专利名称：磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒、其制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物残留检测试剂盒，尤其涉及兽药磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒、及其制备方法和检测方法，属生物化学领域。
背景技术：
磺胺六甲嘧啶(SMM)具有很强的抗菌和原虫感染的作用，被广泛地用于畜禽疾病的治疗和预防，并由于其对生长的促进作用又作为饲料添加剂在畜禽生产中被广泛地应用。所以它是残留问题最严重的兽药之一，由其导致的过敏、耐药菌株等问题己引起广泛关注。因此，从2005年起，农业部把畜产品中磺胺类药物的残留情况作为继盐酸克伦特罗之后的又一个重点予以监控。当人们长期食入含有此类药物的动物性食品时，低浓度的药物残留通过食物链向人类传播，诱导人类致病菌对其耐药性的增强，产生很多不良反应。包括 ①泌尿系统损害 ’②过敏反应；③造血系统损害(主要发生溶血)；④中枢神经系统反应；⑤ 此药可通过母体胎盘进入胎儿体内，造成新生儿黄疸。因此，磺胺类兽药在动物性食品中的残留问题已引起重视。我国以及美国、欧盟等国家规定了动物性食品中总磺胺以及单个磺胺的最高残留限量为0. lmg/kg，而日本规定不得检出。国内外常用的对SMM检测方法有HPLC法和ELISA试剂盒，HPLC法费用高，前处理过程繁琐，不适应于大量样品的快速检测；ELISA试剂盒灵敏度相对不够高，检测限较低 (一般到10_9g/ml)，不能满足某些低浓度物质含量测定的要求。因此，亟需一种高灵敏度、快速，且能准确可靠地进行定量分析的试剂盒。
发明内容
本发明目的在于设计一种高灵敏度、能快速且准确可靠地进行定量分析的新型磺胺六甲嘧啶检测试剂盒；另一目的在于提供其制备方法；又一目的在于提供其检测方法。为实现本发明目的，本发明采用增强化学发光酶联免疫分析法检测磺胺六甲嘧啶的残留量，设计了磺胺六甲嘧啶增强化学发光酶联免疫检测试剂盒。(一)该检测试剂盒包括不透明微孔板和检测试剂，其特征在于，检测试剂由HRP-SMM酶标抗原、SMM标准品溶液梯度溶液、HRP-SMM样品稀释液、化学发光底液A、 化学发光底液B、洗涤液组成，分别独立盛装于试剂瓶中；所述微孔板各孔包被浓度为2
^gZml磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体；所述HRP-SMM酶标抗原是辣根过氧化物酶和磺胺六
甲氧嘧啶偶联物；所述SMM标准品溶液梯度溶液分别是0.6pg/ml、lpg/ml、6pg/ml、60pg/ mlU00pg/ml ；所述HRP-SMM样品稀释液为0. 05mol/L碳酸盐(CB)缓冲液；化学发光底液A是2X Kr5 1 X l(T3mol/L鲁米诺溶液、5X 1(Γ5 1 X IO"3 mol/L对羟基苯酚溶液和 pH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl的混合溶液；化学发光底液B是2X 10_5 1 X 10_3 mol/L 过氧化氢溶液；洗涤液是含有质量百分比0. 05%吐温-20的pH7. 2 0. Olmol/L磷酸盐(PBS) 溶液。所述碳酸盐缓冲液为碳酸钠和碳酸氢钠混合液；磷酸盐溶液为磷酸氢二钠溶液、磷酸二氢钠溶液混合液。
(二)磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒的制备方法通过如下方法实现 (1)配制HRP-SMM样品稀释液、洗涤液 HRP-SMM样品稀释液的配制 碳酸钠1. 59g
碳酸氢钠2. 93g
加纯水至1000ml，过滤除菌，4°C保存。洗涤液的配制
吐温-20500 μ
加 0. Olmol/LPBS (ρΗ7· 2)至 1000ml，过滤除菌，4°C保存。0. Olmol/LPBS (ρΗ7· 2)配方
