专利名称：用于检测活细胞活性的装置和方法
技术领域：
本发明一般涉及细胞检测，并且更具体地，涉及使用成像传感器的神 经元活性的荧光检测，并且涉及游动细胞类型的细胞活性的光学检测。
背景技术：
细胞学是涉及细胞的形成、结构和功能研究的生物学的一个分支。当 在实验室环境中应用时，科学家或其他医学专业人员研究细胞，例如，确 定细胞的机能或进行患者病症的医学诊断。
对微小生物样品例如培养的细胞的观察典型地通过显微镜进行。当记 录显微图像时，使用安装在显微镜上的照相机或摄像机。另外，尤其是如 果必须保持样品的温度和湿度不变，则可能需要接近显微镜位置安装或安 装在显微镜位置上的其它设备。这样的安排可能昂贵并且复杂。
已经开发了各种神经电子器件用于同时监测少量细胞的电活性。通常， 这些使用了具有细胞外微电路电极阵列的动作电位的细胞外记录；然而， 许多涉及了细胞间微电极的使用。神经元由穿透细胞壁的微米-尺寸电极所 刺穿。由创伤所导致的细胞死亡通常在电极插入的几个小时之内。这些方 法还限制在不能将它们扩展到非常大的阵列。
在美国专利公布2004/0219184中公开的神经电子器件依赖于用于监测 神经网络活性的处于细胞和检测器之间的静电耦合；由此将所述专利的全
部公开内容通过引用而结合在此。
此外，在美国专利号4,401,755、 4,985,353、 5,462,856、 5,919,646、 6,631,331、 6,770,449、 6,778,724和6,913,877中一般描述了各种检测和操作方法和/或诊断工具；由此将所述专利的全部公开内容通过引用而结合在 此。
因而，本发明的目的是提供用于有效检测细胞活性的装置、系统和方 法，而不用复杂而昂贵的光学元件。
发明概述
一般地，本发明涉及用于传感位置紧密接近成像传感器的活细胞的神 经元活性的装置、系统和方法。对细胞进行处理，使得它们将响应刺激而
发荧光或发光。在一个实施方案中，使用的细胞是神经元；然而，其它细 胞材料是预期的，并且在本发明的范围之内。本发明超越现有技术的一个 优点在于，在观察的培养基和检测器之间没有光学透镜。也没有用于调整 光的路径的反射镜。在检测器阵列和通过该阵列传感的区域之间存在一一 对应。
在一个方面中，本发明涉及用于检测细胞活性的系统。该系统包括用 于接收布置在成像检测器之上或附近的细胞材料的设备。用于接收细胞材 料的设备可以包括用于将细胞材料与成像检测器隔离的保护层和/或金刚 石状碳层。在各种实施方案中，成像检测器是传感器或传感器区域的阵列， 并且可以包括电荷耦合器件(CCD)、互补金属-氧化物半导体器件(CMOS)、 电荷注入器件(CD)、摄像机、二极管阵列或类似的器件。该系统还可以包 括用于收集和处理由该系统产生的数据的处理器、用于储存所述数据的存 储器、以及用于显示该数据的设备。
所述系统还可以包括光源，例如，诸如激光器、灯(例如白炽的、卤素 的或荧光的)、或发光二极管。光源可以提供处于各种波长或多重波长的光。 光源还可以包括电源；滤波器，例如陷波滤波器或二向色滤波器；以及用 于例如将通过光源供给的光束聚焦或校准的透镜。
在各种实施方案中，所述系统包括用于操作和/或处理细胞材料的设 备。例如，所述系统可以包括用于向细胞材料的环境引入气体的设备，或 用于从细胞材料的环境取样用于例如毒素的测试的设备。
在另一个方面中，本发明涉及一种检测细胞活性的方法。该方法包括 下列步骤提供这样的波长的光，所述波长的光适于从例如神经元细胞体中的双离子化钙离子((^++)追踪染料刺激荧光发射；收集发射的荧光的至
少一部分；关于传感器定位活化的神经元；以及表征检测信号的时间 (temporal)和/或振幅。
在一个实施方案中，发射的光的收集是通过在近场中直接位于细胞以 下的光-传感位点(像素)的阵列实现的，而不需要任何的光学传递组件，例 如透镜或反射镜。
在各种实施方案中，可以检测可能位于检测器的顶部之上，或在紧密 接近成像检测器的光亮的支架盘的下垂(lop)上的任意细胞过程。另外，可 以将细胞材料掺杂，或以别的方式处理。例如， 一些神经元可以用一种追 踪钙或钾离子的荧光物质处理，或该材料可以用用于离子追踪的电压-敏感 染料、用于追踪细胞离子通道或活细胞中离子运动的光子-发射化合物处 理。
通过参考下列描述和附图，这里公开的本发明的这些和其它目的，连 同优点和特征将变得明显。此外，应当理解的是，这里描述的各种实施方 案的特征不是相互排斥的，而是可以以各种组合和排列而存在的。
