专利名称：磷酸化的cop1分子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于C0P1^JDNA损伤的诊断和治疗的领域。
背景技术：
在哺乳动物中，基因组的完整性是维持细胞和组织的动态平衡的先决条 件。因此， 一组专门的蛋白质已经被划入旨在抵抗潜在基因组扰动的联盟。 共济失调性毛细血管扩张症(A-T)是一种罕见的常染色体隐性疾病，患有该 病的个体带有细胞水平上的严重基因组不稳定性1。共济失调性毛细血管扩 张症突变型蛋白质激酶(ATM)中的突变与A-T有关，这暗示ATM是为维持基 因组完整性而构建的DNA损伤应答网络的重要成分2。 ATM部分地通过磷酸 化关键底物而发挥功能，这些底物包括p53、 BRCAl和Chk2。 ATM底物的磷 酸化在DNA损伤后和在肿瘤发生的早期被检测到9 。
肿瘤抑制物p53参与DNA损伤激活途径。缺乏p53的小鼠通常发生展现出 非整倍性的淋巴瘤和肉瘤，而仅能够细胞周期阻滞的带有突变型p53的小鼠 形成具有双倍体染色体数目的肿瘤11。 p53通过起到应激激活的转录因子的功 能，即诱导一组基因的表达，从而发挥其肿瘤抑制物的特性，这些基因的产 物参与细胞周期阻滞、衰老或凋亡。延緩具有碱基对突变的体细胞的增殖容 许细胞在其自身基因组复制或细胞分裂之前修复此类错配。ATM直接在N-末端在S15上磷酸化p5312,通过促进转录共激活物p300的募集来提高p53靶基 因的反式激活活性13。此外，ATM磷酸化MDM2和MDMX,降低它们负调节 p53的能力14—16。 p53受到E3遍在蛋白连接酶的负调节5，包括在乳腺癌和卵巢 癌中过表达的COP13，4。
发明概述
一方面，本发明提供通过斥企测细胞中的COPl多肽来冲全测包含ATM多肽 的细胞中的DNA损伤的方法，其中C0P1多肽被ATM多肽磷酸化或者相对于 对照来说COPl多肽水平降低指示存在DNA损伤。
ATM多肽可以是人ATM多肽和/或COPl多肽可以是人C0P1多肽。磷酸 化可以是丝氨酸磷酸化。COPl多肽可以用特异性结合COPl多肽(例如包括 与人COPl多肽的氨基酸残基377-400基本上相同的氨基酸序列的肽或包括与 人COPl多肽的丝氨酸387同源的氨基酸残基的肽)的抗体来检测。该肽中与 人C0P1多肽的丝氨酸387同源的可磷酸化的氨基酸残基可以被磷酸化。
该方法可以进一步包括检测ATM多肽，其中COP 1分子结合ATM分子指 示存在DNA损伤，和/或可以进一步包括检测COPl E3连接酶活性的激活、 COP1自我遍在蛋白化的激活、p53-COPl复合物的破坏、COPl依赖性p53遍 在蛋白化的下降、COPl的细胞质-细胞核比例的提高、COPl多肽的周转 (turnover),或COPl多肽的降解，和/或可以进一步包括"险测细胞中的p53分子， 其中相对于对照来说p53分子表达水平的上升或p53活性的升高指示存在 DNA损伤。p53分子可以是人p53分子和/或野生型p53分子。p53分子可以是 p53多肽。p53多肽可以用特异性结合p53多肽的抗体来检测。p53活性可以是 激活p53依赖性反式激活、激活p53诱导的凋亡、激活p21分子、-秀导p21启动 子、提高p21 mRNA的水平、或诱导尸t/M4启动子。
DNA损伤可能由辐射引起(例如致电离辐射或紫外线辐射、或放疗)， 或者由化学化合物引起(例如烷化剂诸如化疗剂)。细胞(例如癌细胞，诸 如乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌或移行细胞癌的细胞)可能存在DNA损伤 或者存在发生DNA损伤的风险。癌细胞可以从受试者(例如人)中获得，该 受试者正在接受癌症治疗或者已经暴露于辐射或化学化合物，该暴露可导致 DNA损伤。癌症治疗可以是已知或怀疑会导致DNA损伤的。
另 一方面，本发明提供通过将细胞暴露于增强COPl多肽降解的化合物 来增强细胞中对DNA损伤的应答的方法。化合物可以包括ATM分子，诸如已 活化的ATM多肽。化合物可以增强COPl多肽与ATM多肽结合或者增强ATM 多肽磷酸化COPl多肽。
另 一方面，本发明提供通过将COPl多肽和ATM多肽与增强COPl多肽结 合ATM多肽的化合物接触来增强COPl多肽与ATM多肽相互作用的方法。
在其它实施方案中，该方法可以进一步包括确定该结合是否会导致降解
COPl多肽、激活COPl E3连接酶活性、激活COPl自我遍在蛋白化、破坏 COPl-p53复合物、降低COPl依赖性p53遍在蛋白化、提高COPl多肽的细胞 质/细胞核比例、或提高p53分子的表达水平的步骤。接触可以增强细胞中对 DNA损伤的应答，诸如存在DNA损伤或者存在发生DNA损伤的风险的细胞 (例如A-T细胞或癌细胞)。对DNA损伤的应答包括细胞凋亡或p53激活。p53 激活可以是激活p53依赖性反式激活、激活p53诱导的凋亡、激活p21分子、 诱导p21启动子、或诱导尸t/M4启动子。COPl多肽可以是人COPl多肽和/或 ATM多肽可以是人ATM多肽。
本发明设想了如下化合物，其可以增强与人C0P1多肽的丝氨酸387同 源的氨基酸残基的磷酸化；和/或增强人COPl多肽的丝氨酸387的磷酸化。
本发明还提供COPl多肽或其片段，包括具有与人COPl多肽的丝氨酸 387同源的残基的多肽；包括与人COPl多肽的氨基酸残基377-400基本上相同 的序列的多肽；在能够被磷酸化的氨基酸残基(例如与人COPl多肽的丝氨 酸387同源的残基)上具有磷酸化的多肽；包括用苏氨酸、谷氨酸或天冬氨 酸替代与人COPl多肽的丝氨酸387同源的残基上的丝氨酸的COPl多肽；及 COPl模拟化合物。在一个实施方案中，该多肽包括在S387上包含变为其它 残基的残基变化的COPl多肽序列。
另 一方面，本发明提供一种用于鉴定增强包含ATM分子的细胞中对DNA 损伤的应答的化合物的方法，该方法在适合促进细胞中DNA损伤的条件下在 存在或缺乏测试化合物时温育COPl多肽，并确定存在测试化合物时COPl多 肽的降解是否被增强，其中增强COP 1多肽降解的化合物是增强对DNA损伤 的应答的化合物。该确定可以相对于对照来进行。ATM分子可以是能够磷酸 化COPl多肽的。
在其它实施方案中，该方法进一步包括确定该化合物是否增强激活 COP1 E3连接酶活性、激活COPl自我遍在蛋白化、破坏COPl-p53复合物、 降低COPl依赖性p53遍在蛋白化、提高COPl多肽的细胞质/细胞核比例、提 高p53活性、或提高p53分子表达水平的选项，其中此类增强指示该化合物是 增强对DNA损伤的应答的化合物。p53活性可以是激活p53依赖性反式激活、 激活p53诱导的凋亡、激活p21分子、诱导p21启动子、或诱导PUMA启动子。 适合促进DNA损伤的条件可以是辐射。对DNA损伤的应答可以包括细胞凋
亡或p53激活。
另 一方面，本发明提供用于鉴定能增强COPl多肽与ATM多肽的相互作 用的化合物的方法，该方法在存在或缺乏测试化合物时将C0P1多肽与ATM 多肽一起温育，并确定测试化合物是否增加或稳定COPl多肽结合至ATM多 肽，其中增加或稳定COPl多肽结合至ATM多肽的测试化合物是能增强COPl 多肽与ATM多肽的相互作用的化合物。
在其它方面，本发明提供基本上由与人COP 1的氨基酸残基377-400基本 上相同或同源的氨基酸序列组成的分离的肽，或基本上由图6中所示的氨基 酸序列组成的分离的肽。在其它实施方案中，该肽可以包含SQ基序中的丝氨 酸上的替代(例如天冬氨酸或谷氨酸替代)。
在其它方面，本发明提供包含与人C0P1多肽的S387同源的磷酸化的分 离的或重组的被磷酸化的COP 1肽，或在与人COP 1多肽的S387同源的氨基酸 残基上包含天冬氨酸或谷氨酸替代的分离的或重组的COPl肽，或COPl模拟 化合物。
在其它实施方案中，本发明提供编码按照本发明的肽或模拟物的核酸分 子。该核酸分子可以包含在载体中，被可操作地连接至启动子。该载体可以 进一步包含可操作地连接至启动子的ATM核酸分子。该载体可以在宿主细胞 中。
在其它方面，本发明提供一种抗体或其它试剂，其特异性结合与人COPl 的丝氨酸387同源的氨基酸残基被磷酸化的氨基酸序列。在其它实施方案中， 本发明提供编码该抗体的核酸分子；包含该核酸分子的载体，该核酸分子可 操作地连接至启动子；包含该载体的宿主细胞；和/或包含该抗体以及用于说 明如何检测细胞中的被磷S臾化的COPl分子的说明书的试剂盒。
在其它方面，本发明提供用于调控受试者中对DNA损伤的应答或p53活 性的药用组合物，包括包含本文所述多肽、肽或模拟物或者编码该多肽或肽 序列的核酸的组合物。
在其它方面，本发明提供哺乳动物细胞，其包含编码COPl分子的重组 核酸分子和编码ATM分子的重组核酸分子。该哺乳动物细胞可以进一步包含 编码p53分子的重组核酸分子。ATM分子可以是被激活的和/或COPl分子可 以是组成性被磷酸化或未磷酸化的(例如由于在S387上的突变)。
本发明还提供用于治疗需要该治疗的受试者中的DNA损伤或癌症的方
法，该方法包括给该受试者施用治疗有效量的本发明的肽或模拟物。另外，
本发明提供用于治疗需要该治疗的受试者中的DNA损伤或癌症的方法，该方 法包括给该受试者施用治疗有效量的化合物或编码多肽的核酸，其中该化合 物或多肽增强COPl多肽结合至ATM多肽或者增强ATM多肽磷酸化所述的 C0P1多肽。按照一个实施方案，该化合物或多肽特异性结合COPl。按照另 一个实施方案，该化合物或多肽特异性结合ATM。按照又一个实施方案，该 化合物或多肽特异性结合未被磷酸化的COPl。按照又一个实施方案，该化 合物以有效增加具有DNA损伤的细胞或癌中的COPl多肽磷酸化的量施用。
本发明提供通过本发明的方法鉴定的化合物。另外，本发明提供本发明 的肽、模拟物、核酸及化合物在制备用于治疗受试者中的DNA损伤或癌症的 药物中的用途。
附图简述
图1A-E证明C0P1在IR后被周转并且依赖于S387。 A，在暴露于IR时， C0P1的稳态水平下降。B，在暴露于IR时，C(9尸/mRNA水平未降低，但升 高了 。 C,根据环己酰胺(cyclohexamide)脉沖追踪术(pulse-chase)的评价，COP1 在IR^被周转。D, COPl上的潜在SQ基序。E， COPl-S387A对暴露于IR时
的降解有抗性。
图2A-K证明ATM负调节COPl 。 A,内源ATM可以在体外磷酸化含有S387 的COPl GST肽。B， ATM在体内磷酸化S387。 C， COPl在体内与ATM相互 作用，并且在DNA损伤后被增强。D， COPl的稳态水平下降依赖于ATM。 E, IR^S387上的COPl磷酸化依赖于ATM的激酶活性。F,夕卜源ATM促进Saos-2 细胞中的COPl的稳态水平下降。G, ATM诱导COPl下降受26S蛋白酶体的介 导。H， ATM促进激酶依赖性方式的COPl遍在蛋白化。I, COP1-C136/139S RING突变体对ATM诱导的降解有抗性。J， S387上的磷酸-模拟物在体外促 进COPl的自我遍在蛋白化。K， COPl-S387D展现出增强的周转能力。
图3证明ATM促进COPl定位至细胞质。A,在DNA损伤后，COPl以ATM 依赖性方式定位至细胞质。B, COP1-S387D主要定位至胞质区室。
图4A-I证明S387上的ATM修饰消弱p53的COPl负调节。A, B COPl与p53 相互作用在暴露于DNA损伤时被削弱。C, COPl-S387D结合p53的效率不太 高。D, p53展现出在体外结合COPl-S387D的能力下降。E， S387D突变抑制
COPl在体外遍在蛋白化p53。 F， COPl-S387D降解p53的效率不太高。G， COPl-S387D抑制p53依赖性反式激活的效力不太高。H， C0P1-S387D不能 负调节p53肿瘤抑制物功能。I,关于p53轴的ATMDNA损伤应答途径的模型。
图5证明全长COP 1上的S3 87是体外ATM磷酸化的主要位点。
图6证明在哺乳动物直向同源物中，S387上的COPl SQ3是高度保守的。
图7显示pS387 COPl抗体的ELISA表征。将lng各种肽包被到ELISA平板 上，加入不同浓度的pS387抗体。用HRP二抗和ECL检测结合肽的抗体。
图8用体外激酶测定法来表征pS387抗体。在存在和缺乏指定抑制剂时， 将FL AG-ATM与GST-COP 1或GST-COP 1 -S3 87A—起温育。
图9证明在Saos-2中共转染ATM时，内源COPl的稳态水平下降。用10ug ATM或ATM-KD转染24小时，并通过western印迹评价水平。
图10显示从HEK293T纯化的FLAG-COP1-WT、 FLAG-COPl-S387D、及 FLAG-COP 1 -RINGmt的SDS-PAGE的Imperial染色。
图11证明在IR处理后，COPl定位于细胞质。在用10GylR处理后H1299 细胞中的所转染FLAG-COP1的免疫荧光揭示了大比例的COP 1定位于细胞 质，而损失细胞核的COPl部分。通过曱醇固定和生物素-链霉亲合素放大法 进行免疫荧光，在Zeiss Axiovert 200M显微镜下使用Cy5滤光器(filter cube)进 行检测。用带有DAPI的Vectashield (Vector Laboratories)染色DNA。
发明详述
