联用法(HPLC-MS)，毛细管电泳法(CE)以及示差脉冲极谱法。(二)生物法包括生物鉴定法、微毒素检测法和蛋白磷酸(PP1/PP2)抑制法。(三)免疫化学法，包括放射免疫法(RIA)，间接竞争酶联免疫法(idc-ELISA)，直接竞争酶联免疫法(dc-ELISA)，夹心免疫法(Sandwich-ELISA)。在国内应用较广泛的是高效液相色谱法，最低检测浓度为0.01μg/mL。酶联免疫分析法(ELISA)，由于其特异性强，灵敏度高，操作简便，不需直接接触毒素，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。尽管如此，国内在MC-LR的ELISA方法到试剂盒的转化中技术不成熟，检测的灵敏度和试剂的稳定性还无法达到要求，致使无法实际应用，所以目前为止没有一个国产的MC-LR的ELISA试剂盒面市。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测微囊藻毒素MC-LR的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，用于自然环境中水体、饮用水和藻类制品中微囊藻毒素(MC-LR)含量的检测。
本发明的技术方案该检测MC-LR的试剂盒是由1、96或48孔或24孔包被板，2、微囊藻毒素MC-LR标准品，3、微囊藻毒素MC-LR的抗体冻干品，4、酶标记的羊抗兔抗体冻干品，5、洗涤液，6、显色液A，7、显色液B和8、终止液所组成。
包被板包被固相抗原，用50mmol/L pH9.6Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将微囊藻毒素-牛血清白蛋白(MC-LR-BSA)稀释至10mg/L做为包被液，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加200μl含3g/L BSA的上述Na2CO3-NaHCO3缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
微囊藻毒素标准品从MC-LR纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，共6瓶，MC-LR浓度分别为0ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml。
本发明主要采用酶联免疫分析法(ELISA)来检测MC-LR。采用ELISA的技术主要有两个方面特异性多克隆抗体的制备，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，MC-LR的ELISA试剂盒的制备。
微囊藻毒素的抗体冻干品，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合1mg微囊藻毒素-匙孔血蓝蛋白，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μl制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，可进行鉴定，血清合格后稀释、分装、冻干备用。
测定方法为测定的基础是标记免疫反应。取包被有MC-BSA的微孔包被板，加入MC-LR标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入MC-LR抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加终止液，在450nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的MC-LR含量。
其操作为取包被有MC-BSA的微孔包被板，加入50μl的MC-LR标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl抗MC-LR抗体，37℃孵育1小时，洗涤液洗三次，加100μl辣根过氧化物酶(HRP)-羊抗兔抗体，37℃孵育1小时，用洗涤液洗六次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的MC-LR含量。
本发明的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.25ng/ml。
图1检测微囊藻毒素的试剂盒示意图。1、96或48或24孔包被板，2、微囊藻毒素标准品，3、微囊藻毒素的抗体冻干品，4、酶标记的羊抗兔抗体冻干品，5、洗涤液，6、显色液A，7、显色液B，8、终止液。
图2微囊藻毒素MC-LR标准曲线图具体实施方式
实施例1制备试剂盒和检测水样MC-LR是典型的半抗原，故在免疫反应中具有反应原性，但需与大分子物质结合后才有免疫原性，MC-LR中的羧基为活性基团，可与蛋白质的氨基结合。因此可用碳二亚胺法，使MC-LR与大分子蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)结合，以合成的MC-LR-KLH作为人工合成的免疫抗原进行动物免疫。