附图简述
在附图中，同样的参考标记在全部不同的视图中通常是指相同的部分。 另外，附图不必成比例、而重点一般是用于举例说明本发明的原则。在下 列描述中，通过参考下列附图描述本发明的各种实施方案，其中
图1是根据本发明的一个实施方案的用于检测细胞活性的器件的示意 性正视图2是根据本发明的一个实施方案的用于检测细胞活性的整个系统的 示意性表示；
图3是根据本发明的一个实施方案的用于检测细胞活性的器件的一部 分示意性正视图；和
图4是说明根据本发明的一个实施方案的检测细胞活性的方法的流程图。
发明详述以下描述本发明的实施方案。然而，清楚指出的是，本发明不限制于 这些实施方案，而是意图在于，还包括对于本领域技术人员显然的变化、 更改和等价物。例如，通过参考使用某些染料和荧光的细胞材料测量神经 元活性而典型描述这里公开的装置、系统和方法；然而，清楚指出的是， 可以用其它类型的细胞材料、染料和光源来实施本发明。
如图1中所示，将神经元(ioo)生长或放置在成像检测器或传感器(ioi)
的顶部上，而没有任何的居间透镜或反射镜、光纤或任何其它类型的光学 中继系统。装配成像传感器，使得它在其整个操作中不损伤神经元。例如，
可以在神经元和成像传感器之间放置惰性保护层(102)和金刚石状碳层 (111)。惰性保护层和金刚石状碳层的实例在美国专利公布2004/0219184
中有描述。
在细胞培育气氛(106)中，在液态细胞培养营养浴(105)中的细胞生长培 养基(104)中生长神经元。所述营养浴和气氛是封装的(103)并且由外部气体 源通过端口(107)以及外部液体源通过端口(108)所供给。可以通过任意必要 的管道或类似的运输设备将外部气体和液体源递送到适当的端口。该系统 还包括细胞液体排放口(109)、细胞气氛开关(110)和用于向细胞材料引入信 号的设备(120)。
当动作电位穿过细胞体传播时，产生荧光。 一些光将由成像传感器检 测，表明了神经元活性的存在。应当指出，这里所述的技术使用了荧光发 射光的光学检测，而决不依靠静电耦合。
成像检测器由可以传感光子的传感位点或像素的阵列组成。这样的器 件可以是CCD、 CMOS有源像素传感器，或适于可见的或近红外的成像 的具有传感位点阵列的任意其它器件。由于光子紧密接近成像传感器发 射，因此它们在近场中传播。
图2描绘了一个优选实施方案的整个系统布局图，包括成像器件和辅 助元件。可以在其它气体(210)和液体(220)中将培育气氛和营养流体混合。 这样，可以将所述器件用于测试毒素或液体或气体的不同化学药品对处于 培养下的细胞的影响。可通过传感器阵列检测的细胞行为上的变化将显示 对引入的化学药品的反应。该系统包括有助于用在此系统中的各种气体和 液体的引入、移出和监测的必要的阀和管件。下列描述是根据本发明的系统的一个实施方案的操作的一般描述。在 操作中，以标准方式使用成像器件(即，在需要时，将成像器的残留图像清 除，并且将成像器以其中它收集光子的曝光模式设定)；细胞以一些方式受
刺激或它们自-刺激，从而发光；以及将收集的光子转化为数字形式。
在一个具体实施方案中，成像器是首先被清除了任何累积电荷的 CCD。应当将它的钟波形设定为积分模式，其中光子在像素阱(pixel well) 中被转化为光电子。施加细胞刺激，荧光-刺激的辐射将照射该器件，并且 将发生曝光。在一段时期以后，曝光将终止，并且以标准方式读取CCD。 得到的图像将显示已经出现荧光的亮区域。
可以得到一系列图像，并且各种图像之间的差异将说明细胞活性上的 变化。这类似于检査连续的照片以辨别变化， 一种在许多不同科学领域中 长期使用的技术。例如，在20世纪早期，Henrietta Leavitt使用此技术来 发现附近星系中的变星。通过测量在亮度上变化的恒星的亮度，并且制作 它们随时间的位置和亮度变化表，她能够为超过1000颗变星分类。