本发明部分地证明，在DNA损伤或者染色质结构发生改变后，ATM与 COPl相互作用并磷酸化COPl 。由ATM引起的此类共价修饰破坏COPl-p53 复合物，并且抑制由COPl引起p53肿瘤抑制物的遍在蛋白化、降解和负调节。 而且，COPl发生磷酸化占用了E3自我降解机制，从而将COPl从反式遍在蛋 白连接酶活性转变为顺式遍在蛋白连接酶活性，这是通过磷酸化活化 RING-E3连接酶的首个例子。COPl发生磷酸化还提高了COPl的细胞质/细胞 核定位比例。如此，ATM磷酸化COPl或者COPl降解都导致COPl负调节p53 依赖性肿瘤抑制物功能的能力下降。不受特定假设的限制，ATM磷酸化COPl 或者COPl降解可以进一步解释在A-T患者中p53途径对基因组异常的应答显 著延迟的原因(图41)。
因而，ATM磷酸化COPl或者COPl降解可用于检测DNA损伤。
本说明书描述了本发明的各种可选实施方案和实施例。这些实施方案和 实施例用于阐述目的，而不应解释为限制本发明的范围。
DNA损伤
"DNA损伤，，是指通过对DNA进行共价修饰或者使其偏离正常的双螺 旋构象，对DNA造成的、影响DNA的正常功能的伤害。DNA损伤包括干扰 复制和转录的结构畸变，以及可破坏碱基对和可改变DNA序列的点突变。通 常，当细胞发生DNA损伤时，细胞周期阻滞在两个检查点(G1/S或G2/M) 之一上。细胞周期阻滞会导致DNA修复程序激活(在发生相对较小DNA损 伤的情形下)，或者导致诱导凋亡(在发生灾难性DNA损伤的情形下)。
DNA损伤可由内源过程自发引起，诸如由正常代谢产生的反应性氧和自 由基引起的碱基氧化和DNA链断裂、碱基曱基化、脱嘌呤(例如由于DNA 在水中的反应)、脱嘧啶、在DNA复制过程中由DNA聚合酶引起的错配等。 DNA损伤还可由环境损害引起，诸如辐射(例如紫外线辐射、X射线、伽马 射线、致电离辐射)、天然毒素(例如植物毒素)、合成毒素、药物(例如癌 症化疗、放疗)、烷化剂等。
DNA损伤可导致多种病症或者可由多种病症引起，包括遗传性遗传病症 和暴露于环境损害而引起的病症。其中DNA损伤作为并发因素的病症包括共 济失调性毛细血管扩张症(A-T),也称作为路易斯-巴尔综合征(Louis-Bar syndrome或小月亩-目艮皮月夫毛纟田血管才广 长症(cerebello-oculocutaneous telangiectasia)、着色性干皮病(Xeroderma pigmentosa)、柯克凯内氏综合征 (Cockayne's syndrome)、毛发低疏营养不良(trichothiodystrophy)、范康尼氏贫 血(Fanconi's anaemia)、布卢姆氏综合征(Bloom's syndrome)、和阿耳茨海默氏 病(Alzheimer's disease)。 DNA损伤还可能由吸烟引起，导致例如心脏病，或 者由于其它疾病诸如癌症的治疗引起。
癌症
"癌症"、"赘生物"、"瘤形成"、"癌"或"肿瘤"是指不提供生理功能 的任何不期望的细胞生长。通常，赘生物或癌的细胞，如赘生性细胞，已经 不受正常的细胞分裂控制，即，细胞的生长或增殖不受细胞环境中的普通生 物化学和物理影响的调节，并展现出不受调节的生长、局部组织侵入、转移等等的特性。 一般地，赘生性细胞增殖而形成良性或恶性细胞的克隆。因此，
生长。"恶性"是指任何细胞类型或组织的异常生长或增殖。当与同类型的 正常细胞或组织相比时，恶性细胞或组织可能抑制退行发育或者丧失分化/ 定向，并可能展现出侵入和转移的能力。
大多数癌症属于三种广泛的组织学分类癌，其是主要的癌症，是上皮 细胞或者覆盖在器官、腺体或其他身体结构(例如皮肤、子宫、肺、乳腺、
前列腺、胃、肠)的外部或内部表面的细胞的癌症，并且其趋向于转移；肉 瘤，其衍生自连接性或支持性组织(例如骨、软骨、腱、韧带、脂肪、肌肉)； 和血液学肺瘤，其来自骨髓和淋巴组织。癌可以是腺癌(其一般在能够分泌 的器官或腺体中发生，诸如乳腺、肺、结肠、前列腺或膀胱)或者可以是鳞 状细胞癌(其源于扁平上皮并一般在身体的大部分区域中发生)。肉瘤可以 是骨肉瘤或骨源性肉瘤(骨)、软骨肉瘤(软骨)、平滑肌肉瘤(平滑肌)、 横紋肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜性内层)、纤维肉瘤(纤 维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)、脂肪肉瘤(脂肪组织)、胶质瘤 或星形细胞瘤(脑中发现的神经原性结締组织)、粘液肉瘤(原始的胚性结 締组织)、间充质或混合型中胚层肿瘤(混合型结締组织类型)。血液学肿瘤 可以是骨髓瘤，其源于骨髓中的浆细胞；白血病，其可以是"液体癌"并且 是骨髓的癌症，可以是髓细胞性或粒细胞性白血病(髓样的和粒细胞的白血 球)，淋巴性、淋巴细胞性或成淋巴细胞性白血病(淋巴样的和淋巴细胞的 血细胞)例如急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性单核细胞 白血病、急性前髓细胞白血病、慢性髓细胞白血病等，或者真性红细胞增多 或原红细胞增多(erythremia)(各种血细胞产物，但是主要是红血球)；或者 淋巴瘤，其可以是实体瘤并且其在淋巴系统的腺体或结中发生，其可以包括 何杰金(Hodgkin)或非何杰金淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt，s lymphoma) 等。此外，还存在混合型癌症，诸如腺鳞癌、混合型中胚层肿瘤、癌肉瘤或 畸胎瘤。
癌还可以根据它们的发源器官，即"原发性位点，，来命名，例如，乳腺、 脑、肺、肝、皮肤、前列腺、睾丸、膀胱、结肠和直肠、子宫颈、子宫等的 癌。即使癌症转移到不同于原发性位点的身体的另外部位时，也保留此类命 名，根据本发明癌症包括原发性癌症，以及已经转移的癌症。
根据原发性位点命名的癌症可以与组织学分类相关。例如，肺癌一般是
小细胞肺癌或非小细胞肺癌，其可以是鳞状细胞癌、腺癌或大细胞癌；皮肤
癌一般是基底细胞癌、鳞状细胞癌或黑素瘤，例如恶性黑素瘤。淋巴瘤可以 在与头、颈和胸相关的淋巴结中，以及在腹部淋巴结或在腋窝或腹股沟淋巴 结中出现。癌症的类型和阶段的鉴定和分类可以通过使用例如国家癌症学会
(http:〃seer.cancer.gov/publicdata/access.html )的Surveillance, Epidemiology and End Results ( SEER，即监偏^、流行病学和最终结果)程序(其是美国关 于癌症发生和存活的权威信息来源，并且是全世界公认的)提供的信息来进 行。SEER程序的发生率和存活率数据可用于获取特定癌症位点和阶段的标 准存活率。例如，为了确保最佳的比较组，可以从数据库中选择特定的标准， 包括诊断的日期和确切的分期。癌症的鉴定还可以通过^f吏用例如诊断手册诸 如The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 第17版，M.H. Beers和R. Barkow编，John Wiley and Sons, 1999中提供的信息来进行。
癌或赘生物的例子还可以包括但不限于本领域已知的转化的和永生化 的细胞、实体瘤、髓性增殖性疾病(myeloproliferative diseases)、母细胞瘤、 鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺 癌、肺的腺癌和肺的鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、 胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、 乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、浆液性腺癌、 子宫内膜样腺癌、透明细胞腺癌、粘液腺癌、伯伦纳瘤(Brenner tumor)、畸 胎瘤、无性细胞瘤、绒毛膜瘤、纤维瘤、粒层细胞瘤、塞-莱二氏细胞瘤 (Sertoli-Leydig cell tumor)、未分化的卵巢癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、 外阴癌、曱状腺癌、肝癌、胆门癌、阴茎癌、头和/颈癌、尤因氏肉瘤(Ewing，s sarcoma)、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi，s sarcoma)、月旨肪肉瘤、周围神 经上皮瘤、滑膜肉瘤、何杰金氏病(Hodgkin，sdisease)等，正如本领域知道的。
多肽、核酸分子、和化合物
按照本发明的化合物包括但不卩艮于COP 1或ATM的核酸分子、多肽和/或 其同种型(isoform)、变体、模拟物、同系物、类似物或片段。在有些实施方 案中，本发明还使用p53、 p21、和其它核酸分子、多肽和/或其同种型、变体、 模拟物、同系物、类似物或片段。
COPl化合物
"C0P1分子"在本文中指与以下各项基本上相同的分子COPl多肽； 编码C0P1多肽的核酸分子；CO尸7核酸分子；及其同种型、变体、模拟物、 同系物、类似物或片段。C0P1分子可以包括但不限于包含与以下各项登记 号所示序列基本上相同的序列的多肽或核酸分子AF508940 (人)、 AAH82804 (小鼠)、NP—036061 (小鼠)、NP_001001740 (人，同种型d24)、 NP—071902 (人，同种型a )、 XP—468011 (稻((9o^a ra^Va) )、 XP—468010 (稻)、 XP—463866 (稻)、AAM34692 (人)、AAH39723 (人)、BAB45239 (人)、 P_ABG08243 (人)、AAD51094 (小鼠)、^磨553 (油菜北京亚种CSm^/ca sw&; .尸A/"e"^) )、 CAA98718 (啤酒糖酵母)、CAA04168 (拟南芥 (」ra6^ / ^ Aa//awa))、 XM—477896 (稻)、XM—479164 (稻)、BK000438 (人)、AF508940 (人)、AF151110 (小鼠)、L24437 (拟南芥)、P_AAY60008 (人)、P—ABJ19398 (人)、P—ABB11576 (人)、P—ABG95247 (人)、 P—AAW74797 (人)、P—ABP69180 (人)、P—AAB92798 (人)、XP—064815 (人)、和/或P—AAG02591 (人)，及其同种型、变体、才莫拟物、同系物、类 似物或片段。COPl分子可以是在Bianchi等人6、 Wang等人7、或Yi等人"中记 载的分子。
"基本上相同的"序列指这样的氨基酸或核苷酸序列，其与参比序列的 不同仅有一个或多个保守替代，如本文中所讨论的，或者在不破坏所述氨基 酸或核苷酸序列的生物学功能的序列位置上存在一个或多个非保守替代、删 除或插入。当使用例如Align Program"或FASTA在氨基酸或核香酸水平上与 用于比较的序列进行最佳比对时，这样的序列可以是从10%到99%的任意数 值，或更一般地至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 55%或60%,或者至少 65%、 75%、 80%、 85%、 90%,或者95%，或者高达96%、 97%、 98%或99% 相同的。对于多肽来说，比较序列的长度可以是至少2个、5个、10个或15个 氨基酸，或者至少20个、25个或30个氨基酸。在其它实施方案中，比较序列 的长度可以是至少35个、40个或50个氨基酸，或者超过60个、80个或100个 氨基酸。对于核酸分子而言，比较序列的长度可以是至少5个、10个、15个、 20个或25个核普酸，或者至少30个、40个或50个核苦酸。在其它实施方案中， 比较序列的长度可以是至少60个、70个、80个或90个核苷酸，或超过100个、
200个或500个核香酸。序列同一性可以使用公众可获得的序列分析软件(例 如Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705的序列分析软件包或可乂人 National Library of Medicine获得的BLAST软件，或者如本文中所描述的)容 易地测量。有用的软件的例子包括程序Pile-up和PrettyBox。此类软件通过给 各种替代、缺失、插入及其它修饰赋予同源性程度来匹配相似序列。基本上 相同的序列包括同源序列，诸如本文中所描述的或本领域所知道的来自非人 物种的COPl相关序列。
或者/另外，如果两条核酸序列在高严格性条件下杂交，则它们是"基本 上相同的"。在有些实施方案中，高严格性条件是例如容许发生与如下条件 下的杂交具有可比性的杂交的条件，即使用长度为至少500个核苷酸的DNA 探针，在65。C的温度，在含有0.5MNaHPO4, pH7.2， 7%SDS， ImMEDTA 和1。/。BSA (级分V)的緩冲液中进行杂交，或者在42。C的温度，在含有48% 曱酰胺，4.8xSSC, 0.2MTris-Cl， pH7.6, lx Denhardt氏溶液，10%碌iJ交右 旋糖苷和0.1% SDS的緩沖液中进行杂交。(这些是用于高严格性northem或 Southem杂交的典型条件。)杂交可以执行约20 - 30分钟、或者约2-6小时、 或者约10-15小时、或者超过24小时或者更久的一段时间。高严格性杂交还 依赖于分子生物学家常规实施的许多技术的成就，诸如高严格性PCR、 DNA 测序、单链构象多态性分析和原位杂交。与northern和Southem杂交相比，这 些技术通常用相对短的探针进行(例如，通常约16个核苷酸或更长的用于 PCR或测序，而约40个核苷酸或更长的用于原位杂交)。用于这些技术中的 高严格性条件是分子生物学领域的技术人员所熟知的，其中的例子可见于例 如Ausubel等人8，该文献在此引入作为参考。
