专利名称：磺胺－5－甲氧嘧啶含量的酶联免疫检测方法
技术领域：
本发明涉及食品中兽药残留安全检测技术领域，特别是用于筛选、定量检测市场上奶、肉、蛋等动物类食品中残留SMD定性和定量。
背景技术：
磺胺类药物被广泛用于兽医临床，用以治疗和预防某些疾病，但由于不合理的使用，易引起在动物源性食品中的残留。食用含有磺胺类药物残留的食品会引起一系列不良的后果，如过敏、诱发癌症和损害脑神经等。目前测定奶、肉、蛋等动物类食品中磺胺-5-甲氧嘧啶(即SMD)方法有以下几种1、微生物检测法SMD对特定微生物抵制作用，可定性或半定量检测残留SMD。
2、光谱法紫外分光光度法，红外分光光度法，荧光光度法。
3、色谱法薄层层析法(TLC)，气相色谱法(GC)，高效液相色谱法(HPLC)，质谱法(MS)。
尤其是HPLC常作为法定检测方法，但因样品前处理繁琐、耗时、昂贵，还需有高效液相色谱仪，不适用于基层，不能作样品筛选用。
发明内容
本发明目的在于发明一种能高效、灵敏度高的、方便操作的磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法。
本发明方法是1)采用戊二醛法把磺胺-5-甲氧嘧啶连接到牛血清白蛋白或卵清白蛋白形成全抗原；2)采用细胞融合法制备筛选含有稳定分泌磺胺-5-甲氧嘧啶抗体的杂交瘤细胞株；小鼠腹水诱生法制备含有磺胺-5-甲氧嘧啶抗体的小鼠腹水；3)提取待测样品组织；
4)先将全抗原包被酶标板，再向酶标板加入上述小鼠腹水和待测样品组织，最后加入底物显色液，显色后，与标准曲线对比，计算出所测样品中磺胺-5-甲氧嘧啶含量。
本发明用免疫方法把半抗原SMD变为全抗原，制备特异性抗体，由于酶的催化效率高，可极大地放大反应效果，从而使测定方法达很高的敏感度，使该法特异性强，灵敏度高，适合大批样品的筛选。其中的酶标板包被SMD-BSA抗原后，用小牛血清封闭，封存后于4℃条件下可长期保存，该方法市场前景好，尤其是我国已实行食品安全法后，其应用前景较好。
为了提高显色的稳定性，本发明底物显色液为由3，3’，5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢尿素组成的混合液。
其中，底物显色液由浓度为0.2～0.5mg/ml的5，5-四甲基联苯胺和浓度为0.165～0.35mg/ml的过氧化氢尿素组成；3，3’，5，5-四甲基联苯胺的最佳浓度为0.2～0.21mg/ml，过氧化氢尿素的最佳浓度为0.165～0.175mg/ml。
本发明所述待测样品的提取方法是将待测动物源性食品，用乙腈水溶液提取组织，再用乙酸乙脂水溶液再提取，取有机层，吹干，再用碱性液溶解沉渣，并加入正己烷振荡，离心，进一步脱脂，用盐酸调节pH7.2±0.2，稀释。待测样品的这种前处理方法适应了快速、简便的检测需要。
用正己烷排除脂溶性物质的干扰，所述稀释倍数为5至20倍。
本发明所述含有稳定分泌磺胺-5-甲氧嘧啶抗体的小鼠腹水的制备步骤是先制备杂交瘤细胞，并筛选出特异性强、分泌抗体稳定的细胞株；然后将细胞株注入BALB/C小鼠腹腔，制备腹水。
图1为合成抗原SMD-BSA的UV吸收光谱图。
图2为注入杂交瘤细胞的小鼠与正常小鼠的腹腔对照图。
图3为BSA-SMD偶联物Western印迹图。
图4为间接竞争ELISA法制备的标准曲线图。
图5为间接竞争ELISA法制备的标准曲线图。
图6为空白样本标准曲线图。
具体实施例方式
一、全抗原的合成与鉴定
(1)抗原的合成称取112mg的磺胺-5-甲氧嘧啶(SMD)与204mg的牛血清白蛋白(BSA)或者129mg的卵清蛋白(OVA)，溶于25.5ml、pH7.2的PB(磷酸钠盐缓冲液)和二氧六环的混和液中(比例为2∶1)，于磁力搅拌器上搅拌，滴加0.15ml，25％戊二醛，在室温下，搅拌3h，装入透析袋，于4℃下，用PB(PH7.0)透析6d，每天换二次液，分装冻存。
