专利名称：海水鱼卵子石蜡切片方法
技术领域：
本发明属于一种海水鱼卵子石蜡切片技术，是在已有石蜡切片技术的基础上对固定剂、脱水程序、透明程序、透蜡方法以及染色方法进行全面改进的方法。
背景技术：
在本发明做出之前，石蜡切片由于操作简单、价格低廉的特点，一直是传统的生物学研究技术，石蜡切片包括固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、透明以及封片等步骤，在生物学的许多领域都得到了广泛的应用。但是由于海水鱼卵子有着特殊的卵膜构造，其石蜡切片的效果一直不尽人意，对于淡水鱼卵，国内外采用了剥除卵膜后按传统方法进行石蜡切片的方法，效果明显提高。但是由于海水鱼类卵子的卵周隙较小，剥除卵膜操作困难且很容易造成卵子破裂；没有剥除卵膜的卵子在进行切片时，由于卵膜的阻挡作用，往往存在卵子变形、切片破碎等问题；在固定剂方面，采用常用的光镜样品固定剂，对于海水鱼卵子样品的固定效果不理想，导致切片不完整；在脱水程序中，由于鱼卵带有卵膜，影响卵膜内外的物质交流，常规的脱水方法会由于脱水过快导致卵子变形；在透明程序中，脱水后的鱼卵进入二甲苯后迅速变形，且不可恢复；在透蜡程序中，由于石蜡分子量较大，卵膜对其的阻挡作用更强，导致透蜡不完全；目前一直没有效果较好的海水鱼卵子石蜡切片方法，有些研究者只能采用费用、设备都要求较高的电镜观察方法，限制了对海水鱼类早期发育生物学的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够改善和提高海水鱼卵子石蜡切片质量的方法，通过该方法的实施，可以省略费时的剥除卵膜步骤，简化和改善海水鱼卵子石蜡切片的效果，解决海水鱼卵子石蜡切片过程中的卵子变形、蜡片不连续、有空洞的问题。
本发明是按以下操作技术完成的石蜡切片包括固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、透明以及封片，本发明在海水鱼卵子石蜡切片过程中，对固定剂、脱水程序、透明程序、透蜡方法、包埋程序和染色方法进行了改进，即进行了固定剂的选择、脱水程序的确定、透明程序的确定、透蜡程序的确定、染色方法的改进。
固定剂的选择采用电镜样品固定常用的戊二醛，戊二醛的浓度为1.5％，采用脱脂棉过滤的海水作为溶剂。固定过程中更换固定液3～4次。
脱水程序的确定样品采用乙醇脱水，采用85％乙醇50min、95％乙醇45min、95％乙醇45min、100％乙醇35min、100％乙醇35min。85％到95％乙醇采取10％的浓度梯度，95％到100％乙醇采取5％的浓度梯度，每梯度2次脱水程序，样品脱水前用100％琼脂将样品包埋定位。
透明程序的确定采取1∶1的二甲苯∶乙醇过渡方法。具体透明过程如下1∶1二甲苯100％乙醇15s，二甲苯10s，二甲苯10s。
透蜡程序的确定和包埋透蜡采用熔点为42～47℃的软蜡，透蜡程序如下透蜡时间3小时，期间换蜡一次，即石蜡1h30min，石蜡1h30min，透蜡后用纸盒包埋。采用普通生物切片机切片，切片厚度5μm；用恒温水浴展片，动物胶贴片。
染色方法的改进染色采用了曙红苏木素复染，苏木素染液配方如下热蒸馏水2000ml，苏木素2g，碘酸纳0.4g，钾明矾150g，柠檬酸2g，水和氯醛100g；伊红染液配方1％曙红Y水溶液100m1，98％乙醇780ml，冰醋酸4ml。
本发明与已有技术对比其特点是1、本发明省略了鱼卵石蜡切片过程中难以操作的卵膜剥离程序，简化了程序、提高了工作效率。
2、本发明克服了海水鱼卵子石蜡切片中存在的卵子变形、切片不连续、存在空洞等问题，切片厚度可达5μm。
3、本发明方法操作简单，不需要专门设备，药品易得，便于推广使用。
图1、大菱鲆卵子切片，示减数分裂中卵子皮层中的纺锤体。
1-卵子皮层、2-纺锤体图2、大菱鲆卵子切片，示卵裂中卵子中的纺锤体。
2-纺锤体
具体实施例方式下面通过实施例结合附图详细叙述本发明的技术方法
石蜡切片包括固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、脱蜡、染色、透明以及封片。本发明在海水鱼卵子石蜡切片过程中，对固定剂、脱水程序、透明程序、透蜡方法、包埋程序和染色方法进行了改进，即进行了固定剂的选择、脱水程序的确定、透明程序的确定、透蜡程序的确定、染色方法的改进。
固定剂的选择常用的光镜样品固定剂，对于海水鱼卵子样品的固定效果并不理想，在切片过程中常出现切片破裂等情况。我们采用电镜样品固定常用的戊二醛，取得了良好的固定效果，切片连续，破裂情况大大减少。戊二醛的浓度为1.5％，为了保证固定液与鱼卵渗透压的一致性，采用脱脂棉过滤的海水作为溶剂。为了保证戊二醛固定液的浓度，固定过程中更换固定液3～4次。