在有些实施方案中，人COP 1分子包括登记号为AF508940中所示的序列， 或其片段。
在有些实施方案中，人COPl核酸分子包括如下的序列或其片段
1 atgtctggta gccgccaggc cgggtcgggc tccgctggga caagccccgg gtcctcggcg
61 gcctcctcgg tgacttccgc ctcctcgtct ttatcctctt ccccgtcgcc gccttccgtg
121 gcggtttcgg cggcagcgct ggtgtccggc ggggtggccc aggccgccgg ctcgggcggc
181 ctcgggggcc cggtgcggcc tgtgttggtg gcgcccgccg tatcgggtag cggcggcggg
241 gcggtgtcca cgggcctgtc ccggcacagc tgcgcggcca ggcccagcgc cggcgtagga
301 ggcagcagct ccagcctagg cagcggcagc aggaagcgac ctctcctcgc ccccctctgc
3 61 aacgggctca tcaactccta cgaggacaaa agcaacgact tcgtatgccc catctgcttt
421gatatgattgtgtggccacagcttttgctacaagtgtatt
481catcagagttta_6Lta_ga_tgtcccaagtgtaactatgttgtggacaatatt
541gaccatctgtatcctaaitttcttggtgaatgaactcattcgcaaagattt
601ggttcaaattggaccactcagtgagtagcaiccaaitggccacaggtggcag
661atatttcaagattggttggggataaccttgatttggccaatgtcaatctt
721atgttggagttactagtgcscaactggaagcagastcaicatgcagcccaa
781ctacagattcttatggaattcctcaaggttgcaagaagaagcaactggaa
841ca_ga_tcca_ga_aggagctaagtgttttggaagaggatattaagagagtgga
901ggcttatactctcctgtcagacagtgcctcaatttgaagctccttctcca
961tcaica_ca_gta_gtattattgattccacagaatacagccaacctccaggtttcagtggcsigt
1021tctca_g￡ica_5iagaaacaigccttggtataatagcacgttagcatcaagacgaaLaacgactt
1081actgctcattttgaagacttggagcsgtgttacttttctacaaggatgtctcgtatctca
1141gatgacagtcgaactgcaagccagttggatgaatttcaggaatgcttgtccaagtttact
1201cgatataattcagtacgacctttagccacattgtcatatgctagtgatctctataatggt
1261tccagtatagtctctagtattgaatttgaccgggattgtgactattttgcgattgctgga
1321gtta_ca^a_ga_agattaaagtcta_tga^ta_tgacactgtcatccaggatgcagtggatatt
1381cattaccctggscctgcssttcgaaaatcagctgta_tcsgttggagtagt
1441taccataagaacctgttagctagcaigtgattatgaaggcactgttattttatgggatgga
1501ttcacaggacggtctatcaggagcatgagsagaggtgttggagtgttgac
1561tttaatttgatggatcctaaactcttggcttcaggttctgatg3tgca3asgtgaagctg
1621tggtctaccaatctagacaactcagtggcaagcattgaggca^3ggcta3tgtgtgctgt
1681gcccctcttccagataccatttggctttcggctgtgcagatcactgtgtc
1741cactactatgatcttcgtaaccaatcatggtattcaaagg
1801gcagtctcttatgcaaagtttgtgagtggtgaggaaattgtctctgcctcaacagacagt
1861tgtggaatgttactgcctacgttccttcaagggtcatatc
1921actttgtaggcctggcttccaatggagattatatagcttgtggaagtgaa
1981a_a_ta_a_ctctctctacctgtactttctaagactttgctaacttttaagttt
2041gatacagtcaaaagtgttctcgacaaagactgaatttgtt
2101agtgctgtgtgctggagggcactaccagatggggagtccaatgtgctgattgctgctaac
2161sgtcagggtscaattaaggtgctagaattggtatga
在有些实施方案中，人C0P1多肽包括如下的序列或其片段:
MSGSRQAGSGSAGTSPGSSAASSVTSASSSLSSSPSPPSVAVSA
VKSVLDKDRKEDDTNEFVSAVCWRALPDGESNVL工AANSGGTIKVLELV (丝氨酸387用下划线示出)
在有些实施方案中，COPl多肽可以包含人C0P1多肽的氨基酸377-400 或其片段。在有些实施方案中，COPl肽可以包括但不限于如下的序列 DSRTASQLDEFC、 SRTASQ、 RTASQ、 TASQ、 ASQ、 SQLDE、 SQLD、 SQL、 ASQL、 TASQLD、 RTASQLDE、或SRTASQLDEF,或者与它们基本上相同 的序列。在有些实施方案中，C0P1肽可以包括但不限于长度为3-20之间任 意数值的氨基酸的氨基酸序列，诸如5个氨基酸、7个氨基酸、IO个氨基酸、 12个氨基酸或15个氨基酸，其中该氨基酸序列包含与人COPl多肽的S387同 源的序列。
在有些实施方案中，COPl多肽能够直接结合ATM多肽，或能够直接寻皮 ATM多肽磷酸化。在有些实施方案中，COPl多肽可以包括与本文所示的氨 基酸序列基本上相同的、能够被ATM磷酸化的分子。在有些实施方案中， COP1多肽可以是在与人COPl多肽的S387同源的残基上被磷酸化或者能够 被磷酸化的多肽。与人COPl多肽的S387同源的序列描述在例如图6中。在有 些实施方案中，COPl分子包括在与人COPl多肽的丝氨酸387同源的氨基酸 残基上被组成性磷酸化的COPl多肽。在有些实施方案中，COPl分子包括这 样的COPl多肽，该多肽用人COPl多肽的丝氨酸387替代可磷酸化的氨基酸 残基。
"被磷酸化的"COPl蛋白或多肽上的任何能够在体内被磷酸化的氨基 酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸)在翻译后被修饰。在本发 明内容中，被磷酸化的C0P1多肽一般在与人C0P1多肽的丝氨酸387 (S387 ) 同源的氨基酸残基上被磷酸化。"不被磷酸化的"COPl多肽上的在体内可被 磷酸化的氨基酸残基上未被磷酸化，例如，将该残基突变为不能被磷酸化的 氨基酸。例如，在多肽序列中将丝氨酸突变为丙氨酸，生成在该多肽序列的 特定位置上不能被磷酸化的蛋白质。在与人C0P1多肽的位置387同源的位置 上用丙氨酸替换丝氨酸的COPl多肽就是这样的"不被磷酸化的，，COPl多肽。 不被磷酸化的COPl多肽还可以是能够在体内被磷酸化的多肽，例如在S387
上磷酸化，但是由于如下原因未被磷酸化的，例如存在抑制剂，例如激酶抑
制剂，诸如ATM激酶抑制剂；存在干扰磷酸化位点的抗体；或者由于磷酸酶 的活性。"被组成性磷酸化的，，COPl多肽是在与例如人COPl多肽的S387同 源的氨基酸残基上具有突变的多肽，该氨基酸残基在体内能够被^^酸化，其 中该突变模拟磷酸化该残基，并且所得多肽具有被磷酸化的多肽的生物学活 性。 一般地，将可被磷酸化的残基突变为谷氨酸或天冬氨酸残基，导致组成 性磷酸化。在有些实施方案中，被磷酸化的或被组成性磷酸化的C0P1肽可 以具有但不卩艮于如下序歹'J :DSRTA(pS/T/Y/D/E)QLDEFC 、 SRTA(pS/T/Y/D/E)Q 、 RTA(pS/T/Y/D/E)Q 、 TA(pS/T/Y/D/E)Q 、 A(pS/T/Y/D/E)Q、 (pS/TA7D/E)QLDE、 (pS/T/Y/D/E)QLD、 (pS/TA7D/E)QL 、 A(pS/T/Y/D/E)QL 、TA(pS/T/Y/D/E)QLD 、RTA(pS/T/Y/D/E)QLDE 、 SRTA(pS/TA7D/E)QLDEF，其中"pS/TA7D/E，，代表丝氨酸、苏氨酸或酪氨 酸的磷酸化，或者用可被磷酸化的丝氨酸替代天冬氨酸或谷氨酸。
在有些实施方案中，按照本发明的化合物包括COPl多肽的模拟物。通 常，模拟化合物以COPl多肽为基础，例如未被磷酸化的或者被磷酸化的 COPl多肽，例如与本文所述肽基本上相同的C0P1多肽或者在与S387同源的 氨基酸残基上被磷酸化的COPl多肽，并且可以包括具有例如肽样二级结构 的化合物。模拟化合物可以导致增强C0P1的活性或者选择性，或者可以展 现出降解特性被降低而延长模拟作用。模拟化合物可以是激动剂或拮抗剂 (抑制剂)。模拟化合物可以包括例如环肽、肽类似物、受约束的肽 (constrained peptide),支架模拟物、非肽模拟物、肽核酸等。模拟化合物可 结合ATM多肽，其结合亲和力为0.001pm - luM的任何数值，诸如至少 500nM、 100nM、 10 nM、 lnM、 500pM、 100pM、 10pM等。才莫拟化合物的 分子量可以小于2000Da，例如1500Da、 1000Da或500Da。例示性的COPl模 拟物化合物可以包括但不限于包括如下序列的化合物SRTASQ、 RTASQ、 TASQ、 ASQ、 SQLDE、 SQLD、 SQL、 ASQL、 TASQLD、 RTASQLDE、 SRTASQLDEF,包括其中"SQ"基序中的丝氨酸被磷酸化的或组成性磷酸 化的化合物，和/或其中肽结构或序列被本文所述或本领域所知的方式修饰的 化合物。在有些实施方案中，按照本发明的化合物包括C0P1模拟化合物， 其模拟被磷酸化的COPl分子或其被磷酸化的片段。
在有些实施方案中，按照本发明的化合物包括这样的抗体或其它试剂 (例如肽抗体(peptibody)),其特异性结合COPl,例如结合被磷酸化的COPl, 例如结合在与人COP 1多肽的丝氨酸387同源的氨基酸残基上^^皮磷酸化的 COPl肽，或者结合包括如下序列的肽SRTASQ、 RTASQ、 TASQ、 ASQ、 SQLDE、 SQLD、 SQL、 ASQL、 TASQLD、 RTASQLDE、 SRTASQLDEF。 例如，此类抗体可以是多克隆的或单克隆的，或者是人源化的抗体。此类肽 抗体可以是特异性结合融合至免疫球蛋白抗体(例如IgGl-4 )Fc部分的COPl 的肽。"特异性结合"抗原的抗体或其它试剂在识别并结合该抗原时，基本 上不识别和结合样品中的其它分子。例如，COPl抗体特异性结合COPl分子， 但是基本上不结合任何其它分子，例如存在于癌细胞或组织中或者具有DNA 损伤的细胞中的那些分子。在有些实施方案中，COPl抗体或其它试剂可以 特异性结合人COPl分子，但是不会特异性结合来自其它物种的COPl分子。 在有些实施方案中，COPl抗体或其它试剂可以特异性结合4皮石粦酸化的COPl 分子，但是不会特异性结合未被磷酸化的COPl分子。在有些实施方案中， COPl抗体或其它试剂可以特异性结合在特定氨基酸残基(例如人COPl多肽 的S387 )上被磷酸化的COPl分子，但是不会特异性结合在其它氨基酸残基 上被磷酸化的COPl分子。例如，特异性结合抗原的抗体或其它试剂对抗原 的亲和力可以比该抗体或试剂对样品中的其它参照分子的亲和力大至少IO 倍、100倍、1000倍或者10000倍。
在有些实施方案中，COPl分子包括COPl核酸分子，其编码COPl多肽， 或者编码特异性结合COPl多肽的抗体或其它试剂。
其它化合物
"共济失调性毛细血管扩张症突变的"或"ATM分子"在用于本文时指 与以下各项基本上相同的分子ATM多肽；编码ATM多肽的核酸分子；^r似 核酸分子；及其同种型、变体、模拟物、同系物、类似物或片段。ATM分子 可以包括但不限于包含与以下各项登记号所示序列基本上相同的序列的多 肽或核酸分子Q13315 (人)、NM_007499 (小鼠)、NMJ38292 (人)、 画—000051 (人)、画—114689(拟南芥)、BC022307(人)、BC061584 (人)、 XM_777432 (海月旦)、BC007023 (人)、XM—680015 (斑马鱼)、XM_236275 (大鼠)、AAB65827 (人)等。在有些实施方案中，ATM多肽被活化并具有 激酶活性。 一般地，ATM多肽能够磷酸化野生型COPl分子，或者在与人COPl