(2)合成抗原的鉴定在200到400nm的波长下分别对SMD、载体蛋白以及二者的偶联物用紫外分光光度计进行扫描，来判定SMD是否与载体蛋白偶联。
SMD在253、244以及202.8nm处有吸收峰，BSA在214和278nm处有吸收峰，偶联物在207.8、259.4、265nm处形成吸收峰，可见偶联后吸收峰发生了漂移，可判定偶联成功。结果见图1，图中，I为SMD-BSA偶联物的扫描曲线；II为BSA的扫描曲线；III为SMD的扫描曲线。纵坐标为OD值，横坐标为扫描的波长(nm)。
二、单克隆抗体的制备(1)实验动物7周龄的BALB/c小鼠。
(2)免疫程序首免，50μg抗原溶于100μl PBS，与100μl完全福氏佐剂混匀，皮下注射。其后，每隔2周，用25μg抗原溶于100μl PBS，与100μl不完全福氏佐剂混匀，皮下注射，作4次增强免疫后，隔2周进行抗原冲击，25μg抗原溶于200μl PBS，腹腔注射，3d后，取脾细胞。
(3)细胞准备①骨髓瘤细胞的准备及脾淋巴细胞的准备骨髓瘤细胞的准备取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0-Ag14(7～8个25ml培养瓶)，用弯头滴管将细胞轻轻吹下，收集于50ml离心管，1700r/min离心5min，弃去上清，同法用不完全培养基离心洗涤一次，将细胞重新悬浮于10ml不完全培养基。
脾淋巴细胞的准备A.取已经免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清，同时通过颈脱位致死小鼠。
B.浸泡于75％酒精中5min，于解剖台上固定后，移入超净台。
C.掀开左侧腹部皮肤，无菌手术取出脾脏，置于已盛有10ml不完全培养基的平皿中，洗涤并剥去周围组织。
D.将脾脏移入另一盛有10ml不完全培养基的平皿中，用装在1ml注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基中制成单细胞悬液。
E.收获脾细胞悬液，1700r/min离心5～10min，用不完全培养基离心洗涤1次。
②饲养细胞的制备按上述采小鼠脾细胞的方法致死小鼠、体表消毒和固定后，掀开皮肤后，用注射器注射10ml不完全培养基到腹腔，轻轻按摩腹部，随后吸出注入的培养液。离心，弃上清。用5ml HAT培养基将细胞悬浮。
③细胞融合A.将上述的脾细胞与骨髓瘤细胞混合于一支50ml的带盖离心管中，补加不完全培养基至30ml，充分混匀。
B.1700r/min离心5min，将上清尽量吸净。
C.在手掌上轻击管底，使沉淀细胞松散均匀；置40℃水浴中预热。
D.用吸管在45s左右加预热至40℃的50％PEG 1ml，边加边轻轻晃动。
E.用吸管在90s内加25ml预热至37℃的不完全培养基；37℃静置10min。(要遵照先慢后快的原则)F.1700r/min离心5min；弃去上清。
G.加入5ml HAT培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，补加含腹腔巨噬细胞的HAT培养基至80ml。
H.分装96孔细胞培养板，每孔两到三滴；然后将培养板置37℃，6％CO2培养箱内培养。
I.5d后用HAT培养基换出一半培养基。
J.9d后用HT培养基换出HAT培养基。
K.经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。
④确定包被抗原的工作浓度以及阳性血清效价(方阵实验)包被抗原(SMD-OVA)作系列稀释，每一行为一个稀释度，70μl/孔，37℃作用2h，洗板3次，加入200μl含1‰OVA的PBS封闭，37℃ 2h，洗板3次；血清作系列稀释，每一列为一个稀释度，70μl/孔，37℃作用1.5h，洗板5次，加入1∶800稀释的羊抗鼠的酶标二抗，80μl/孔，37℃作用1.5h，洗板5次，加入底物OPD，70μl/孔，37℃避光显色20min，用2mol/L的硫酸终止反应。在酶联免疫检测仪上读取OD值。