本发明的各种实施方案包括使用来自Invitrogen(卡尔斯巴德，CA)的以 氟-3染料形式的离子指示荧光染料。这是一种钙离子追踪染料，其由结合 到双离子化钙离子(Ca—)的抗体组成。本领域普通技术人员将理解的是， 在本发明的上下文中，还可以使用以相同的一般方式起作用的其它的离 子、pH或电压指示染料。可以对神经元施加动作电位剌激信号(112)。在 神经元将动作电位沿它的细胞体传导到突触时，Ca^离子郁滞在动作电位 将跨越邻近突触的细胞体的区域中。通过用标称约490 nm的适当波长的 光照射细胞培养基，将由Ca^离子发射波长约505至约535 nm、峰值约 515nm的光。g卩，该515 nm的光将指示已经发放的神经元的位置。可以 通过光滤波器的放置来将此515 nm的光与490 nm的光区分，所述光滤波 器阻塞500nm以下的光，而透射500 nm以上的光。在此实施方案中，应 当将此滤波片放置在成像检测器(101)(在此情形中，CCD)和保护层(102) 之间。从神经细胞的底部至成像传感器的顶部的总距离应当小于约1 mm(参见图3)。图4在流程图中说明了上述过程。
在类似于刚刚描述的实施方案的一个备选实施方案中，没有使用光滤 波器。代替地，直接在细胞以下的像素中检测到的来自刺激细胞的稍微提高的光信号将指示神经信号已经在阵列中的何处通过。
在本发明的又一个实施方案中，电压-活化的染料可以代替荧光染料使 用。电压-活化的染料响应于电压中的变化并且发射光。可以将电压-敏感 染料注入到细胞中，或通过营养流体浴引入。当动作电位跨越处于检测下 的单个的神经元传播时，将会由染料发射光。将由活化的连续的神经元类 似地发射光。
在本发明的又一个实施方案中，可以使用除神经元之外的细胞类型。 将处理这些细胞，使得它们将响应于刺激或没有刺激而发荧光或发射其它 信号。该器件将允许系统的使用者(例如，科学家)迅速建立并量化化合物 对正在被研究的细胞的代谢影响。可以使用的细胞包括例如心肌细胞、内 皮细胞、上皮细胞和生殖细胞。
本发明的另一个实施方案将利用游动细胞类型例如肌肉细胞。 一个或 多个细胞的动态运动将被用作代谢活性的指示剂。细胞运动的检测可以通 过亮场、荧光或其它细胞照射方式来进行。
在前述实施方案中，可以将CCD用于传感直接放置在像素(芯片传感 器)的顶部上的心肌细胞的收縮比和振幅。可以通过收縮比率和振幅上的变 化(增加或减少)来传感毒剂。用于诱导心细胞收縮的刺激可以是，但不限 于，单独或与其它刺激组合的电场刺激、化学刺激或增加的细胞外的钾。
收縮的传感可以通过在用心细胞缀合的CCD上发光(亮场照射)来实现。 CCD将作为用于记录刺激-诱导的细胞收縮的照相机。除CCD传感器以外， 还预期可以放置在芯片上的其它传感器，例如纳米线或可以测量由肌细胞 或其它细胞产生的动作电位的其它电压敏感器件。
上述光源可以是任意的亮场直流电动力的发光器。此技术超越其它技 术的一个优点在于，不需要使用为了解析毒素对离子通道的影响的荧光或 静电检测方法。由于本发明不需要荧光，因此不需要荧光光源以及用于仅 看到由染料发射的荧光的光滤波器。此外，对于静电检测需要的消除去除 了对于对神经或肌肉细胞放电(动作电位)敏感的芯片的需求。本发明可以 使用单个的肌细胞或肌细胞的片。在缺乏和存在毒素的两种情况下都可以 分析在特定的刺激频率下的收縮数据，例如比率和振幅。
已经描述了本发明的某些实施方案，对于本领域的普通技术人员将显然的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以使用结合了这里公 开的概念的其它实施方案。所述的实施方案在各个方面上都应当认为仅是 说明性的，而非限制性的。
权利要求
1.一种用于检测活细胞活性的装置，所述装置包括固体支架，所述固体支架具有a)细胞生长培养基层；b)惰性保护层；c)光源；和d)检测器，e)用于收集和处理由所述系统产生的数据的处理器；f)用于储存所述数据的存储设备；和g)用于显示所述数据的显示设备，其中所述活性由所述装置检测，而不用任何的光学传递组件例如透镜或反射镜。
2. 根据权利要求1所述的装置，其中所述支架被封装，并且能够包含 液体生长培养基。
3. 根据权利要求2所述的装置，其中所述支架具有至少一个入口/出口 端口。
4. 根据权利要求1所述的装置，所述装置还包括插入所述细胞生长培 养基层a)和所述惰性保护层b)之间的金刚石状碳的层d)。
5. 根据权利要求1所述的装置，其中所述检测器能够检测光发射或透 射、电压变化、以及细胞运动。
6. 根据权利要求5所述的装置，其中所述检测器选自由下列组成的组 电荷耦合器件(CCD)、互补金属氧化物半导体器件(CMOS)、电荷注入器件 (CD)和二极管阵列，或类似的固态光子检测器件。