多肽的丝氨酸387同源的氨基酸残基上能够被磷酸化的COP1分子。例如， ATM激酶活性可以由DNA损伤产生，例如致电离辐射，或者能够引起DNA 损伤的化学化合物。ATM激酶活性可以如本文所述或者如本领域所知来评 价。在有些实施方案中，ATM分子包括ATM多肽或其片段，其能够结合和/ 或磷酸化COPl分子。
"p53"是一种有力的肿瘤抑制物蛋白，编码393个氨基酸的磷蛋白质。 p53在许多癌症中被负调节或被突变。p53的缺乏或失活可能促发癌症。存在 极其多种p53突变。"野生型，，p53是在正常的(即非癌性的)细胞中找到的 p53，或者没有与癌症相关的突变的p53。样品的p53状态(例如样品是否包 括野生型或突变型p53 )可以通过如例如Vogelstein等人的美国专利No. 6,090,566中所述或者使用标准技术诸如本文所述或本领域所知的来评估。 p53分子可以包括但不限于包含与例如登记号P04637所示序列基本上相同的 序列的多肽或核酸分子。
p21或"WAF1/Cipl"最初被描述为细胞周期蛋白(cyclin)依赖性激酶的 通用抑制剂。它由p53依赖性和p53非依赖性机制诱导，并已经被暗示作为细 胞增殖的抑制剂。
制备多肽、核酸分子、及测试化合物
本领域公知，可以在多肽结构中进行一些修饰和改变而基本上不改变该 肽的生物学功能，从而获得在生物学上等效的多肽，其具有例如期望的特性， 诸如增强的稳定性等。在本发明的一个方面，本发明的化合物还延伸至生物 学上等效的肽或模拟物，其与本发明的COP 1多肽的 一部分序列因为氨基酸 替代或其它不影响生物学功能的替代而存在差别。
例如，可以如下制备C0P1化合物，在C0P1肽或肽类似物或模拟物的任 何位置上替换、删除或插入一个氨基酸残基，例如在与人COPl多肽的丝氨 酸387同源的位置上，用其它保守氨基酸残基，即具有相似物理、生物学或 化学特性的残基，例如苏氨酸、谷氨酸或天冬氨酸，或者用非保守氨基酸残 基，替换人COPl多肽的丝氨酸387,并对化合物筛选例如结合ATM多肽的能 力、或被已活化的ATM多肽磷酸化的能力、或破坏p53/COPl复合物的能力。 此类化合物可用于本发明的诊断、治疗、筛选等任何方法。
在用于本文时，术语"保守氨基酸替代"指在肽的特定位置上用一种氨，其中该替代基本上不会使相关功能丧失。在进行此 类改变时，可以根据侧链取代基的相似性，例如它们的大小、电荷、疏水性、 亲水性等进行相似氨基酸的替代，而且可以通过常规测试来分析此类替代对 肽功能的影响。在有些实施方案中，保守氨基酸替代指用可被磷酸化的氨基 酸，诸如苏氨酸或酪氨酸，或者用磷酸化模拟物，诸如谷氨酸或天冬氨酸，
替换与人COPl多肽的丝氨酸387同源的氨基酸残基。
在用于本文时，术语"氨基酸"是指通常在天然存在蛋白质中找到的那些
L-氨基酸、D-氨基酸以及经过修饰的此类氨基酸。因而，本发明的氨基酸可 以包括例如2-氨基己二酸；3-氨基己二酸；(3-丙氨酸；P-氨基丙酸；2-氨基 丁酸；4-氨基丁酸；哌啶酸(piperidinic acid); 6-氨基己酸；2-氨基庚酸；2-氨基异丁酸；3-氨基异丁酸；2-氨基庚二酸；2,4-二氨基丁酸；锁链素；2,2，-二氨基庚二酸；2,3-二氨基丙酸；N-乙基甘氨酸；N-乙基天冬酰胺；羟基赖 氨酸；另'J-羟基赖氨酸；3-羟基脯氨酸；4-羟基脯氨酸；异锁链素；另'J-异亮 氨酸；N-曱基甘氨酸；肌氨酸；N-曱基异亮氨酸；6-N-曱基赖氨酸；N-曱基 缬氨酸；正缬氨酸；正亮氨酸；和鸟氨酸。
在有些实施方案中，可以进行保守氨基酸替代，其中一种氨基酸残基用 具有相似亲水性值的另一种氨基酸替代(例如，在±2.0、或±1.5、或±1.0、 或土0.5的数值之内)，其中为氨基酸残基指派具有约-1.6的水疗指数 (hydropathic index)的氨基酸，诸如Tyr (-1.3)或Pro (-1.6)(详情见美国专 利No. 4,554,101，在此引入作为参考)Arg(+3.0); Lys(+3.0); Asp (+3.0); Glu(+3.0); Ser(+0.3); Asn (+0.2 ); Gln (+0.2 ); Gly ( 0 ); Pro (画0.5 ); Thr(-0.4); Ala (-0.5 ); His (-0.5 ); Cys(-1.0); Met (-1.3); Val(-1.5); Leu (-1.8); lie (-1.8); Tyr (-2.3); Phe (-2.5);和Trp(画3.4)。
在其它实施方案中，可以进行保守氨基酸替代，其中一种氨基酸残基用 具有相似水疗指数的另一种氨基酸替代(例如，在±2.0、或±1.5、或±1.0、 或土0.5的数值范围之内)。在此类实施方案中，每种氨基酸残基可以根据它们 的疏水性和电荷特征被赋予如下水疗指数Ile( +4.5 ); Val( +4.2 ); Leu( +3.8 ); Phe(+2.8); Cys(+2.5); Met (+1.9); Ala (+1.8); Gly (-0.4 ); Thr (-0.7 ); Ser(-0.8); Tip (-0.9); Tyr (-1.3); Pro(-1.6); His (-3.2); Glu(-3.5); Gin (-3.5); Asp (-3.5); Asn (-3.5); Lys(-3.9);和Arg (-4.5 )。
在其它实施方案中，可以使用公众可获得的相似性矩阵家族来进行保守 氨基酸替代23-29。 PAM矩阵基于衍生自进化模型的计数，而Blosum矩阵利用 衍生自比对中高度保守部分的计数。在PAM或Blosum矩阵中，大于零的相似 性得分可以用来进行保守氨基酸替代。
在其它实施方案中，可以进行保守氨基酸替代，其中氨基酸残基用相同 类型的其它氨基酸替代，其中氨基酸如下分为非极性的、酸性的、碱性的和 中性的类型非才及性的Ala， Val, Leu, lie, Phe， Trp， Pro, Met;酸性的 Asp， Glu;石咸性的Lys， Arg, His;中性的Gly, Ser， Thr, Cys, Asn， Gln， Tyr。
保守性氨基酸改变包括用相应的D-氨基酸、保守的D-氨基酸或天然存在 的非遗传编码形式的氨基酸替代L-氨基酸，以及L-氨基酸的保守替代。天然 存在的、非遗传编码的氨基酸包括(3-丙氨酸、3-氨基-丙酸、2, 3-二氨基丙 酸、cc-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、N-曱基甘氨酸(肌氨酸)、羟脯氨酸、鸟 氨酸、瓜氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、N-曱基异亮氨酸、苯基甘氨 酸、环己基丙氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、2-萘基丙氨酸、吡咬基丙氨酸、 3-笨并噻吩基丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯 丙氨酸、青霉胺、1,2，3,4-四氢-异喹啉-3-羧酸、P-2-噻吩基丙氨酸、曱硫氨 基亚砜、高精氨酸、N-乙酰基赖氨酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、2，4-二氨 基丁酸、p-氨基笨丙氨酸、N-曱基缬氨酸、高半胱氨酸、高丝氨酸、半胱磺 酸(cysteicacid)、 s-氨基己酸、5-氨基戊酸、或2，3-二氨基丁酸。
在其它实施方案中，保守氨基酸改变包括基于亲水性或疏水性、大小或 容积、或者电荷考虑的改变。主要根据氨基酸侧链的性质，氨基酸一般可表 征为疏水性的或亲水性的。基于Eisenberg等人"的标准化共有疏水性尺度， 疏水性M酉殳展现出大于零的疏水性，而亲水性氨基酉g现出小于零的亲水 性。遗传编码的疏水性氨基酸包括Gly、 Ala、 Phe、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Met 和Trp，而遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr、 His、 Glu、 Gln、 Asp、 Arg、 Ser和Lys。非遗传编码的疏水性氨基酸包括叔丁基丙氨酸，而非遗传编码的 亲水性氨基酸包括瓜氨酸和高半胱氨酸。
疏水性或亲水性氨基酸可以基于它们的侧链的特征作进一步细分。例 如，芳香族氨基酸是具有含至少 一个芳香环或者杂芳香环的侧链的疏水性氨 基酸，其可以含有一个或多个取代基，诸如-OH、 -SH、 -CN、 -F、 -Cl、 -Br、 -1、 -N02、 -NO、 -NH2、 -NHR、 -NRR、 -C(O)R、画C(O)OH、 -C(O)OR、 -C(0)NH2、
-C(O)NHR、 -C(O)NRR等，其中R独立地是(C广Q )烷基、取代的(C广C6) 烷基、(C广Q)烯基、取代的(d-C6)烯基、(C'-C6)炔基、取代的(C广Q) 炔基、(C5-C20 )芳基，取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26 )烷芳基、取代的(C6-C26 ) 烷芳基、5-20元的杂芳基、取代的5-20元的杂芳基、6-26元的烷杂芳基、或 取代的6-26元的烷杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包括Phe、 Tyr和Trp,而 非遗传编码的芳香族氨基酸包括苯基甘氨酸、2-萘基丙氨酸、P-2-噻吩基丙 氨酸、1，2，3,4-四氢-异喹啉-3-羧酸、4-氯苯丙氨酸、2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙 氨酸和4-氟苯丙氨酸。
非极性氨基酸是具有在生理pH不带电荷的侧链的疏水性氨基酸，其具有 这样的键，在所述键中被两个原子所共有的一对电子一般由该两个原子的每 一个原子平等地持有(即侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包括 Gly、 Leu、 Val、 Ile、 Ala和Met，而非遗传编码的非极性氨基酸包括环己基 丙氨酸。非极性氨基酸可以进一步细分，其中包括脂肪族氨基酸，其是具有 脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸包括Ala、 Leu、 Val 和Ile,而非遗传编码的脂肪族氨基酸包括正亮氨酸。
极性氨基酸是具有在生理pH不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但其具有 一个这样的键，在该键中一对电子被两个原子所共有，其中一个原子比另一 个原子更紧密地持有该对电子。遗传编码的极性氨基酸包括Ser、 Thr、 Asn 和Gln,而非遗传编码的极性氨基酸包括瓜氨酸、N-乙酰基赖氨酸和曱硫氨 酸亚砜。
酸性氨基酸是侧链pKa值小于7的亲水性氨基酸。由于缺失了氢原子，酸 性氨基酸通常具有在生理pH带负电荷的侧链。遗传编码的酸性氨基酸包括 Asp和Glu。碱性氨基酸是侧链pKa值大于7的亲水性氨基酸。由于结合有氢离 子，碱性氨基酸通常具有在生理pH带正电荷的侧链。遗传编码的碱性氨基酸 包括Arg、 Lys和His,而非遗传编码的碱性氨基酸包括非环状氨基酸鸟氨酸、 2,3-二氨基丙酸、2, 4-二氨基丁酸、和高精氨酸。
本领域技术人员将领会，前述分类不是绝对的， 一种氨基酸可以被划分 入超过一个的种类。此外，可以基于已知表现和/或基于特定测定法的或与之 前鉴定的氨基酸进行比较的特征性的化学、物理，或生物学性质，对氨基酸 进行分类。氨基酸还可以包括具有氨基酸样侧链的双功能模块。
保守改变还可以包括用化学衍生化模块对非衍生化残基的替代，例如通
过氨基酸的功能性侧基的反应。因此，这些替代可以包括这样的化合物，其
游离氨基被衍生为盐酸胺(amine hydrochloride), p-曱苯石黄酰基(p-toluene sulfonyl group)、 千氧羰基(carbobenzoxy group)、 叔丁氧叛基 (t-butyloxycarbonyl group)、 氯乙酰基(chloroacetyl group)或曱酸基(formyl group)。类似的，游离羧基可以被衍生化，以形成盐、曱酯和乙酯或其它类 型的酯或酰肼，而侧链可以被衍生化，以形成游离羟基的O-酰基或O-烷基衍 生物，或组氨酸的咪唑氮的N-im-卡基组氨酸。肽类似物或模拟物还包括已 被化学改变的氨基酸，例如通过曱基化，通过由烷基胺诸如乙胺、乙醇胺或 乙二胺的C-末端氨基酸的酰胺化，或氨基酸侧链的酰化或曱基化(例如赖氨 酸的s氨基的酰化)。肽类似物或模拟物还可以包括用取代的酰胺(例如， 式-C(O)-NR的基团，其中R是(C广C6)烷基、(CrC6)烯基、(C广C6)炔基、 取代的(C广Q)烷基、取代的(CrC6)烯基、或取代的(C广Q)炔基)或 酰胺键的电子等排物(isostere)(例如-CH2丽-、-CH2S、 -CH2CH2-、 -CH=CH-(顺式和反式)、-C(0)CH2-、 -01(0印012-或-01280-)替换肽中的酰胺键。 化合物可以被共价连接，例如通过聚合或偶联(conjugation)，而形成同 聚物或异聚物。可以使用间隔物(spacers)和接头，其一般由小的中性分子， 诸如在生理条件下不带电荷的氨基酸组成。接头可以通过多种方式获得。例 如，可以在肽末端添加半胱氨酸残基，并通过受控的氧化可以共价地键合多 个肽。或者，可以使用异双功能试剂，诸如形成二^L化物/酰胺的试剂，或形 成硫醚/酰胺的试剂。化合物还可以被连接至其它化合物，所述其它化合物能 够例如耙向癌细胞或具有DNA损伤的细胞，或者抑制癌细胞或具有DNA损 伤的细胞的生长或增殖，或者诱导癌细胞或具有DNA损伤的细胞的死亡。还 可以通过具有环状的部分来约束化合物。