结果见表1表1方阵实验结果
由上表可知，包被原的工作浓度为1∶4050，血清效价为1∶16200。
⑤阳性孔的筛选间接ELISA联合竞争ELISA筛选阳性孔将每一孔杂交瘤细胞的培养上清分为等量的二份，一份加80μl洗液，另一份加80μl高浓度SMD，分别做ELISA，其他步骤同④。
阳性孔的判定上一孔显色很明显，OD值高，且下一孔显色不明显或不显色，OD值明显比上一孔低，(即二孔颜色差异大)则判定为阳性孔；两孔显色都明显或都不显色者(即二孔颜色差异小)，则判为阴性。
⑥阳性孔的亚克隆将96孔板上的阳性孔杂交瘤细胞吹下，作系列稀释(10倍或20倍，可根据细胞的多少来决定)，分装到另一块96孔板上，37℃，6％CO2培养，观察，标记有单个细胞的孔。培养10d左右，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体。取阳性孔继续亚克隆。亚克隆三次。
经过三次亚克隆，筛选出三枚稳定分泌针对SMD抗体的杂交瘤细胞。分别命名为3E8、4A7、2D2。其中以3E8分泌抗体效价最高，将一部分细胞做腹水，其余冻存在液氮中。
⑦腹水的制备取7周龄的BALB/c小鼠，用降植烷注入小鼠腹腔，0.4ml/只，9d后腹腔接种用无血清培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.2ml。间隔5d后，每天观察小鼠腹水产生情况，用16号针头采集腹水，将腹水离心，取上清，测定效价，分装，-70℃冻存备用。
如图2所示，为注入杂交瘤细胞的小鼠。其肠系膜以及腹腔布满红色的形状不一的肿瘤团块。中间为正常小鼠；两边为注入杂交瘤细胞的小鼠，腹腔长满肿瘤。
⑧Western印迹法检验单克隆抗体用BSA和SMD-BSA偶联物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。胶的浓度为10％。再将其转移到硝酸纤维素滤膜。用脱脂奶粉封闭，用1∶100小鼠的腹水作为一抗。加入酶标二抗经充分洗绦后，加入3，3’-二氨基联苯胺进行显色。
左侧的条带是标准蛋白，右边二条显色的是BSA-SMD偶联物，右侧还有二条没有作色的条带是BSA，由此可知，产生的抗体可以与BSA-SMD偶联物反应，对载体蛋白不起反应。
结果见图3，染色的地方为BSA-SMD偶联物，右方有二处为BSA，没有着色。分子量Marker用考马斯亮蓝染。
⑨抗体特异性的鉴定用系列稀释的磺胺喹噁啉、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺氯吡嗪钠、磺胺甲噁唑、磺胺、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶，做竞争ELISA。用BSA-SMD包被，用含牛血清白蛋白的PBS封闭，在加入腹水的同时加入竞争药物，其它步骤同④。结果见表2交叉反应性＝产生50％抑制时SMD的浓度/产生50％抑制时的其它药物的浓度。
表2与其它8种磺胺药的交叉性
由表2可知，三株细胞产生的抗体对几种磺胺药物基本无交叉性。
⑩标准曲线的制备用标准系列浓度的磺胺对甲氧嘧啶，0、1、5、10、50、100、300、500、1000ng/ml做竞争ELISA，具体步骤同⑨。
标准曲线及相关参数的计算表3、表4为制备标准曲线的一些数据，包括间接竞争ELISA的结果，以及计算的一些相关参数，图4为作出的标准曲线(用Microsoft Excel软件处理)。
表3竞争ELISA的结果
表4相关参数