MC-LR-KLH抗原的制备1、用1ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解1-2mg MC-LR；2、用1ml的0.13mol/L NaHCO3偶联缓冲液溶解1-2mg KLH载体蛋白；3、取0.4-0.8mg MC-LR的溶液加到KLH的溶液中；4、溶解2-4mg碳二亚胺(EDC)于1mL双蒸水，并取50-100μL加入到上述混合液中，室温作用2小时(避光)；5、离心后取上清液上柱(Sephadex G-25)分离，进行紫外扫描检测。
多克隆微囊藻毒素抗体冻干品的制备1.选取4周大的，体重约1.5Kg的健康新西兰大白兔。MC-LR是一种半抗原，将MC-LR和KLH相连接作为抗原。
2.油包水抗原乳化剂的制备用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合2mgMC-LR-KLH，用匀浆器混合2小时。将制好的乳化剂滴入盛有冷水的烧杯中，以油滴状态能完整地停留在水面上，而不扩散，表明是稳定的。
3.免疫兔子及抽血先将兔子背部的毛小心剪去，然后取600μL制备好的油包水抗原乳化剂，多位点地进行皮下注射，使抗原能缓慢扩散，每隔1～2周免疫一次，共需六次，在免疫3～4次后，从兔子的耳缘静脉抽血约1ml，离心10min后，得血清可进行鉴定。合格后稀释至适当浓度，按需分装，冻干备用，即为抗MC-LR抗体冻干品。
包被板固相抗原制备将MC-LR-BSA用50mmol/L Na2CO3-NaHCO3pH9.6缓冲液稀释至10mg/L的包被液，96(或48或24)孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，加200μl含1g/L卵清蛋白(OVA)的上述Na2CO3-NaHCO3缓冲液封闭，4℃放置过夜。弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
试剂的配制(1)标准微囊藻毒素(MC-LR)(0ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml，)，从MC-LR纯品中稀释得到，稀释液为去离子水。
(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体冻干品(HRP-羊抗兔抗体)市售，珠海百奥生物科技有限公司生产。
(3)洗涤液14.5mmol/L NaCl、0.2ml/L Tween-80和0.2％NaN3的50mmol/L磷酸盐缓冲液pH7.4。
(4)显色液A的配制0.2MNa2HPO425.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，50ml30％H2O2。
(5)显色液B的配制称取5mg四甲基联苯二胺(TMB)加入2.5ml无水乙醇中，可加热至37℃～40℃直到TMB完全溶解。
(6)终止液2mol/L的H2SO4以48孔测试盒为例，每一个盒中的试剂足够进行48个测量，盒中的材料如下(1)1×48孔板(4条×12孔，可以拆分为单孔)包被有MC-LR-BSA。
(2)6×MC-LR标准液，1.0ml/瓶，标准液浓度为0，0.25，0.5，1，2，4ng/ml。
(3)1×MC-LR抗体冻干品，用时3ml去离子水溶解。
(4)1×HRP-羊抗兔抗体冻干品，用时8ml去离子水溶解。
(5)1×洗涤液20ml，用时以去离子水1∶15稀释。
(6)1×显色液A4.5ml。
(7)1×显色液B4.5ml。
(8)1×终止液4.5ml实验室应自备的试剂蒸馏水或去离子水。
测定之前注意事项1.使用之前将所有试剂回升至室温(18-30℃)。
2.使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3.如果样品量大建议使用多通道移液器。
4.在所有恒温孵育过程中，避免光线照射。
5.取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-8℃。
具体检测步骤如下先将样品进行处理将太湖水样1000g高速离心20min，取上清为待测样液。，取MC-LR-BSA板条，加入50μl的MC-LR标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加MC-LR抗体50μl，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，37℃孵育1小时，洗涤液洗三次，加HRP-羊抗兔抗体100μl，37℃孵育1小时，用洗涤液洗三次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测量吸光度，从标准曲线计算样品中的MC-LR含量。见表1，该例的样品中MC-LR的含量为0.31ng/ml。
表1
实施例2，试剂盒提供的试剂与实施例1相同，用于检测藻制品。
具体检测步骤如下先将藻制品进行处理将藻制品样品粉碎至20目，取5克样品放在试管中，加入25ml 0.01mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液。加塞振荡3分钟，过滤，滤纸采用新华1号纸。取1ml滤液用9ml蒸馏水或去离子水进行稀释，备用。