肽或肽类似物或模拟物可以通过标准化学技术来合成，例如通过使用液 相或固相合成方法的自动化合成。自动化肽合成仪可通过商业途径获得，并 且利用了本领域公知的技术。肽和肽类似物或模拟物也可以使用DNA重组技 术的标准方法来制备，诸如例如Sambrook等人"或Ausubel等人8中记载的那 些。
在有些实施方案中，本发明的化合物包括与COPl或ATM核酸分子或其 片段基本上相同的核酸分子，或者与COPl或ATM核酸分子或其片段互补的 核酸分子。例如，此类核酸分子可用作本发明的测定法和方法中的探针或引
物。"探针，，或"引物，，是具有确定序列的单链DNA或RNA分子，其可以与含有 互补序列(靶物)的第二DNA或RNA分子碱基配对。所得杂合分子的稳定性 取决于发生碱基配对的程度，并受到一些参数诸如探针与靶分子之间的互补 性程度和杂交条件的严格性程度的影响。杂交严格性程度受到一些参数诸如 温度、盐浓度和有机分子诸如曱酰胺浓度的影响，而且可通过本领域技术人 员公知的方法来确定。对本文所述核酸序列或其部分特异的探针或引物可以 在长度上不同，从至少8个核苷酸到超过500个核苷酸的任何整数，包括中间 的任何数值，取决于使用探针或引物的目的和条件。例如，探针或引物可以 是长度为8、 10、 15、 20或25个核苷酸，或者可以是长度至少为30、 40、 50 或60个核苷酸，或者可以是长度超过IOO、 200、 500或1000个核苷酸。对本 文所述核酸分子特异的探针或引物可以与本文所述核酸序列具有大于 20-30%的序列同一性，或至少55-75%的序列同一性，或至少75-85%的序列 同一性，或至少85-99°/。的序列同一性，或100%序列同一性。
探针或引物可以衍生自基因组DNA或cDNA序列，例如通过扩增，或衍 生自克隆的DNA区段，而且可以含有代表来自单个个体的单个基因的全部或 一部分的DNA或cDNA序列。探针可以含有独特的序列(例如与COPl或ATM 的核酸分子100%相同)和/或含有已知的序列。探针或引物可以化学合成。
探针或引物可以通过本领域技术人员已知的方法可4企测地标记，或是放 射性地或是非放射性地。探针或引物可用于牵涉核酸杂交的方法，诸如核酸 测序、通过聚合酶链式反应的核酸扩增、单链构象多态性(SSCP)分析、限制 性片段多态性(RFLP)分析、Southern杂交、northern杂交、原位杂交、电泳迁 移率变动测定法(EMSA)、和本领域技术人员已知的其它方法。
核酸分子还可以是反义分子、siRNA分子、或三股螺旋分子，其可以用 于例如降低细胞中的靶分子的表达。
在有些实施方案中，测试化合物包括有机小分子。"有机小分子"指天然 存在的或者合成的有机分子，其分子量超过约50道尔顿并低于约2500道尔 顿、优选低于约2000道尔顿、优选在100至约1000道尔顿、更优选在约200至 约500道尔顿。
在本发明的一些实施方案中，测试化合物包括肽、核酸分子、模拟物或
小分子、抗体或其它试剂，其能够介导COPl/ATM相互作用，例如磷酸化或 壯入
-口 口 o
文库或化学文库中鉴定候选或测试化合物。药物发现和开发领域的技术人员 会理解，测试提取物或化合物的确切来源对于本发明的方法而言不是至关重 要的。因而，事实上，可以使用本文所述例示性方法筛选任意数目的化学提 取物或化合物。此类提取物或化合物的例子包括但不限于基于植物、真菌、 原核生物或动物的提取物、发酵肉汤和合成化合物，以及现有化合物的修饰 形式。还能获得许多方法用于进行任意数目化合物(包括但不限于基于糖类、 脂质、肽和核酸的化合物)的随机或导向合成(例如半合成或全合成)。合 成化合物文库可以通过商业途径获得。或者，以细菌、真菌、植物和动物提 取物的形式存在的天然化合物文库可以通过商业途径从许多来源获得，包括
Biotics ( Sussex, UK)、 Xenova ( Slough， UK)、 Harbor Branch Oceanographic Institute (Ft. Pierce, FL， USA)、和PharmaMar (MA, USA )。此外，如果
希望，可以根据本领域已知的方法，例如通过标准的提取和分级方法，生产 天然的和合成生成的文库。更进一步地，如果希望，可以使用标准的化学、 物理或生物化学方法，很容易地修饰任何文库或化合物。
当发现一种新的粗提取物例如增强COPl/ATM相互作用时，为了分离产 生所观察到的效果的化学成分，进一步将阳性主导提取物(positive lead extract)分级是必需的。如此，提取、分级和纯化过程的目标是仔细表征和鉴 定粗提取物中具有COPl/ATM相互作用增强活性的化学实体。本文所述用于 检测化合物混合物中活性的相同测定法可用于纯化活性成分和测试其衍生 物。分级和纯化此类异质提取物的方法是本领域已知的。如果希望，可以根 据本领域已知的方法对已证明是治疗有用试剂的化合物进行化学修饰。被鉴 定为具有治疗、预防、诊断或其它价值的化合物随后可以使用例如癌症或辐 射损伤的任何动物模型进行分析。
诊断、治疗、预防和/或筛选的用途、测定法和试剂
根据本发明的化合物、组合物(例如，药用组合物)和方法可以用于诊 断或检测DNA损伤，用于调控受试者中对DNA损伤的应答和/或p53活性，或 者用于筛选或鉴定可用于调控受试者中对DNA损伤的应答和/或p53的测试 化合物。
在用于本文时，受试者可以是人类、非人灵长类、大鼠、小鼠、牛、马、
猪、绵羊、山羊、犬、猫、蝇、蠕虫等。受试者可以是临床患者、临床试验 志愿者、实验动物等。受试者可以是被怀疑患有或者存在患上癌症或DNA
损伤的风险的受试者、被诊断患有癌症或DNA损伤的受试者、或者被确认没 有患上癌症或DNA损伤的对照受试者、或者是被诱导患上DNA损伤或癌症 的受试者。在一个优选的实施方案中，受试者是人类。
正如在此讨论的，DNA损伤可以通过测量COPl表达水平的减少(其中 C0P1表达下降表明存在DNA损伤)或者通过测量COPl磷酸化(其中在与人 COP 1多肽的丝氨酸387同源的氨基酸上存在COP 1磷酸化表明存在DNA损 伤)来诊断或检测。
"检测"意图包括确定物质的存在与否，或量化物质的量。如此，该术语 指使用本发明的化合物、组合物和方法进行定性和定量的测定。通常情况下， 对于实施本发明而言，用于检测的特定技术不是至关重要的。例如，根据本 发明，"检测"可以包括使用本领域已知的或下文描述的方法检测COPl多 肽在例如与人COPl多肽的S387同源的氨基酸残基上的磷酸化的变化； CO尸八^rM、 p"或p53基因、基因组、或核酸分子，或者C0P1、 ATM、 p21 或p53多肽的存在或缺乏；CO尸7、 ^rM、 ； "或p"基因中的突变；COPl、 ATM、 p21或p53核酸分子的表达水平的变化，例如mRNA或多肽；COPl多 肽(例如，COPl连接酶活性、p53周转、p53依赖性反式激活活性的抑制) 或p53多肽(例如，p53结合、p53依赖性反式激活、COPl结合、p21的反式 激活等)的生物学功能/活性的变化。在有些实施方案中，"检测"可以包括检 测野生型p53。在有些实施方案中，"^r测"可以包括^:测突变型p53。；险测可 以包括量化与对照比较时在10%和90%之间的任何值、或者在30%和60%之 间的任何值、或者超过100%的变化(提高或降低)。检测可以包括量化与对 照比较时在2倍和10倍之间的任何值(包括两端点)，例如3倍、5倍、7倍或 更高，例如50倍或100倍的改变。
"增强"应答，或增强相互作用，例如结合或磷酸化，可以包括与对照相 比时促进应答或相互作用，或者提高早就存在的应答或相互作用，增量在 10%和90%之间、30%和60%之间，或者超过100%的任何值。增强可以包括 与对照相比时在2倍和10倍之间的任何值(包括两端点)，例如3倍、5倍、7 倍或更高，例如50倍或100倍的升高。例如，根据本发明"增强"可以包括使 用本领域已知的或下文描述的方法提高或促进COPl多肽在例如与人COPl
多肽的S387同源的氨基酸残基上的磷酸化的变化；COPl、 ATM、 p21或p53 核酸分子的表达水平的变化，例如mRNA或多肽；COPl多肽(例如，COP1 连接酶活性、p53周转、p53依赖性反式激活活性的抑制)或p53多肽(例如， p53结合、p53依赖性反式激活、C0P1结合、p21的反式激活等)的生物学功 能/活性的变化。
表述"降低"指相对于对照，例如相对于由没有实质性DNA损伤的细胞 正常产生的表达水平，特定分子例如COPl的多肽表达的降低。展现出COPl 分子表达降低的细胞还可以展现出p53分子(例如p53多肽)的表达升高、或 者p21分子(例如p21mRNA)的表达升高、或者p53或p21活性升高。此类升 高或降低可以是与对照相比时在10%和90%之间的任何值，或在30%和60% 之间的任何值，或者超过100%，或者可以是在2倍和10倍之间的任何值(包 括两端点)，例如3倍、5倍、7倍或更高，例如50倍或100倍的变化。过量表 达或升高，或者减少或降低的确切量不是至关重要的，只要该过量表达或降 低在统计学上是显著的。
"对照"包括用于确定基线表达或活性而获得的样品。因而，可以通过 许多方法从以下各项中获得对照样品没有DNA损伤(通过标准技术确定) 的细胞；非癌性细胞或组织，例如围绕受试者的肿瘤或癌细胞的细胞；未患 癌症或DNA损伤病症的受试者；未被怀lt存在患上癌症或DNA损伤的风险 的受试者；或衍生自此类受试者的细胞或细胞系。对照还包括早先已经建立 的标准物。因而，按照本发明进行的任何测试或测定法可以与所述已经建立 的标准物进行比较，可以不必每次都需要获得用于比较的对照样品。在体外 遍在蛋白化测定法中，对照可以是遍在蛋白化p53分子的能力下降的COPl分 子(例如，在连接酶结构域中存在缺陷的分子，例如COPlARing)。在体外 或体内激酶测定法中，对照可以是无激酶活性的(kinase-dead)ATM、已知被 磷酸化的或者未被磷酸化的C0P1分子、等等。
按照本发明的试剂包括本文中所描述的化合物。在有些实施方案中，本 发明涵盖包含本文所述化合物的细胞，例如哺乳动物细胞。例如，哺乳动物 细胞可以通过例如重组技术来改造以包括重组ATM、重组COPl和/或重组 p53分子。此类哺乳动物细胞可以用于例如筛选增强C0P1/ATM相互作用(例 如结合和/或磷酸化)、破坏p53/COPl结合、或者提高p53或COPl活性的测试 化合物。可以将此类细胞与测试化合物一起温育，测定细胞周期、ATM激酶
活性、p21表达、p53诱导的凋亡、p53依赖性反式激活、COPl连接酶活性等 方面的改变。可以使用基于报道物的构建体例如p21-营光素酶，以内部Renilla 萤光素酶报道物作为背景，采用实时RT-PCR技术。此类哺乳动物细胞可以 在现有的细胞系诸如例如p53野生型细胞系(U2-OS细胞)、p53缺乏的细胞 系(H1299)、 ATM缺乏的细胞系(GM02052或GM09607)中工程化，这些 细胞系可以被工程化来表达C0P1分子、ATM分子或p53分子。如此，COP1 或ATM分子可以在A-T细胞、癌细胞、组织或细胞溶解物中提供，或者可以 使用重组技术来构建。细胞和/或细胞系可以从商业来源获得，例如ATCC, Manassas ， VA， USA。
按照本发明的测定法可以在体内、体外或离体进行，使用来自标准来源 的样品并通过标准规程实施。可以使用微阵列，例如组织微阵列。可以在癌 症或DNA损伤的合适动物模型中进行体内测定法，该模型可以从例如The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, USA获得。
在有些实施方案中，可以使用在ATM、 COPl或p53的表达或活性方面存 在缺陷的动物模型。"样品"可以是分离自受试者的任何器官、组织、细胞 或细胞提取物，诸如分离自患有癌症或存在DNA损伤的哺乳动物的样品。例 如，样品可以包括但不限于从患者(人或动物)、测试受试者或实验动物获 得的细胞或组织(例如，来自活才企或尸4企)，其来自骨、脑、乳房、结肠、 肌肉、神经、卵巢、前列腺、视网膜、皮肤、骨骼肌、肠、睾丸、心、肝、 肾、胃、胰腺、子宫、肾上腺、扁桃体、脾、软组织、外周血、全血、红细 胞浓缩物、血小板浓缩物、白细胞浓缩物、红细胞蛋白质、血浆、富含血小 板的血浆、血浆浓缩物、血浆的任何级分的沉淀物、血浆的任何级分的上清 液、血浆蛋白质级分、纯化的或部分纯化的血液蛋白质或其它成分、血清、 精液、哺乳动物初乳、乳汁、尿液、粪便、唾液、脑脊液、心包液、腹膜液、 胎盘提取物、羊水、冷冻沉淀物、冷冻上清液、细胞溶解物、哺乳动物细胞 培养物或培养液、发酵产物、腹水、血细胞中存在的蛋白质、实体瘤或任何 其它标本、或其任何提取物。在有些实施方案中，可能期望将样品中的癌性 细胞与非癌性细胞分开，或者将存在DNA损伤的细胞与未受损伤的细胞分 开。