0. 2mol/L 磷酸氢二钠溶液(取 Na2HPO4 .Iffl2O 71. 6g，加纯水至 1000ml) 0. 2mol/L 磷酸二氢钠溶液(取 NaH2PO4. 2H20 35. 6g，加纯水至 1000ml) 取 0. 2moVLNa2HPO4 溶液 80ml, 0. 2mol/L NaH2PO4 溶液 20ml 和 17g NaCl，加纯水至 2000ml，过滤除菌，4°C保存。(2)制备包被抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗体的微孔板
不透明微孔板中加入磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体，用PH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释，每
孔加200 μ 于检测板孔内，使包被多克隆抗体的浓度为2 μ§/ηι1 ,置4°c过夜；弃去包
被液，用上述配制的洗涤液洗涤各孔，在吸水纸上拍干；随之每孔加入封闭液，随后弃去封闭液拍干，室温下干燥；干燥后的酶标板，迅速真空封口包装，将封装好的板存于2-8°C ； (3)、标准品的制备
将磺胺六甲嘧啶用PH9. (Γ9. 5的磷酸盐溶液稀释成五个梯度浓度，分别是0. 6pg/ml、 lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、lOOpg/ml，分装于瓶中；
(3)、化学发光底物的制备
将一定量的鲁米诺溶液、对羟基苯酚溶液和PH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl混合制得化学发光底液A ；配制一定量过氧化氢溶液为化学发光底液B，分装于瓶中；
(4)HRP-SMM酶标抗原的制备
取磺胺六甲氧嘧啶溶于二氧六环中，此溶液为I液；取辣根过氧化物溶于PH7. 2磷酸盐缓冲溶液中，此溶液为Π液；置I液于磁力搅拌器上搅动，加入II液，然后加入戊二醛，避光搅拌反应，得偶联物。最后把偶联物装入透析袋中，在4°C下用pH7. 2磷酸盐缓冲溶液透析即可。(三)本发明所述磺胺六甲嘧啶增强化学发光酶联免疫检测试剂盒的应用，其检测程序为
(1)平衡取样品及其检测试剂盒内的试剂，于If 25°C平衡30士5min。(2)加样和酶标抗原取微孔板，预设一个空白对照孔，空白对照孔加入50 μ 样
品稀释液，其余每孔加入50 μ 待测样品；然后微孔板上所有孔均加上100 μ1 HRP-SMM 酶标抗原，振荡5分钟，37°C孵育1小时。
(3)洗板甩去板孔中的液体，用洗涤液冲洗，在吸水纸上拍干。(4)加发光底物每孔中先后加入化学发光底液A、化学发光底液B各50 μ ，避光震荡2min。(5)测定在化学发光仪上测出各孔相对发光值(RLU)。其检测方法原理将待测样品中的磺胺六甲氧嘧啶与一定量的标记有辣根过氧化物酶的磺胺六甲氧嘧啶(SMM)竞争性地与固相磺胺六甲氧嘧啶抗体进行结合，分离未结合的标记抗原，利用鲁米诺体系作为化学发光底物，测定标记抗原与抗体复合物化学发光强度，经相应的数学函数计算(参见文献化学发光基础理论与应用[M].化学工业出版社， 2004，7 :Γ5)得出待测抗原(SMM)的含量，从而快速地测定食品中的磺胺六甲氧嘧啶残留量。本发明用于牛奶、鸡蛋、肉及其制品中磺胺六甲氧嘧啶含量的检测。本发明创新点在于将增强化学发光酶联免疫分析法应用到兽药磺胺六甲氧嘧啶残留检测中，将抗原抗体特异性免疫反应、酶的高效催化和高灵敏的化学发光检测技术相结合，用特定的酶标记抗原或抗体，对待测物通过增强发光底液进行定性或定量测定。这种方法的最小检出值可达10_18 10_15mol，较常规的酶免疫分析的灵敏度提高3 5个数量级，对实际样品的测定前处理简单，且其检测快速，更加适用于低浓度大批量物质的分析。将本试剂设计成检测盒方法新颖，便于现场大批量快速检验，费用低，同时具有操作简单、高灵敏度和高特异性的优点，灵敏性达0.0927pg/ml，，精密度小于15%，与多种抗生素交叉反应率均小于洲。对检测兽药磺胺六甲氧嘧啶的残留具有较好的检测效果，便于食品安全监测，保证人们食用安全，具有很好的实际应用和推广价值。