取MC-LR-BSA板条，加入50μl的MC-LR标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸头，加MC-LR抗体50μl，移液器管尖千万不要接触到放进孔中的液体，37℃孵育1小时，洗涤液洗三次，加HRP-羊抗兔抗体100μl，37℃孵育1小时，用洗涤液洗三次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测量吸光度，从标准曲线计算样品中的MC-LR含量。见表2，该例的样品中MC-LR的含量为190ng/g。
表2
权利要求
1.一种检测微囊藻毒素MC-LR的酶联免疫分析试剂盒，其特征是由96或48或24孔包被板(1)，微囊藻毒素标准品(2)，抗微囊藻毒素的抗体冻干品(3)，酶标记的羊抗兔抗体冻干品(4)，洗涤液(5)，显色液A(6)，显色液B(7)和终止液(8)所组成；所述的酶标记的羊抗兔抗体冻干品为辣根过氧化物酶-羊抗兔抗体冻干品，洗涤液为含有吐温和NaN3的磷酸盐缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，终止液为硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na2CO3-NaHCO3的缓冲液将微囊藻毒素-牛血清白蛋白稀释至10mg/L做为包被液，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加200μl含3g/L牛血清白蛋白的上述Na2CO3-NaHCO3缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，吹干，板条密封后置-20℃冷冻保存。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的微囊藻毒素标准品(2)，从MC-LR纯品中稀释得到，稀释液为去离子水，共6瓶，MC-LR浓度分别为0ng/ml，0.25ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2ng/ml，4ng/ml。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中的微囊藻毒素的抗体冻干品(3)，用弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂1.2ml混合1mg微囊藻毒素-匙孔血蓝蛋白，用匀浆器混合2小时，制得油包水抗原乳化剂，取600μl制备好的油包水抗原乳化剂，在新西兰大白兔身上多位点地进行皮下注射，在免疫3～4次后，可进行鉴定，血清合格后稀释、分装、冻干备用。
5.一种用权利要求1所述的试剂盒检测微囊藻毒素的方法，其特征是取包被有微囊藻毒素-牛血清白蛋白的微孔包被板，加入MC-LR标准品或处理好的样品到各自的微孔中，再加入MC-LR抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加终止液，在450nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的MC-LR含量。
6.根据权利要求5所述的检测微囊藻毒素的方法，其操作为取包被有微囊藻毒素-牛血清白蛋白的微孔包被板，加入50μl的MC-LR标准品或处理好的样品到各自的微孔中，加50μl抗MC-LR抗体，37℃孵育1小时，洗涤液洗三次，加100μl辣根过氧化物酶-羊抗兔抗体，37℃孵育1小时，用洗涤液洗六次，加50μl显色液A和50μl显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的MC-LR含量。
7.根据权利要求6所述的检测微囊藻毒素的方法，其中的样品水样处理10000g高速离心30min，取上清液为待测样品；或者用0.22um超滤膜过滤，滤液为待测样液。
全文摘要
一种检测微囊藻毒素MC－LR的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，属于酶联免疫分析(ELISA)技术领域，用于对水体、饮用水和藻类制品中微囊藻毒素(MC－LR)含量的检测。本试剂盒测定的基础是标记免疫反应，微孔板包被有MC－LR－BSA，加入MC－LR标准或样品，再加入MC－LR抗体。游离的MC－LR与微孔板上的MC－LR－BSA竞争MC－LR抗体，没有连接的MC－LR抗体被洗涤除去，加入HRP－羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的HRP－羊抗兔抗体被洗涤除去。加显色液、终止液后，用酶标仪测定其吸光度，吸光度的值与样品中的MC－LR浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中MC－LR的含量。本试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，可以达到0.25ng/ml。
文档编号G01N21/25GK1932519SQ20061004145
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月5日 优先权日2006年9月5日
发明者赵晓联, 孙蔚榕, 陆茂林, 赵春城, 龚燕, 蔡建荣, 张东升, 蔡正森, 时瑾, 沈雯琰 申请人:江苏省微生物研究所有限责任公司