样品还可以包括但不限于用正常的或被转化的细胞(例如通过重组DNA 或单克隆抗体技术)通过细胞培养制备的产物。样品还可以包括但不限于从
非哺乳动物的受试者中分离的任何器官、组织、细胞或细胞提取物，诸如昆 虫或蠕虫。"样品"还可以是在试验条件下产生的、不是从受试者直接分离 的细胞或细胞系。样品还可以是无细胞的、人工衍生的或者合成的。样品可
以来自已知是癌性的或存在DNA损伤的、被怀疑是癌性的或存在DNA损伤 的、或者据信不是癌性的或不存在DNA损伤的(例如正常的或对照的)细胞 或组织。
COPl、 p53或ATM核酸分子或多肽的表达或活性，或者COPl/ATM或 COPl/p53的结合可以使用各种技术来测定，包括免疫组织化学(IHC)、原位 杂交(ISH)、 Northem印迹、聚合酶链式反应(例如实时定量PCR或RT-PCR)、 基于抗体的测定法诸如免疫沉淀、免疫荧光、Western印迹等。例如，对衍生 自样品的PCR产物进行的诸如测序、单链构象多态性(SSCP)分析或限制性片
沉淀、RIA、 ELISA或westem印迹可用于测量COPl或ATM或p53多肽的水平 或结合；northern印迹可用于测量COPl或p53 mRNA水平；或者PCR可用于 测量COPl或ATM或p53核酸分子的水平。此类测定法包括检测任何或所有形 式的COPl或ATM或p53，包括前体、片段(例如，由内切蛋白水解降解产生 的)、翻译后修饰形式等。本发明的方法涵盖对COPl相关生物学活性的测定， 诸如自我遍在蛋白化、p53降解、p53的遍在蛋白化、对p53反式激活的抑制、 对p53诱导的凋亡的抑制、p21 mRNA的减少等。本发明的方法涵盖对ATM 相关生物学活性的测定，诸如激酶活性。
在有些实施方案中，受试者中的细胞可以体内暴露于抗体(例如COPl 抗体，和任选的ATM抗体或p53抗体)，所述抗体4壬选纟皮可4企测地标记，例如 放射性同位素，而且该抗体对细胞的结合可以通过例如放射性的外部扫描或 活组织检查分析来评价。测定法可以使用可检测标记的分子来进行，即用于 标记和鉴定分子是否存在的任何手段，例如寡核苷酸探针或引物、基因或其 片段、肽、或cDNA分子。用于可检测地标记一种分子的方法在本领域是众 所周知的，包括但不限于放射性标记(例如用同位素，诸如"P或"S)和非 放射性标记(诸如酶标记，例如使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学 发光标记、荧光标记(例如使用荧光素)、生物发光标记、或对附着于探针 的配体的抗体检测。该定义中还包括通过间接手段可检测地标记的分子，例 如，结合有第一模块(诸如生物素)、继而与可被观察和测定的第二模块(诸如荧光素标记的链霉亲合素)结合的分子。标记物还包括洋地黄毒苷
(digoxigenin)、萤光素酶和水母发光蛋白。
在有些实施方案中，受试者中的细胞可以在体内暴露于本文所述COPl 化合物，以调控对DNA损伤的应答或p53活性。COPl化合物可以是编码COPl 多肽或其片段、类似物、模拟物或变体的核酸分子。
药用组合物、剂量、；sjfe用
小分子、模拟物、肽、或肽类似物)，其中存在脂质体、佐剂或任何药学上 可接受的载体，为适合于向哺乳动物(例如人、小鼠等)施用的方式。例如，
本发明的化合物可以用于调控受试者中对DNA损伤的应答、p53活性、COP1 活性或ATM活性。
在有些实施方案中，根据本发明的治疗性化合物包括C0P1分子或核酸 分子或其小分子、模拟物、肽或肽类似物，例如含有与人COPl多肽的S387 同源的可磷酸化的氨基酸残基的COPl多肽。根据本发明的化合物可以被长 期地或间歇地提供。"长期的"施用是指持续一段时间地施用该化合物，以代 替一个急性的短期剂量，以便维持最初的治疗效果(活性)。"间歇地"施用 是指治疗中的某段时期没有使用那种特定化合物。
可以采用常规的药物实践来提供合适的配制剂或组合物，以施用于患有 癌症或癌症前期症状的受试者。可以釆用任何合适的施用途径，例如，胃肠 外的、静脉内的、皮下的、肌肉内的、颅内的、眶内的、眼的、心室内的、 嚢内的、脊柱内的、鞘内的、脑池内的、腹膜内的、鼻内的、气雾、表面的 或口服施用。治疗用配制剂可以是液体溶液或悬浮液的形式；对于口服施用， 配制剂可以是片剂或胶嚢的形式；对于鼻内的配制剂，可以是粉剂、滴鼻剂 或气雾剂的形式。
本领域公知的制备配制剂的方法可以见例如"Remington's Pharmaceutical Sciences"(第19版)，A. Gen匿o编，1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa。胃肠外施用的配制剂可以例如含有赋形剂、无菌水 或盐水、聚(亚烃基)二醇诸如聚乙烯乙二醇、植物油或氩化的萘。生物相 容的、生物可降解的丙交脂聚合物、丙交脂/乙交脂共聚物、或聚氧乙烯-聚 氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。其它潜在有用的胃肠外投递系统包括乙烯-醋酸乙烯共聚物颗粒、渗透泵、可植入的输注系统、和脂质体。 吸入施用的配制剂可以含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是含有例如聚氧乙 烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是以滴鼻剂形式 或作为胶体施用的油性溶液。对于用于治疗或预防或防止瘤生长的组合物来
说，可以根据癌症及希望的结果，以足够防止、抑制或减緩DNA损伤或癌生
长或进展的量施用化合物。用于治疗肿瘤的化合物的效力的测量包括如下可
观察的和/或可测量的一项或多项的减少或消失含有DNA损伤的细胞数的 减少；癌细胞数的减少或癌细胞的消失，肿瘤大小的降低；癌细胞向周围器 官的浸润得到抑制(即防止、抑制、减緩或停止)；肺瘤转移得到抑制(即 防止、抑制、减緩或停止)；肺瘤生长在一定程度上得到抑制；和/或与特定 癌症相关的一种或多种症状在一定程度上得到减轻，以及发病率和死亡率降 低，或者癌细胞或含有DNA损伤的细胞的凋亡或细胞死亡增加。
根据本发明的化合物的"有效量"包括治疗有效量或者预防有效量。"治 疗有效量"是指对于获得期望的治疗结果是有效的量，其在剂量和时间上是 必需的，所述期望的治疗结果诸如如下 一项或多项可观察的和/或可测量的减 少或消失含有DNA损伤的细胞数的减少；癌细胞数的减少或癌细胞的消失， 胂瘤大小的降低；癌细胞向周围器官的浸润得到抑制(即防止、抑制、减緩 或停止)；肿瘤转移得到抑制(即防止、抑制、减緩或停止)；肺瘤生长在一 定程度上得到抑制；和/或与特定癌症相关的一种或多种症状在一定程度上得 到减轻，以及发病率和死亡率降低，或者癌细胞或含有DNA损伤的细胞的凋 亡或细胞死亡增加。化合物的治疗有效量可以随着某些因素而发生变化，诸 如个体的病情、年龄、性别和体重，以及化合物在个体中引发期望响应的能
力。可以调节剂量方案来提供最佳的治疗响应。治疗有效量也是这样一种量， 其中治疗上的有益效果胜过化合物的任何毒性或不利效应。"预防有效量"是 指对于获得期望的预防结果是有效的量，其在剂量和时间上是必需的，所述 期望的预防结果诸如如下一项或多项可观察的和/或可测量的减少或消失含 有DNA损伤的细胞数的减少；癌细胞数的减少或癌细胞的消失，肿瘤大小的 降低；癌细胞向周围器官的浸润得到抑制(即防止、抑制、减緩或停止)； 肿瘤转移得到抑制(即防止、抑制、减緩或停止)；肿瘤生长在一定程度上 得到抑制；和/或与特定癌症相关的 一种或多种症状在一定程度上得到减轻， 以及发病率和死亡率降低，或者癌细胞或含有DNA损伤的细胞的凋亡或细胞
死亡增加。典型地，在发生疾病之前或者在疾病发生的早期阶^L，对受试者 施用一剂预防剂量，因而预防有效量可以少于治疗有效量。化合物的治疗或
预防有效量的优选范围可以是0.1nM-0.1M、 0.1nM-0.05M、 0.05nM-15(iM或 0.01nM-10^M之间的任何数值。
需要注意的是，剂量值可以随着需要减轻的疾患的严重程度而变化。对 于任何特定受试者，可以根据个体的需要和施用组合物或监督组合物施用的 人员的专业判断，随时调节具体的剂量方案。本文所述剂量范围仅是例示性 的，医学从业人员所选择的剂量可以不受该限制。组合物中活性化合物的量 可以根据某些因素而发生变化，诸如个体的病情、年龄、性别和体重。可以 调节剂量方案来提供最佳的治疗响应。例如，可以施用单次推注(bolus)，可 以随着时间分开施用几个分剂(divided doses)，或者可以-f见所表现出来的治疗 情况的紧急事件而按比例减少或提高剂量。以剂量单位形式来配制胃肠外组 合物，对于使施用变得轻松和剂量均匀而言是有利的。
一般的，本发明的化合物的使用应当基本上不引起毒性。本发明化合物 的毒性可以使用标准技术来测定，例如通过在细胞培养物或实验动物中测 试，并确定治疗指数，即LD50 (对群体的50。/。致死的剂量)和LDIOO (对群 体的100%的致死的剂量)之间的比值。然而，在有些情况中，例如在严重 疾病的场合中，施用实质性过量的组合物可能是必需的。
在有些实施方案中，药用组合物可以包含编码本发明化合物(例如COPl 多肽或核酸分子或其小分子、模拟物、肽或肽类似物)的核酸分子，与药学 可接受载体相结合。此类药用组合物可以使用任何适当的技术来施用，例如 病毒载体系统。合适的病毒载体可以包括腺病毒、牛痘病毒或其它痘病毒、 疱渗病毒等，而且可以使用用于施用此类载体的任何技术。
实施例
实施例l:材料和方法
表达载体、重组蛋白和抗体
FLAG画COPl 、 pcDNA3.1+p53 、 ； "-Luc 、 k-Luc 、 pGEX4Tl画p53和 pGEX6Pl-COPl先前已有记载3' 21 。 GST-S387肽含有人COPl多肽的氨基酸 377-400，而GST-S387-A肽在S387上存在丙氨酸突变。FLAG-ATM和 FLAG-ATM-KD是Michael Kastan教4受(St. Jude Children's Research Hospital,
TN)惠赠的。所有突变体构建物是通过Quickchange定点诱变(Stratagene)生成 的。所有08丁重组蛋白是在大肠杆菌81^21(053)密码子+ (Stratagene)中表达， 接着用谷胱甘肽Sepharose 4B分批法(GE Healthcare)纯化的。抗p53 (DO-l) (Calbiochem)、抗p53 pS15 (Cell Signalling)、抗p21 (Ab-1) (Calbiochem)、抗 FLAG (M2) (Sigma),抗Myc (9E10) (Roche)、抗肌动蛋白质(ICN)、抗微管蛋 白(Ab6161) (Abcam)、抗组蛋白H1 (SC8030) (Santa Cruz Biotechnology),抗
COPl先前已有记载3， 22。抗pS387是QCB生成的兔多克隆抗体，使用肽 Ac-DSRTA(pS)QLDEFC-NH2作为抗原，并通过针对被磷酸化的和未被磷酸 化的肽进行序贯数轮亲和纯化来纯化。 细胞、转染和l艮道物测定法
U2-OS、 Saos-2、 HEK293T和H1299细胞购自ATCC，并在含有10。/。FBS 的McCoy，s 5A (Invitrogen)中维持。GM02052、 GM03490、 GM0637和GM09607 成纤维细胞从Coriell Cell Repositories获得，并在含有15% FBS的MEM (ATCC)中维持。所有转染使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)按照制造商的 推荐进行。对于用10 Gy IR处理的GM03490和M02052成纤维细胞或用100ng 各种COPl构建体转染的HEK293和U2-OS细胞，使用NE-PER试剂盒(Pierce) 进行细胞质和细胞核提取。为了评价COPl对p53稳态水平的影响，用渐增量 (0.5吗、l|ug和2g )的FLAG画COPl或FLAG-C0P1-S387D和150ng pcDNA3.1+p53转染Saos-2细胞。对于报道物测定法，用150ng pcDNA3.1+p53、 100ng/ "-Luc和10ng pRL-TK，用或不用渐增量(0.5)ug、 1 |ig和2fig )的pCMV-FLAG-COP 1或pCMV-FLAG-COP 1 -S3 87D瞬时转染 Saos-2细胞。双重萤光素酶测定法按照制造商(Promega)的推荐进行。 免疫沉淀、GST-下拉(pull down)测定法和脉冲追踪测定法 将细胞在放射免疫沉淀测定法(RIPA)緩冲液(0.1% SDS、 1% NP-40、 150mMNaCl、 0.5%脱氧胆酸盐、50mM Tris pH7.4、 lmMDTT和蛋白酶抑 制剂混合物)中溶解，预先澄清，并用靶抗体和蛋白A/GPLUS珠(SantaCruz Biotechnology)进行免疫沉淀。如下进行体外下拉测定法，在PBST(含有0.10/。 Tween 20和lmM DTT的PBS )中混合GST或GST-p53与从哺乳动物细胞中纯 化得到的FLAG-COPl或FLAG-COPl-S387D，并在室温下轻轻摇动温育l小 时。COPl所结合的蛋白质用FLAG肽(Sigma)洗脱，并进行SDS-PAGE，用抗
FLAG和抗GST进行免疫印迹。为了环己酰胺追踪实验，用lOOpg/ml CHX温 育细胞，并在指定时间点收获细胞。 体外遍在蛋白化和激酶测定法