按下式计算抑制率，以抑制率为纵坐标，以药物浓度的对数作为横坐标，作图，结果如图4。
抑制率＝OD加入SMD/OD未加入SMD标准差(SD)＝[∑(X-Xi)2/(n-1)]1/2；标准偏差(RSD)＝SD/B检测下限(LOD)为(B-3SD)相对应的值，经计算为1.766ng/ml；定量限(LOQ)为(B-10SD)相对应的值，经计算为11.274ng/ml。
三、SMD单克隆抗体3E8细胞株(于2002年7月制备冻存)的稳定性实验(1)复苏冻存的3E8细胞株将水浴恒温振荡器的温度调至37℃，从液氮中取出抗SMD单抗3E8细胞株的冻存小管，立即投入37℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解，要在1-2min内完成复温。将细胞悬液移入培养瓶内，加入培养液置37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中培养。4h后，细胞换液。弃去培养瓶内的培养液，加入新的培养液进行培养。
经复苏冻存的3E8细胞株，得到系列细胞组，其中，以H5细胞组产生的抗体性能最好，故命名为3E8-H5。
(2)单抗细胞株传代当培养瓶壁铺满细胞时，用吸管将细胞从壁上吹下，制成细胞悬液，弃去一半的细胞悬液，余下的补足培养液继续培养。将细胞传代十几代后，扩增细胞。
一部分冻存，一部分进行细胞亚克隆，做成抗SMD腹水。
(3)阳性细胞亚克隆用直接ELISA检测细胞培养上清液，检测结果呈阳性，将3E8细胞亚克隆。将细胞培养瓶中的阳性杂交瘤细胞吹下，在24孔细胞培养板上作系列稀释，有限稀释法亚克隆阳性细胞，分装到一块已经加上饲养细胞的96孔板上，37℃，5％CO2培养，观察，三天后标记有单个细胞的孔。培养10d左右，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体。
(4)腹水的制备取8周的杂交小鼠，用降植烷注入小鼠腹腔，0.2ml/只，9d后腹腔接种用无血清培养基稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠5×105/0.5ml。间隔7d后，每天观察小鼠腹水产生情况，用16号针头采集腹水，将腹水离心，取上清，测定效价，分装，-34℃冻存备用。
(5)确定抗原、抗体的工作浓度将SMD-BSA作1∶2000、1∶4000、1∶6000、1∶8000、1∶10000、1∶20000、1∶50000、1∶100000稀释，每一行作为一个稀释度，100μl每孔，37℃温浴2h，PBST洗涤三次，每次间隔3min。15％小牛血清封闭，每孔加200μl，37℃作用2h，同上洗涤，拍干。抗体纵向稀释，每一列为一个稀释度，100μl每孔，37℃作用1h，洗涤5次，拍干。加入1∶1000稀释的羊抗鼠酶标二抗100μl，37℃作用1h，洗板5次、拍干；每孔加入TMB底物显色液100μl，37℃避光显色10min，2mol/LH2SO4中止反应。测定OD450值。选取OD值，确定抗原、抗体工作浓度，作为间接竞争ELISA工作浓度。结果见表5
表5方阵实验的结果
根据结果选择抗原工作浓度1∶6000，抗体工作浓度为1∶100000。
(6)标准曲线的制备用标准系列浓度的SMD，0、1、10、50、100、500ng/ml做竞争ELISA，具体步骤同5。
用间接竞争ELISA制备SMD标准溶液的标准曲线及计算出的相关参数见表6、表7。
表7相关参数
标准差(SD)＝[∑(X-Xi)2/(n-1)]1/2；标准偏差(RSD)＝SD/B按下式计算抑制率，以抑制率为纵坐标，以药物浓度的对数作为横坐标，作图，结果如图5。
抑制率＝OD加入SMD/OD未加入SMD×100％通过以上实验结果表明，3E8细胞株经过两年多的冻存，重新复苏、克隆，形成的新细胞株仍能稳定地分泌抗SMD单克隆抗体，且效价较高。因此本实验室所保存的抗SMD单抗细胞株稳定性好，能够长时间的保存。