脱水程序由于鱼卵带有卵膜，影响卵膜内外的物质交流，常规的脱水方法会由于脱水过快导致卵子变形，经过不断修改脱水程序，我们采用的脱水程序如下85％乙醇50min、95％乙醇45min、95％乙醇45min、100％乙醇35min、100％乙醇35min；85％到95％乙醇采取10％的浓度梯度，95％到100％乙醇采取5％的浓度梯度，每梯度2次的脱水程序，获得了较好的脱水效果，卵子脱水完全，基本无收缩、变形情况。另外样品脱水前用100％琼脂将样品包埋定位，这样可以方便以后的操作。
透明程序在实验过程中发现，脱水后的鱼卵进入二甲苯后迅速变形，且不可恢复，为此，我们采取了1∶1的二甲苯∶乙醇过渡的方法，很好地解决了这一问题。具体透明过程如下1∶1二甲苯∶100％乙醇15s，二甲苯10s，二甲苯10s。
透蜡、包埋和切片程序由于石蜡分子量较大，卵膜对其的阻挡作用很强，因此，我们采用了较长的透蜡时间，为了防止透蜡时间过长而导致样品发脆，我们又采用熔点较低的石蜡，这样，取得了很好的效果，透蜡完全，切片完整。透蜡采用熔点为42～47℃的软蜡，透蜡程序如下透蜡时间3小时，期间换蜡一次，即石蜡1h30min，石蜡1h30min，透蜡后用纸盒包埋。采用普通生物切片机切片，切片厚度5μm；用恒温水浴展片，动物胶贴片。
脱蜡、染色和封片方法脱蜡采取二甲苯脱蜡，具体程序如下二甲苯5min，二甲苯5min，然后进行复水，具体程序如下100％乙醇2min，100％乙醇2min，95％乙醇2min，95％乙醇2min，80％乙醇2min，80％乙醇2min，50％乙醇2min，蒸馏水2min；复水后的切片用曙红苏木素复合染色。有文献表明，戊二醛固定液会影响切片的染色情况，造成染色浅，分色不明显，为此我们对1.5％戊二醛海水固定液固定样品的切片进行了染色观察，染色采用了曙红苏木素复染，苏木素染液配方如下热蒸馏水2000m1，苏木素2g，碘酸纳0.4g，钾明矾150g，柠檬酸2g，水和氯醛100g；曙红染液配方1％曙红Y水溶液100m1，98％乙醇780ml，冰醋酸4ml。具体程序如下苏木素3min50s，自来水冲洗4min，曙红2min30s；结果表明，戊二醛固定液对染色没有明显的影响，切片染色效果良好，染色深度合适，分色明显。染色后的切片用酒精脱水，二甲苯透明，具体程序如下95％乙醇2min，95％乙醇2min，100％乙醇2min，100％乙醇2min，二甲苯2min30s，二甲苯2min30s，二甲苯2min30s，然后用加拿大树胶封片。
采用上述方法，我们在中国水产科学研究院黄海水产研究所进行了实际应用，共对大菱鲆、牙鲆等海水鱼的十几批卵子进行了石蜡切片，结果表明，采用本发明的方法可以获得良好的切片和染色质量，切片连续、完整，切片中纺锤体等细微结构清晰可见，具体效果见(图1、2)。
权利要求
1.一种海水鱼卵子石蜡切片方法，它的操作程序是固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、脱蜡以及染色，其特征在于在海水鱼卵子石蜡切片过程中，对固定剂、脱水程序、透明程序、透蜡方法和染色方法进行了改进，即进行了固定剂的选择、脱水程序的确定、透明程序的确定、透蜡程序的确定、染色方法的改进固定剂的选择采用电镜样品固定常用的戊二醛，戊二醛的浓度为1.5％，采用脱脂棉过滤的海水作为溶剂；固定过程中更换固定液3～4次；脱水程序的确定样品采用乙醇脱水，采用85％乙醇50min、95％乙醇45min、95％乙醇45min、100％乙醇35min、100％乙醇35min；85％到95％乙醇采取10％的浓度梯度，95％到100％乙醇采取5％的浓度梯度，每梯度2次脱水程序，样品脱水前用100％琼脂将样品包埋定位；透明程序的确定采取1∶1的二甲苯∶乙醇过渡方法；具体透明过程如下1∶1二甲苯∶100％乙醇15s，二甲苯10s，二甲苯10s；透蜡程序的确定和包埋透蜡采用熔点为42～47℃的软蜡，透蜡程序如下透蜡时间3小时，期间换蜡一次，即石蜡1h30min，石蜡1h30min，透蜡后用纸盒包埋；采用普通生物切片机切片，切片厚度5μm；用恒温水浴展片，动物胶贴片；染色方法的改进染色采用了曙红苏木素复染，苏木素染液配方如下热蒸馏水2000ml，苏木素2g，碘酸纳0.4g，钾明矾150g，柠檬酸2g，水和氯醛100g；伊红染液配方1％曙红Y水溶液100ml，98％乙醇780ml，冰醋酸4ml。
全文摘要
一种海水鱼卵子石蜡切片方法，包括固定剂的选择、脱水程序的确定、透明程序的确定、透蜡程序的确定、染色方法的改进，省略了鱼卵石蜡切片过程中难以操作的卵膜剥离程序，简化了程序、提高了工作效率。克服了海水鱼卵子石蜡切片中存在的卵子变形、切片不连续、存在空洞等问题，获得良好的切片和染色质量，该方法简单易操作，不需专门设备，药品易得，可用于海水鱼类早期发育生物学研究。
文档编号G01N1/28GK1912567SQ200610045429
公开日2007年2月14日 申请日期2006年7月10日 优先权日2006年7月10日
发明者张岩, 张立敬, 黄倢, 陈四清, 肖永双 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所