从HEK293T细胞中纯化FLAG-COPl-WT或FLAG-COPl-S387D,并在含 有50mMTrispH7.5、 2mMATP、 5mMMgCl2、 20|iMZnCl2、 2mMDTT和2]LiM 遍在蛋白醛的緩沖液中与10iug遍在蛋白(BostonBiochem)、 2fig生物素化遍在 蛋白(Boston Biochem)、 20ng UbcH5b (A.G. Scientific) 、 20ng兔El (Sigma)— 起温育。若有指出，则在反应中包括100ng从大肠杆菌中纯化得到的GST-p53。 于30。C轻轻摇动温育2小时后，在含有1% SDS的PBST中使反应煮沸5分钟， 然后用PBST降低到0.1。/。 SDS,用于用抗FLAG或抗p53 (FL393) (Santa Cmz Biotechnology)进行的再次免疫沉淀。最后，对样品进行SDS-PAGE，接着用 链霉亲合素-HRP (Invitrogen)进行免疫印迹来检测COP 1或p53的遍在蛋白化 种类。如先前所述，用内源ATM和外源ATM实施激酶测定法。如指出的4吏 用渥曼青霉素(Calbiochem)和咖啡因(Sigma)。
菌落形成测定法
将H1299细胞铺入10cm皮氏培养皿，随后用指定的表达载体转染24小 时。在Zeocin ( 600吗/ml)中对被转染的细胞进行10天选择。然后去除培养 液，将菌落用PBS洗涤2次，于-20。C在冰冷的曱醇中固定10分钟，然后在吸 走曱醇后在0.5%结晶紫溶液中温育10分钟。随后将板用蒸馏水洗涤，并在空 气中晾干。在倒置显微镜中对包含超过20个细胞的染色菌落评分并计数。进 行三个独立实验，重复每次计数。
实施例2:暴露于IR时，COPl在翻译后被修饰
本发明人用GM0637成纤维细胞检查了在用10 Gy IR诱导DNA损伤后的 C0P1稳态水平。用COPl的抗体探查的溶解物揭示了COPl的稳态水平早在 IR后的30分钟时就开始下降，并在l小时时几乎消失(图1A)。值得注意的是， 随着COPl水平下降，p53的稳态水平上升，这与下游靶基因p21的激活是一 致的(图1A和1B)。为了揭示这种C0P1蛋白减少的机制，进行实时PCR来评 价CO尸/基因座上的基因活性。在IR刺激后，C(9尸7mRNA水平适度升高。p2/
量级远远大于CO尸7启动子。因此，这些数据意味着，COPl蛋白质水平下降
不能归因于C(9尸7 mRNA水平的降低。因此，进行环己酰胺(CHX)脉冲追踪 实验来确定这种调节是否是在翻"^后水平上的。在GM0637成纤维细胞中， COP1的半衰期超过30分钟，但是在将细胞暴露于IO Gy IR时，COPl的半衰 期显著缩短到刚刚超过7分钟(图1C)。这些数据表明，在暴露于IR时，COP1 是在翻译后被修饰的。
实施例3: COPl修饰^ATM依赖性的
由于ATM是DNA损伤信号传导途径的主要响应物，测定了潜在的ATM 磷酸化位点。在COPl上存在五种SQ基序(图1D);然而，由于将SQ3(S387) 上的丝氨酸残基突变为丙氨酸能够防止COPl的稳态水平在IR后下降，因此 SQ3 (S387)是最令人感兴趣的(图1E)。为了确定S387是否是ATM介导的石寿 酸化的真正靶物，从大肠杆菌中纯化GST肽，并用作体外激酶测定法的底物， 其中从ATM野生型或缺乏ATM的成纤维细胞中免疫沉淀ATM (图2A)。实际 上，ATM能磷酸化包含S387的肽(GST画C0P1-WT)和p53 S15 (GST-p53)， 这是经典的ATM底物17。相反，ATM不能磷酸化包含S387A突变的肽 (GST-COPl-A)。为了证实全长C0P1是ATM的底物，而S387是COPl上的主 要SQ位点，从大肠杆菌中纯化得到全长C0P1和C0P1-S387A，并在体外激酶 测定法中与重组ATM或ATM-KD—起温育(图5)。与COPl-S387A突变蛋白 相反，将COPl与ATM而不是ATM-KD—起温育，从COPl产生强大的磷酸信 号(phospho-signal)。这些数据暗示S387是体外ATM的主要位点。因此，在兔 子中生成针对被磷酸化的S387的多克隆磷酸特异性抗体，纯化，并通过4吏用 ATM进行的体外激酶测定法(图8 )和肽ELISA (图7 )表征。为了确定ATM 是否能在体内磷酸化COPl ，在用或不用ATM或ATM-KD时，用FLAG-COP1 转染HEK293T细胞。用FLAG抗体免疫沉淀溶解物，并用抗pS387抗体进行 western印迹(图2B )。当用ATM共转染时，仅检测到对应于pS387 COP 1的特 异性条带，而用X-磷酯酶处理时，该条带消失。
为了确定在体内是否存在ATM与COPl之间的相互作用，专一地用 FLAG-ATM或者与HA-COP 1 —起转染HEK293T细胞，并进行依托泊戒 (etoposide)诱导的DNA损伤或用DMSO媒介对照处理(图2C )。只有在用 FLAG-ATM转染HA-COPl时，抗HA珠下拉ATM,虽然是微弱的。然而，在 用依托泊甙处理细胞时，用HA-COPl下拉ATM的量得到惊人的增加，这表
明COP 1与ATM之间的相互作用可被DNA损伤诱导。为了评价IR后COP 1的稳 态水平下降和升高的周转(分别见1A和1C)是否可归因于ATM的存在，将 衍生自A-T患者的成纤维细胞(GM09607)用IR处理，并在各个时间点上》]欠 获，用于western印迹。有趣的是，在缺乏ATM的成纤维细胞中，COPl蛋白 的稳态水平下降是不完全的(defective)(图2D)。这与缺乏p53稳定性和对p21 蛋白的诱导是相关的。然后，用抗pS387抗体在ATM-WT和A-T成纤维细月包中 探查被ATM磷酸化的COPl (图2E)。值得注意的是，只有在存在能够-秀导 DNA损伤的药物博来霉素时，在ATM-WT成纤维细胞中检测到C0P1 pS387。 在ATM-WT成纤维细胞中检测到p53 pS15,但是在A-T成纤维细胞中几乎枱r 测不到p53pS15。在A-T细胞中检测不到pS387 COPl，这表明该位点的》务饰 是ATM依赖性的。
实施例4: S387上的ATM磷酸化通过促进自我遍在蛋白化，足以增加COPl 的周转
将外源ATM导入Saos-2细胞中，并评价外源和内源COPl蛋白的稳态水 平。导入外源ATM导致外源和内源COP 1蛋白显著下降(分别见图2F和图9 ), 与此相反，ATM-KD对外源和内源COPl的稳态水平不起任何作用。由于COPl 在暴露于IR后发生周转，本发明人希望查明这种由ATM介导的周转是否是通 过26S蛋白酶体实现的。因此，在用HA-COPl和FLAG-ATM转染后，用蛋白 酶体抑制剂处理Saos-2细胞(图2G)。 ATM的转染导致COPl惊人的减少；然 而，这可以通过用蛋白酶体抑制剂处理细胞来完全消除，表明ATM磷酸化 COP 1促进蛋白酶体依赖性COP 1降解。本发明人调查了 COP 1在应答ATM激 活时是否被遍在蛋白化。将H1299细胞用带HA标签的遍在蛋白、ATM或 ATM-KD、和COPl转染，并用蛋白酶体抑制剂预先处理以容许在收获溶解 物之前积累被遍在蛋白化的产物。用抗FLAG免疫沉淀COPl,用抗ELM企测 被遍在蛋白化的种类(图2H)。仅用COPl转染揭示了低丰度的可检测的遍在 蛋白产物；然而，与用ATM-KD共转染相反，当ATM与COPl—起共转染时， 出现代表被遍在蛋白化的COPl的实质性信号。鉴于ATM促进COPl的遍在蛋 白化并随后降解的事实，本发明人期望确定ATM是否能够发出COP1的RING 突变体(C136/139S)的降解信号，其基本原理在于如果COPl自身能够进行 自我遍在蛋白化，则ATM将不能促进RING突变体的COPl降解。将Saos-2细
迹评价COPl蛋白的稳态水平(图21)。如前面的实验所鉴定的，ATM引起 COPl的稳态水平急剧下降，而ATM-KD不产生任何作用。相反，RING突变 体对由ATM诱导的降解不起反应。这些数据暗示ATM磷酸化促进COPl自我 遍在蛋白化和随后的降解。为了进一步回答这个问题，生成C0P1-S387D突 变体，在该丝氨酸残基上模拟磷酸化，并从哺乳动物细胞中纯化得到(图10 )， 用于体外的自我E3遍在蛋白化测定法，其中使用COPl-WT和COPl-RING突 变体分别作为阳性和阴性对照(图2J)。 COPl-WT具有中等的自我E3活性， 而COPl的RING突变体不能够自我进行遍在蛋白化。相反，S387D COPl突 变体具备惊人的自我E3连接酶活性，并且与ATM磷酸化通过自我E3机制增 加COPl遍在蛋白化的想法一致。考虑到S387D突变体在体外的自我E3连接 酶活性增大，表明该突变体在体内以较快的速率周转。为了说明这种可能性，
验，在与CHX—起温育后，在指定的时间点上收集细胞(图2K)。溶解物的 Western印迹揭示了被转染的COPl的半衰期约为50分钟，比较而言，S387D 突变体被迅速周转，半衰期约为15分钟。因此，这些数据表明，ATM在S387 上的磷酸化足以通过促进自我遍在蛋白化来增加COP 1的周转。
本发明人使用免疫荧光检查在IR之前和之后外源COPl在H1299细胞中 的定位(图ll)。通过用DAPI共染色并重叠图象进行的评价，定位分析揭示 了COPl主要定位于细胞核区室。令人惊奇的是，在暴露于10Gy IR达2小时 后，COPl主要定位于细胞质区室。接着，本发明人通过野生型(GM03490) 或截短型ATM (GM02052 )的原代成纤维细胞中的生物化学级分评价内源 COPl的定位。与在H1299细胞中进行的外源C0P1研究一致(图IO)，在不使 用任何DNA损伤剂时，在野生型成纤维细胞和A-T成纤维细胞中，内源COPl 专一地定位于细胞核级分(图3A)。相反，在用依托泊戒处理时，大约50% 的COP1存在于GM03490成纤维细胞的细胞质级分，而从A-T成纤维细胞中未 检测到任何可检测的细胞质COPl。这些数据表明，COPl在细胞质区室中的 定位是ATM依赖性的。由于ATM具有在S387上磷酸化COPl的能力，本发明
人希望确定S387上的这种修饰是否足以引起细胞质定位。因此，在10GylR 处理之前和之后分析COPl-S387D的定位，并与HEK293T细胞中的野生型 COPl比较(图3B)。 WT-COPl以大约l:l的比例定位于细胞质和细胞核区室。 相反，在未添加任何DNA损伤剂时，C0P1-S387D蛋白展现出惊人的4:1的细 胞质/细胞核定位比例。此外，用IR处理细胞未能进一步提高COPl-S387D的 细胞质/细胞核比例，而WT-COP1的细胞质/细胞核比例从l:l升高到大约3:1 。
COPl的细胞质集合。
实施例6: COPl-S387D在降解p53和抑制p53依赖性基因反式激活方面被消 弱
将H1299细胞(p53一)用编码FLAG-COPl、有或无HA-p53的构建体转 染，并用博来霉素处理2小时，而COPl和p53之间的相互作用通过免疫沉淀
时揭示了结合至HA-珠；然而，在用博来霉素诱导DNA损伤时，这种相互作 用得到显著抑制。用相反的IP获得了类似结果，其中仅当共转染FLAG-COPl 时，HA-p53才被抗FLAG珠免疫沉淀(图4B)。考虑到COPl在DNA损伤后在 S387上被磷酸化，本发明人希望确定这种修饰是否在破坏p53/COPl复合物中 起作用。为此，本发明人通过免疫沉淀评价相对于WT-COPl， C0P1-S387D 突变体在细胞中是否保留了与p53形成复合物的能力(图4D)。 IP的Westem 印迹揭示了与WT-COPl相比，明显较少p53 (光密度分析法评定为约3倍)能 够与COPl-S387D复合。此外，本发明人能够使用纯化的COPl-S387D (图9) 及从大肠杆菌衍生的和纯化的GST-p53在体外重建这些观察结果，其中检测 到p53的结合下降约5倍(图4D)。尽管没有完全消除COPl与p53之间的相互 作用，但是显然S387的磷酸化使得COPl在体外和在体内结合p53方面下降了 至少约3倍。此外，这与COPl-S387D在体外遍在蛋白化p53的能力下降相关 (图4E)。因此，这些观察结果表明，ATM在S387上修饰COPl抑制COPl抑 制p53肺瘤抑制物功能的能力。因此，进行实验，在瞬时转染测定法中确定 COP1-S387D是否保留降解p53的能力。将Saos-2细胞用p53及渐增滴度的 C0P1-WT或C0P1-S387D转染(图4F)。收获并用抗p53进行westem印迹的溶 解物揭示了在共转染COPl-WT时，p53的稳态水平迅速下降，而共转染
C0P1-S387D时，p53水平仅略微下降。这些数据还与p21蛋白质水平和p21 基因反式激活能力相关(分别见图4F和图4G)。因此，这些数据暗示， COPl-S387D在降解p53和抑制p53依赖性基因反式激活方面被消弱。为了证 实这与适当的生理学读数(readout)相关，在H1299细胞中进行菌落形成测定 法来监测COP1-WT和COPl-S387D在抑制p53依赖性功能方面的长期效应 (图4H )。 p53的转染导致极少的存活菌落，而相对于仅转染p53 ( 6 x 103 cfu ) 和仅转染COPl-WT ( 72 x 103 cfu)，共转染COPl和p53导致了大量菌落的插-救(25 x 103 cfu)。明显相反，相对于仅转染p53 ( 6 x 103 cfb)和仅转染 C0P1-S387D ( 77 x 103 cfb),在与p53共转染时，C0P1-S387D未能恢复大量 菌落(6x 103cfU)。