抗体是试剂盒中核心试剂之一，所以单克隆抗体性质的稳定，是开发残留快速检测试剂盒的首要关键。
四、SMD单克隆抗体的应用1、动物组织样品中SMD的测定(1)样品的前处理步骤A.取待测定的肌肉、肝脏或肾脏，去脂肪备用。
B.称取剪碎的样品2.5g于离心管中，加入乙腈水溶液(乙腈∶蒸馏水＝85∶15)10ml，以高速组织分散器分散后，加盖，不时振荡进行提取。
C.4000r/min离心10min，吸取3ml上清液于一带盖试管中，加3ml双蒸水和4.5ml乙酸乙酯，加盖，振荡提取。
D.3000r/min离心10min，将上层有机相吸出，用压缩空气吹干。
E.用1.5ml碱性PBS溶液(NaOH浓度为0.025mol/L)将残渣溶解，加入3ml正己烷，振荡。
F.离心，移去上层的正己烷及脂肪层，吸出下层液体。
G.用盐酸调节pH值至7.2±0.2，待测。
注若步骤F离心后脂肪分层不好，可再加正己烷，振荡，重复步骤F。
(2)SMD的药物添加回收试验配置0、1、10、50、100、500、1000ng/ml系列浓度的SMD溶液，将SMD添加到肌肉和肝脏中，按样品的前处理步骤处理添加药物的组织，用间接竞争ELISA方法检测添加了50ng/ml、100ng/ml SMD的样品，测定其回收率。
在50ng/ml时，在肌肉中的回收率为93.9％，在肝脏中的回收率为76.9％。在100ng/ml时，在肌肉中的回收率为88.5％，在肝脏中的回收率为91.4％。
(3)动物实验将买回的肉鸡先适应饲养3天，提供饲料和饮水，适应环境后分组。
27只体重1kg的鸡分为二组I组，3只，为对照组，不喂药；II组，24只，为低剂量组，投药200mg/只，用药10d。
将要饲喂的药物称取规定的重量，然后包裹在面粉中，做成面丸饲喂。对照组饲喂不加SMD的面丸，使动物实验的条件一致。
(4)采集样本采集鸡的肌肉、肝脏、肾脏，用作样品处理。
I组，第2、5、12d各杀一只；取其肌肉、肝脏、肾脏作为待检样品。II组，于停药后第1、2、3、4、5、6、9、12d每天各杀3只；取其肌肉、肝脏、肾脏作为待检样品。
(5)样品处理将采集的I、II组样品的肌肉、肝脏进行处理(方法如本节中A至G)。
(6)操作步骤先将全抗原(SMD-BSA)包被酶标板，再向酶标板加入上述小鼠腹水和待测样品组织，最后加入底物显色液，显色后，与标准曲线对比，计算出所测样品中磺胺-5-甲氧嘧啶含量。
(7)空白样品标准曲线制备间接竞争ELISA检测方法制备肌肉、肝脏的空白样品标准曲线。用合成的全抗原(SMD-BSA)包被酶标板，抗原的工作浓度为1∶5000，SMD抗体工作浓度为1∶100000。标准品浓度为0、1、10、50、100、500ng/ml。样品作5倍稀释后进行检测，绘制标准曲线。
将肌肉、肝脏的空白样本处理后作本底做标准曲线，与PBS标准曲线作比较，结果如图6横坐标为SMD浓度对数，纵坐标为抑制率。
从图6中可以看出，肌肉、肝脏的组织空白样本的标准曲线与PBS制成的标准曲线在形状上基本相似，且各方面的符合率比较高，虽然可以用稀释的阴性样本来减少组织对抗原、抗体结合的影响。但在实际应用中用PBS标准曲线来代替阴性样本标准曲线。
(8)样品中的药物残留检测将动物实验获得的分别停药1、2、3、4、5、6、9、12天时的多个样品，做样品处理后，用PBS稀释5倍，待测。用间接竞争ELISA检测方法测定组织样品中的SMD残留。
1-12天样品(200mg/只)检测所得SMD残留量，结果见表8表8样品检测所得SMD残留量
从表8可以看出，SMD在停药第5天时，肌肉中的SMD残留已经基本清除，而肝脏中药物残留可持续到12天以上。