7. —种用于检测活细胞活性的装置，所述装置包括成像传感器(101)、 惰性保护层(102)、封装支架(103)、细胞生长培养基(104)、液体细胞培育 营养浴(105)、细胞培育气氛(106)、第一端口(107)和第二端口(108)、细胞 液体排放口(109)、细胞气氛开关(IIO)、光源(130)、以及用于向细胞材料 引入信号的设备(120)。
8. 根据权利要求7所述的装置，所述装置还包括插入所述细胞生长培养基层(104)和所述惰性保护层(102)之间的金刚石状碳层(111)。
9. 根据权利要求7所述的装置，所述装置还包括插入所述成像传感器 (101)和待检测的细胞(100)之间的光滤波器(300)。
10. 根据权利要求7所述的装置，所述装置还包括连接到气体混合阀 (210)的第一气体端口(205)，所述气体混合阀(210)还连接到第二气体端口 (200)，所述气体混合阀出口被连接到气体入口阀(215)然后连接到气体入口 端口(107)，所述装置还具有连通到装置(103)外部的连接到出口阀(220)的 气体出口端口(IIO)，另外，所述装置包括连接到液体混合阀(235)的第一液 体端口(230)，液体混合阀(235)还连接到第二液体端口(225)，所述液体混 合阀出口被连接到液体入口阀(240)然后连接到液体入口端口(108),所述装 置还具有连通到装置(103)外部的连接到液体出口阀(245)的液体出口端口 (109)。
11. 根据权利要求7所述的装置，所述装置还包括连通到装置(103)外 部的第一气体端口 ，所述第一气体端口通过滤器连接到流体入口端口 (109)，所述装置还具有连通到装置(103)外部的气体出口端口(107)，所述 装置还具有液体出口端口(108)。
12. —种用于检测活细胞中活性的方法，所述方法包括下列步骤a) 将关注的细胞放入到权利要求1的装置中；b) 允许所述关注的细胞吸收荧光指示剂染料达充分的时间；c) 使所述关注的细胞暴露于处于对应于所述指示剂染料的激发波长的 波长的光源；d) 检测处于对应于所述指示剂染料的发射波长的波长的发荧光的光发 射；和e) 分析发射的光的量。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述指示剂染料为氟-3或氟-4， 并且所述激发波长在490 nm和510 nm之间，以及所述发射波长在约505 nm和535 nm之间，优选约515nm。
14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述指示剂染料为钙指示剂染料。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述钙指示剂染料选自由氟衍生物(fluo derivative)染料、呋喃衍生物(fora derivative)染料、吲哚衍生物 (indoderivative)染料、rhod-2、钙绿和quin-2组成的组。
16. 根据权利要求12所述的方法，其中所述指示剂染料是离子指示剂 染料。
17. 根据权利要求12所述的方法，其中所述指示剂染料是电压或pH 指示剂染料。
18. 根据权利要求12所述的方法，其中所述关注的细胞是神经元细胞。
19. 根据权利要求12所述的方法，其中所述关注的细胞是非-神经元 细胞。
20. —种用于检测活细胞中活性的方法，所述方法包括下列步骤a) 将关注的细胞放入到权利要求1的装置中；b) 使关注的细胞暴露于光源；c) 在特定的时间间隔拍摄所述关注的细胞的图像，并且将所述图像储 存用于随后的分析；和d) 分析所述图像中的区别。
全文摘要
一种用于检测活细胞活性的装置，所述装置包括用于接收细胞(100)的细胞生长培养基层(104)和成像传感器(101)例如CCD阵列，其中所述细胞生长培养基层和所述成像传感器仅通过惰性保护层(102)和任选的金刚石状碳层(111)而相互分离。细胞可以由荧光染料例如钙、离子、电压或pH指示剂染料染色。在用光源(130)照射时，细胞发射荧光，所述荧光直接由成像传感器检测，而不需任何的光学传递元件例如透镜或反射镜。可以将该装置封入提供有气体和液体端口(107，108，109)的外壳(103)中。此外，该装置可以包括用于将刺激信号应用到细胞的设备(120)。
文档编号G01N21/64GK101310173SQ200680041273
公开日2008年11月19日 申请日期2006年9月29日 优先权日2005年9月30日
发明者凯文·T·C·吉姆, 凯文·休·金, 布里安·延, 汉克·吴 申请人:细胞生物工程公司