图1 HRP、S匪及偶联物HRP-SMM的紫外光谱图； 图2 HRP、SMM及偶联物HRP-SMM的红外光谱图。
具体实施例方式为对本发明进行更好地说明，详举实例如下 实施例1磺胺六甲嘧啶增强化学发光酶联免疫检测试剂盒
本发明磺胺六甲嘧啶检测试剂盒包括抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗体包被96孔微孔板1 块，HRP-SMM酶标抗原1瓶、SMM标准品溶液梯度溶液5瓶(浓度分别为0. 6pg/ml、lpg/ml、 6pg/ml、60pg/ml、100pg/ml)、HRP-SMM 样品稀释液(0. 05mol/L 碳酸盐(CB)缓冲液)、化学发光底液A、化学发光底液B、洗涤液各一瓶(含0. 05%吐温-20的pH7. 2 0. Olmol/L磷酸盐 (PBS)溶液)及使用说明书一份。化学发光底液A是2X10_5 1X10_3 mol/L鲁米诺溶液、 5 X IO"5 1 X 10_3 mol/L对羟基苯酚溶液和pH8. 0的0. lmol/L Tris — HCl的混合溶液； 化学发光底液B是2X 10_5 1 X 10_3mol/L过氧化氢溶液。实施例2磺胺六甲嘧啶增强化学发光酶联免疫检测试剂盒的制备 (1) HRP-SMM样品稀释液、洗涤液的配制
A、配制HRP-SMM样品稀释液 碳酸钠1. 59g碳酸氢钠加纯水至1000ml，
2. 93g
过滤除菌，4°C保存。 B、配制洗涤液
吐温-20
500 μ
加 0. 01mol/L PBS (ρΗ7· 2)至 1000ml，过滤除菌，4°C保存。0. 01mol/L PBS (ρΗ7· 2)配方
0. 2mol/L 磷酸氢二钠溶液(取 Na2HPO4. 12H20 71. 6g，加纯水至 1000ml) 0. 2mol/L 磷酸二氢钠溶液(取 NaH2PO4. 2H20 35. 6g，加纯水至 1000ml) 取 0. 2mol/L Na2HPO4 溶液 80ml,0. 2mol/L NaH2PO4 溶液 20ml 和 17g NaCl，加纯水至 2000ml，过滤除菌，4°C保存。(2)制备包被抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗体的微孔板
微孔板选96孔乳白色不透明聚苯乙烯板，加入磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体，用pH9. 6
的碳酸盐缓冲液稀释，每孔加200 μ 于检测板孔内，使包被多克隆抗体的最佳浓度为 2 Mg^ll，置4°C过夜(18小时)。弃去包被液，用洗涤液充分洗涤各孔，在吸水纸上拍干。
随之每孔加入封闭液，每孔300 μ ，37°C封闭2小时，随后弃去封闭液拍干，室温下干燥4
小时。干燥后的酶标板，迅速真空封口包装，将封装好的板存于2-8°C。(3)、标准品的制备
将磺胺六甲嘧啶(sigma，纯度99. 5%)用PBS (ρΗ9. (Γ9. 5)稀释成五个梯度浓度，分别是0. 6pg/ml、lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、lOOpg/ml，分装于瓶中。(4)化学发光底物的制备
化学发光底物由化学光底液A和化学光底液B组成化学发光底液A是2X 10_5 lX10_3mol/L鲁米诺溶液(化学名称为3-氨基邻苯二甲酰胼)、5X10_5 1X10_3 mol/L对羟基苯酚溶液和PH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl的混合溶液；化学发光底液B是2 X 10_5 lX10_3mol/L过氧化氢溶液。(5)、HRP-SMM酶标抗原的制备
取磺胺六甲氧嘧啶IOmg溶于ImL 二氧六环中，此溶液为I液；取5mg辣根过氧化物溶
于500 μ 1ρΗ7. 2磷酸盐缓冲溶液中，此溶液为II液；置I液于磁力搅拌器上缓慢搅动，
与此同时II液缓慢加入，然后向溶液中缓慢加入200 μ 25%的戊二醛，避光搅拌反应4h。