2、牛奶中的药物添加回收试验(1)牛奶的样品前处理步骤(本室另一研究结果)方法1取新鲜牛奶，室温下4000r/min离心20min，弃去上层脂肪，取一份下层清液加四份PBS混匀后待测。
方法2新鲜牛奶，室温下4000r/min离心20min，弃去上层脂肪，取下层清液1ml，加入正己烷1ml，充分振荡，静置10min，取下层液体待测。
人工配置含有系列浓度的SMZ(复方新诺明)新鲜牛奶，按照方法1进行样品处理，使处理后的药物含量分别为0、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、0.9μg/ml，并以此建立标准曲线。
(2)用与测定肉质中相同的方法测定添加了高、中、低三种浓度0.005、0.25、0.5μg/ml的SMZ的牛奶样品。按照建立的回归方程，计算药物的添加回收率。
(3)牛奶中的药物添加回收率试验使用两种牛奶处理样品方法分别对添加标准浓度药物的新鲜牛奶进行处理。经比较发现，第一种方法，牛奶经离心脱脂后用PBS做5倍稀释，直接进行检测效果好，且处理方法简单快捷，故选择此法进行样品处理。
通过建立的标准抑制曲线，计算出该方法的检测下限LOD为6.148ng/ml，定量线LOQ为25.4ng/ml。
根据本发明方法测定的结果，通过回归方程计算出牛奶样品中添加三种浓度的SMZ，回收率分别为106％、71.6％和76.6％，变异系数为4.50％、7.40％和10.27％，具有较高的准确性。
3、鸡蛋中的药物添加回收试验(1)鸡蛋的样品前处理步骤将新鲜的鸡蛋打碎后，一部分直接添加磺胺-5-甲氧嘧啶标准液，另一部分将蛋黄和蛋清分离后，分别添加磺胺-5-甲氧嘧啶标准液，于匀浆机上打散，使得磺胺-5-甲氧嘧啶在各样品中的终浓度为2000ng/g、1000ng/g和0ng/g(空白样)，再将上述样本分别进行以下处理称取匀浆物5.0g，置50mL塑料离心管中。加入乙腈水溶液(乙腈∶蒸馏水＝85∶15)10mL，中速(200次/分)振荡20～30min，4000r/min离心10min，吸取3mL上清液于一带盖试管中，加入3mL双蒸水和4mL乙酸乙酯，加盖振荡提取30min后，于离心机上2000r/min离心10min，将上层有机相吸出，压缩空气下吹干。用1.5mL碱性PBS将残渣溶解，然后加入3mL正己烷，振荡。静置至分层，弃去上层正己烷层，重复2次。用6mol/LHCl调pH至7.2左右，做20倍稀释后(使得药物的理论终浓度为100ng/ml、50ng/ml和0ng/ml)，待测。
在已经确定的抗原抗体工作浓度的基础上，以经过前处理，得到从蛋清蛋黄混合物中未添加SMD的提取液做适当稀释后，作为稀释液，配置标准系列浓度的SMD，0、1、10、50、100、500、1000、2000ng/ml，做间接竞争ELISA，绘制标准曲线。并将处理的样品回收液进行间接ELISA实验，并通过标准曲线，计算样品中SMD的药物的添加回收率。
(2)鸡蛋中的药物添加回收率通过建立的标准抑制曲线，计算出该方法的检测下限LOD为8.5ng/ml，定量线LOQ为31.6ng/m。
根据本发明方法测定的结果，通过回归方程计算出蛋清、蛋黄、蛋清和蛋黄混合处理后的药物添加回收率分别为84.7％、96.6％、91.1％，变异系数为3.30％、3.38％、3.05％，具有较高的准确性。
五、SMD残留快速检测免疫分析试剂盒的研制(1)显色系统改进TMB显色系统为浓度为0.5mg/ml的5，5-四甲基联苯胺和浓度为0.35mg/ml的过氧化氢尿素组成，3，3’，5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢尿素的质量比为1∶1。
先将3，3’，5，5-四甲基联苯胺用无水乙醇配成5mg/ml的母液，再用蒸馏水配成0.5mg/ml的应用液。
先将过氧化氢尿素用蒸馏水配成35mg/ml的母液，用时再用磷酸盐缓冲液配成0.35mg/ml的应用液。