4h后把偶联物装入事先处理好的透析袋中，在4°C下用pH7. 2磷酸盐缓冲透析三天即可使用。本发明中所述多克隆磺胺六甲氧嘧啶抗体购于广州美津生物技术有限公司。实施例3本发明试剂盒的应用及测定操作程序
(1)平衡从冷藏环境中取出样品及试剂盒，于If25°C平衡30士5min
(2)加样和酶标抗原取96孔化学发光微孔板，预设一个空白对照孔，空白对照孔加入
50 μ HRP-SMM样品稀释液，其余每孔加入50 μ 待测样品；然后微孔板上所有孔均加上100 μ丨HRP-SMM酶标抗原，振荡5分钟，37°C孵育1小时。(3)洗板甩去板孔中的液体，用洗涤液至少冲洗4次，在吸水纸上拍干。(4)加发光底物每孔中先后加入化学发光底液A、化学发光底液B各50 μ ，避光振荡2分钟。(5)测定在化学发光仪上测出各孔相对发光值(RLU)。实施例4本发明试剂盒的特异性、灵敏度、精密度检测
(1)选取磺胺类药物磺胺六甲氧嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶及几种常用抗菌药物庆大霉素、氯霉素、青霉素、四环素、阿莫西林、恩诺沙星、环丙沙星，分别使用样品稀释液配制系列浓度的各种药物溶液，加入各药物系列浓度按照建立化学发光酶免疫分析标准曲线的操作步骤得到相应的针对磺胺六甲氧嘧啶多抗抑制曲线，计算得到各药物针对抗体的IC5tlt5而SMM的IC5tl与各药物的IC5tl比值的百分数即为交叉反应率。交叉反应性实验其实是考察增强化学发光酶联免疫分析法检测磺胺六甲嘧啶的特异性，即此试剂盒的特异性。表1特异性实验结果
药物
磺胺六甲氧嘧啶横胺二甲氧嘧啶磺胺对甲氧嘧啶阿莫西林庆大霉素环丙沙星恩诺沙星四环素氣霧素青霧素
IC50 (ng/mL)
80
80
>10.
>10'
>10·
>10'
>10'
>10'
.4
4
4
>10辟
CR (%) 100 2.0 2.0 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016 <0.016
由上表格数据结果可知，抗体针对同种磺胺类药物的的交叉反应率均小于等于洲，且与不同类药物基本无交叉反应。说明此试剂盒特异性良好。
(2)精密性实验 结果统计见表2
表2精密度实验结果
8
权利要求
1.一种磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒，包括不透明微孔板、检测试剂，其特征在于，检测试剂由如下组份组成磺胺六甲氧嘧啶系列标准液、辣根过氧化物酶HRP-磺胺六甲氧嘧啶 SMM酶标抗原、HRP-SMM样品稀释液、化学发光底液A、化学发光底液B和洗涤液组成，分别独立盛装于试剂瓶中；化学发光底液A为2X 10_5 1 X 10_3mol/L鲁米诺溶液、5X 10_5 IX 10_3mOl/L对羟基苯酚溶液和pH8. 0的0. lmol/L Tris 一 HCl的混合溶液；化学发光底液B为2X 10_5 1 X 10_3mol/L过氧化氢溶液；所述不透明微孔板各孔包被有浓度为2Mg/rnl磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体。
2.如权利要求1所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒，其特征在于，所述磺胺六甲氧嘧啶系列标准液为0. 6pg/ml、lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、100pg/ml ；所述 HRP-SMM 样品稀释液为0. 05mol/L碳酸盐缓冲液；洗涤液为含有质量百分比0. 05%吐温-20的pH7. 2 0. Olmol/ L磷酸盐溶液。
3.如权利要求2所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒，其特征在于，所述碳酸盐缓冲液为碳酸钠和碳酸氢钠混合液；磷酸盐溶液为磷酸氢二钠溶液和磷酸二氢钠溶液混合液。
4.制备权利要求1-3任何一种所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒的方法，其特征在于，通过如下方法实现(1)HRP-SMM样品稀释液、洗涤液的配制称取碳酸钠、碳酸氢钠，将两者混合，加纯水溶解，制成0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，过滤除菌，4°C保存作为HRP-SMM样品稀释液；称取吐温-20、取0. 2mol/L Na2HPO4溶液， 0. 2mol/L NaH2PO4溶液和NaCl，加纯水溶解，制成含有质量百分比0. 05%吐温-20的pH7. 2 0. Olmol/L磷酸盐溶液，过滤除菌，4°C保存作为洗涤液；(2)制备包被抗磺胺六甲嘧啶多克隆抗体的微孔板不透明微孔板中加入磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体，用PH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释，每孔加200 μ 于检测板孔内，使包被多克隆抗体的浓度为2 _LLg/ml，置4°C过夜；弃去包被液，用上述配制的洗涤液洗涤各孔，在吸水纸上拍干；随之每孔加入封闭液，随后弃去封闭液拍干，室温下干燥；干燥后的酶标板，迅速真空封口包装，将封装好的板存于2-8°C ；(3)、标准品的制备将磺胺六甲嘧啶用PH9. 0-9. 5的磷酸盐溶液稀释成五个梯度浓度，分别是0. 6pg/ml、 lpg/ml、6pg/ml、60pg/ml、lOOpg/ml，分装于瓶中；(4)、化学发光底物的制备将2 XUT5 lX10_、ol/L鲁米诺溶液、5X10_5 1 X l(T3mol/L对羟基苯酚溶液和 ρΗ8· 0的0. lmol/L Tris — HCl混合制得化学发光底液A ；配制2X 10_5 1 X 10_3mol/L过氧化氢溶液为化学发光底液B ；(5)HRP-SMM酶标抗原的制备取磺胺六甲氧嘧啶溶于二氧六环中，此溶液为I液；取辣根过氧化物溶于PH7. 2磷酸盐缓冲溶液中，此溶液为Π液；置I液于磁力搅拌器上搅动，加入II液，然后加入戊二醛，避光搅拌反应生成偶联物，最后把偶联物装入透析袋中，在4°C下用pH7. 2磷酸盐缓冲溶液透析即可。
5.如权利要求1-3任何一种所述的磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒的应用，其特征在于，通过如下步骤检测(1)平衡从冷藏环境中取出样品及试剂，于If25°C平衡30士5min ；(2)加样和酶标抗原取微孔板，预设一个空白对照孔，空白对照孔加入50μ 样品稀释液，其余每孔加入50 μ1待测样品；然后微孔板上所有孔均加上100 μ HRP-SMM酶标抗原，振荡5分钟，37°C孵育1小时；(3)洗板甩去板孔中的液体，用洗涤液冲洗，在吸水纸上拍干；(4)加发光底物每孔先后加入化学发光底液A、化学发光底液B各50μ ，避光振荡 2分钟；(5)测定在化学发光仪上测出各孔相对发光值。
全文摘要
本发明公开了磺胺六甲氧嘧啶检测试剂盒、其制备方法及其应用，属生物化学领域。该检测试剂盒包括微孔板和检测试剂，其中所述微孔板为不透明塑料板且其各孔包被有浓度为2μg/mL磺胺六甲氧嘧啶的包被抗体；所述检测试剂由酶标抗原(辣根过氧化物-磺胺六甲氧嘧啶HRP-SMM)、磺胺六甲氧嘧啶标准品梯度溶液、酶标抗原样品稀释液、化学发光底液A、化学发光底液B、洗涤液组成。本发明用于牛奶、鸡蛋、肉及其制品中磺胺六甲氧嘧啶含量的检测，本试剂盒设计方法新颖，便于现场大批量快速检验、费用低，同时具有操作简单、高灵敏度和高特异性的优点，作为检测兽药磺胺六甲氧嘧啶的残留具有较好的的应用前景。
文档编号G01N33/543GK102175856SQ20111002235
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月20日 优先权日2011年1月20日
发明者吴拥军, 屈凌波, 石杰 申请人:郑州大学