以上两种应用液1∶1比例混合，作为底物显色液。
配系列稀释浓度的5，5-四甲基联苯胺、过氧化氢尿素，进行浓度及显色稳定性测试。用终止液(2mol/L浓硫酸)终止反应后，在450nm波长下，酶标仪上读取OD值。
不同浓度的5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢尿素按比例混合，37℃水浴中显色10min后，终止ELISA反应，读取OD450值。间隔10min后再次读取OD值，重复两次。结果见表9、10、11
表9第一次读取的OD值
10min后再读取OD值如下表表10第二次读取的OD值
20min后读取的OD值如下表表11第三次读取的OD值
由以上的实验得出结论显色系统的浓度越高，酶标板褪色的时间越快。确定5，5-四甲基联苯胺为0.2mg/ml，过氧化氢尿素浓度为0.175mg/ml。
经过实验条件的优化，最终确定5，5-四甲基联苯胺浓度为0.21mg/ml，过氧化氢尿素浓度为0.165mg/ml。
(2)酶标板保存酶标板上抗原的结合比较牢固，不易脱落，因此，置于4℃冰箱内可长期保存。
(3)抗体(一抗)的保存将抗SMD抗体保存在高压灭菌的甘油中。最终稀释一抗后，使甘油浓度低于5％，因此做了两个稀释倍数保存一抗，分别为2000倍和8000倍稀释，甘油浓度为30％。使用时，2000倍稀释的一抗再稀释50倍，8000倍稀释的一抗再稀释12.5倍，使一抗工作浓度为1∶100000。结果见表12、13表124℃放置一个月后的SMD曲线OD值
表134℃、-20℃放置6个月后的药物曲线OD值
从保存的抗体与现配的抗体之间的标准曲线上，可以得出结论在30％甘油中保存的一抗工作曲线较好，效价几乎没有下降。稀释8000倍的抗SMD抗体在4℃放置6个月后，工作浓度几乎不变，标准曲线与现配的抗SMD抗体几乎一致，证明稀释8000倍的一抗在4℃能够很好地保存。
(4)其它配制SMD标准液的浓度为0、1、10、50、100，200ng/ml，配好后分装于EP管。置4℃保存。终止液为2mol/L的硫酸。
用标准品配制的标准液，其水溶液性质很稳定，终止液硫酸也非常稳定，它们两者在常温下都能放置很长时间，因此，在4℃能长期保存。六、本发明方法与高效液相色谱法(HPLC)比较试验对喂给SMD药物的鸡停药后3d、6d、9d的鸡肉样品按照下述方法进行前处理，并用本发明方法和HPLC法作比较取2g样品，加入0.5ml 10％Na2SO4和1.5ml CH3CN混合液，制成匀浆，再加入乙腈-氯仿(5∶1)2ml，剧烈混合1min，3500r/min离心3min，上清液转移，残渣用2ml乙腈-氯仿重提一次，合并二次上清液，在＜40℃条件下用氮气或空气吹干，再加入1ml 2％硫酸与2ml正己烷，混匀，离心3min，去掉正己烷层，再用2ml正己烷与上清液混合，洗水相一次，同法去掉正己烷层，分别加入3ml、2ml乙腈-氯仿(1∶2)混合离心3min，取氯仿层在低温(＜40℃)下蒸干，用1ml流动相溶解做ELISA或高效液相色谱法测定，结果比较结果比较(ng/ml)
高效液相色谱法测定SMD时回收率明显较低，检测限相对较低，常有漏检之疑。
同一样品，用本发明方法测定，其检出率较高，不易出现漏检现象。高效液相色谱法对同一份样品中SMD测定值约为本发明方法的1/3，因本发明法不仅可测SMD原药，而且可以同时检测其代谢产物，而高效液相色谱法测定时，不包含其代谢产物。
七、总结本发明有益效果体现在(1)特异性检测用3E8-H5产生的抗体，对几种磺胺药作交叉反应，能产生50％抑制浓度者为有效反应，特异。否则，为非特异。结果表明只对SMD特异。
(2)灵敏性检测可检测样品中SMD含量最低达15.84ng/g(肝脏)和1.02ng/g(肌肉)。
(3)回收率测定常规方法检测，在100ng/ml添加时SMD肌肉中回收率为87.45％，肝脏中回收率为97％，肾脏中为87％，加入50ng/ml时，肌肉、肝、肾回收率分别为92％，89％，108％；牛奶样品中添加三种浓度的SMZ，回收率分别为106％、71.6％和76.6％；蛋清、蛋黄、蛋清和蛋黄混合处理后的药物添加回收率分别为84.7％、96.6％、91.1％，具有较高的准确性。
(4)细胞株稳定，3E8细胞株为本实验室于2002年6月获得，经多次传代、复苏后仍能产生特异性抗体，复苏后的新细胞株命名为3E8-H5。
权利要求
1.磺胺-5-甲氧嘧啶含量的酶联免疫检测方法，其特征在于1)采用戊二醛法把磺胺-5-甲氧嘧啶连接到牛血清白蛋白或卵清白蛋白形成全抗原；2)采用细胞融合法制备筛选含有稳定分泌磺胺-5-甲氧嘧啶抗体的杂交瘤细胞株；小鼠腹水诱生法制备含有磺胺-5-甲氧嘧啶抗体的小鼠腹水；3)提取待测样品组织；4)先将全抗原包被酶标板，再向酶标板加入上述小鼠腹水和待测样品组织，最后加入底物显色液，显色后，与标准曲线对比，计算出所测样品中磺胺-5-甲氧嘧啶含量。
2.根据权利要求1所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法，其特征在于所述底物显色液为由3，3’，5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢尿素组成的混合液。
3.根据权利要求2所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法，其特征在于底物显色液由浓度为0.2～0.5mg/ml的5，5-四甲基联苯胺和浓度为0.165～0.35mg/ml的过氧化氢尿素组成。
4.根据权利要求3所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法，其特征在于3，3’，5，5-四甲基联苯胺的浓度为0.2～0.21mg/ml。
5.根据权利要求3所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法，其特征在于过氧化氢尿素的浓度为0.165～0.175mg/ml。
6.根据权利要求1所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法，其特征在于所述待测样品的提取方法是将待测动物源性食品，用乙腈水溶液提取组织，再用乙酸乙脂水溶液再提取，取有机层，吹干，再用碱性液溶解沉渣，并加入正己烷震荡，离心，进一步脱脂，用盐酸调节pH7.2±0.2，稀释。
7.根据权利要求6所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法，其特征在于所述稀释倍数为5～20倍。
8.根据权利要求1所述磺胺-5-甲氧嘧啶含量的检测方法，其特征在于所述含有磺胺-5-甲氧嘧啶抗体的小鼠腹水的制备步骤是先制备杂交瘤细胞，并筛选出特异性强、分泌抗体稳定的细胞株3E8-H5；然后将细胞株注入BALB/C小鼠腹腔，制备腹水。
全文摘要
磺胺－5－甲氧嘧啶含量的酶联免疫检测方法，涉及食品中兽药残留安全检测技术领域，特别是用于筛选、定量检测市场上奶、肉、蛋等动物类食品中残留SMD定性和定量。本发明用免疫方法把半抗原SMD变为全抗原，制备特异性抗体，由于酶的催化效率高，可极大地放大反应效果，从而使测定方法达很高的敏感度，使该法特异性强，灵敏度高，适合大批样品的筛选。
文档编号G01N33/531GK1916631SQ20061004145
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月5日 优先权日2006年9月5日
发明者王宗元, 王捍东, 杨春花, 彭会建, 唐娜, 刘学忠, 卞建春, 任建新 申请人:扬州大学