参考文献
如下出版物在此引入作为参考。
1. Chun, H. H. & Gatti， R. A. Ataxia-telangiectasia, an evolving phenotype. DNA Repair (Amst) 3, 1187-96 (2004).
2. Shiloh, Y. ATM and related protein kinases: safeguarding genome integrity. Nat Rev Cancer 3, 155-68 (2003).
3. Dornan, D. et al. COPl， the negative regulator of p53， is overexpressed in breast and ovarian adenocarcinomas. Cancer Res 64， 7226-30 (2004).
4. Dornan， D. et al. The ubiquitin ligase COPl is a critical negative regulator of p53. Nature 429， 86-92 (2004).
5. Corcoran, C. A.， Huang, Y. & Sheikh, M. S. The p53 paddy wagon: COPl, Pirh2 and MDM2 are found resisting apoptosis and growth arrest. Cancer Biol Ther 3, 721-5 (2004).
6. Bianchi, E. et al. Characterization of human constitutive photomorphogenesis protein 1, a RING finger ubiquitin ligase that interacts with Jun transcription factors and modulates their transcriptional activity. J Biol Chem 278, 19682-90 (2003).
7. Wang H， Kang D, Deng X-W， and Wei, N: Evidence for functional conservation of a mammalian homologue of the light-responsive plant protein COPl. Current Biology 9:711-714， 1999.
8. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.， 1998.
9. Bartkova, J. et al. DNA damage response as a candidate anti-cancer barrier in early human tumorigenesis. Nature 434, 864-70 (2005).
10. Donehower, L. A. et al. Deficiency of p53 accelerates mammary tumorigenesis in Wnt-1 transgenic mice and promotes chromosomal instability. Genes Dev 9, 882-95 (1995).
11. Liu, G. et al. Chromosome stability, in the absence of apoptosis, is critical for suppression of tumorigenesis in Trp53 mutant mice. Nat Genet 36， 63-8 (2004).
12. Banin, S. et al. Enhanced phosphorylation of p53 by ATM in response to DNA damage. Science 281, 1674-7 (1998).
13. Dumaz， N. & Meek, D. W. Serine 15 phosphorylation stimulates p53 transactivation but does not directly influence interaction with HDM2. Embo J 18, 7002-10(1999).
14. Khosravi, R. et al. Rapid ATM-dependent phosphorylation of MDM2 precedes p53 accumulation in response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci US A96, 14973-7(1999).
15. Maya， R. et al. ATM-dependent phosphorylation of Mdm2 on serine 395: role in p53 activation by DNA damage. Genes Dev 15， 1067-77 (2001).
16. Pereg， Y. et al. Phosphorylation of Hdmx mediates its Hdm2- and ATM-dependent degradation in response to DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A 102， 5056-61 (2005).
17. Siliciano, J. D. et al. DNA damage induces phosphorylation of the amino terminus ofp53. Genes Dev 11, 3471-81 (1997).
18. Myers and Miller, CABIOS， 1989, 4:11-17.
19. Yi， C., Wang, H.， Wei， N. & Deng, X. W. An initial biochemical and cell biological characterization of the mammalian homologue of a central plant developmental switch, COPl. BMC Cell Biol 3, 30 (2002).
20. Bakkenist, C. J. & Kastan， M. B. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation. Nature 421, 499-506 (2003).
21. Dornan, D. et al. Interferon regulatory factor 1 binding to p300 stimulates DNA-dependent acetylation of p53. Mol Cell Biol 24, 10083-98 (2004).
22. Wertz, I. E. et al. Human De-etiolated-1 regulates c-Jun by assembling a CUL4A ubiquitin ligase. Science 303, 1371-4 (2004).
23. Altschul, S.F. . Amino acid substitution matrices from an information theoretic perspective. Journal of Molecular Biology, 219: 555-665 (1991).
24. Dayhoff， M.O., Schwartz, R.M., Orcutt, B.C. A model of evolutionary change in proteins In Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) M.O. Dayhoff (ed.)， 345 - 352， National Biomedical Research Foundation, Washington (1978).
25. States, D.J., Gish, W.， Altschul, S.F. Improved Sensitivity of Nucleic Acid Database Search Using Application-Specific Scoring Matrices, Methods: A companion to Methods in Enzymology 3(1): 66 — 77 (1991).
26. Steven Henikoff and Jorja G. Henikoff. Amino acid substitution matrices from protein blocks." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89(Biochemistry》10915 -10919(1992 ).
27. M.S. Johnson and J.P. Overington. A Structural Basis of Sequence Comparisons: An evaluation of scoring methodologies. Journal of Molecular Biology. 233: 716 - 738 (1993).
28. Steven Henikoff and Jorja G. Henikoff. Performance Evaluation of Amino Acid Substitution Matrices. Proteins: Structure, Function, and Genetics. 17: 49-61 (1993).
29. Karlin, S. and Altschul, S.F. Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 2264 - 2268 (1990).
30. Eisenberg et al" J. Mol. Bio. 179:125-142， 184).
31. Sambrook， et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2n ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989).
其它实施方案
尽管本文公开了本发明的各种具体实施方案，根据本领域技术人员的公 知常识，可以在本发明的范围内进行许多修改和变更。此类+务改包括用已知 的等效手段替换本发明的任何方面，从而以基本上相同的方式达到相同结 果。本文中所使用的登记号指来自多个数据库的登记号，对于核苷酸序列， 包括欧洲分子生物学实验室的(EMBL ) GenBank、日本DNA数据库(DDBJ ) 或基因组序列数据库(GSDB)，对于多肽序列，包括蛋白质信息资源(PIR)、 SWISSPROT、蛋白质研究基金(PRF)和蛋白质数据库(PDB)(来自已解 析结构的序列)，以及来自GenBank、 EMBL、 DDBJ或RefSeq的核苷S吏序列 的注明编码区的翻译物。数值范围包括限定该范围的端点数值。在本说明书 中，词语"包含"是开放式术语，基本上等同于术语"包括，但不限于"。在 本文中对参考文献的引用不应解释为承认这些参考文献是本发明的现有技 术。所有出版物引入本文作为参考，如同每篇出版物被具体地和分别地引入 本文作为参考，就像完整列在本文中一样。2005年12月31日提交的流水号为 60/755,412的美国临时专利申请同样完整收入本文作为参考。本发明包括基 本上如上所述和参考实施例和附图的所有具体实施方案及其变化形式。
权利要求
1. 一种检测包含ATM多肽的细胞中的DNA损伤的方法，该方法包括:检测细胞中的COP1多肽，其中相对于对照，所述ATM多肽磷酸化所述COP1多肽或者所述COP1多肽的表达水平下降，则指示存在DNA损伤。
2. 权利要求l的方法，其中所述ATM多肽是人的ATM多肽。
3. 权利要求l的方法，其中所述COPl多肽是人的COPl多肽。
4. 权利要求l - 3任一项的方法，其中所述磷酸化是丝氨S交磷酸化。
5. 权利要求l-4任一项的方法，其中所述C0P1多肽用特异性结合所述 COP 1多肽的抗体来检测。
6. 权利要求5的方法，其中所述抗体识别一种肽，该肽包含与人C0P1多肽 的氨基酸残基377-400基本上相同的氨基酸序列。
7. 权利要求5的方法，其中所述抗体识别一种肽，该肽包含与人COPl多肽 的丝氨酸387同源的氨基酸序列。
8. 权利要求6或7的方法，其中所述肽在与人C0P1肽的丝氨酸387同源的可 磷酸化的氨基酸残基上被磷酸化。
9. 权利要求l-8任一项的方法，进一步包括检测所述ATM多肽，其中所述 COPl分子结合所述ATM分子指示存在DNA损伤。
10. 权利要求l - 9任一项的方法，进一步包括检测由COPl E3连接酶活性的 激活、C0P1自我遍在蛋白化的激活、p53-COPl复合物的石皮坏、COP1 依赖性p53遍在蛋白化的降低、C0P1的细胞质-细胞核比例的提高、C0P1 多肽的周转、COP 1多肽的降解组成的组中的 一项或多项。
11. 权利要求l - 10任一项的方法，进一步包括检测所述细胞中的p53分子， 其中相对于对照，所述p53分子表达水平的升高或p53活性的增大指示存 在DNA损伤。
12. 权利要求ll的方法，其中所述p53分子是人p53分子。
13. 权利要求11或12的方法，其中所述p53分子是野生型p53分子。
14. 权利要求ll _ 13任一项的方法，其中所述p53分子是p53多肽。
15. 权利要求14的方法，其中所述p53多肽用特异性结合所述p53多肽的抗体 来斗企测。
16. 权利要求ll - 15任一项的方法，其中所述p53活性选自由激活p53依赖性 反式激活、激活p53诱导的凋亡、激活p21分子、诱导p21启动子、提高 p21 mRNA水平、和i秀导尸t/M4启动子组成的组中的一项或多项。
17. 权利要求l - 16任一项的方法，其中所述DNA损伤是由辐射或化学化合 物引起的。
18. 权利要求17的方法，其中所述辐射是致电离辐射或紫外线辐射。
19. 权利要求17的方法，其中所述辐射来自放疗。
20. 权利要求17的方法，其中所述化学化合物是烷化剂或化疗剂。
21. 权利要求l - 20任一项的方法，其中所述细胞存在DNA损伤或者存在发 生DNA损伤的风险。
22. 权利要求l-21任一项的方法，其中所述细胞是癌细胞。
23. 权利要求22的方法，其中所述癌细胞选自由乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、 肺癌和移行细胞癌的细胞组成的组中的一项或多项。
24. 权利要求22或23的方法，其中所述癌细胞从正接受癌症治疗的受试者中 获得。
25. 权利要求24的方法，其中所述癌症治疗已知会导致DNA损伤或者被怀疑 会导致DNA损伤。
26. 权利要求24或25的方法，其中该受试者是人。
27. 增强细胞中对DNA损伤的应答的方法，该方法包括将细胞暴露于增强 COPl多肽降解的化合物。
28. 权利要求27的方法，其中所述化合物包括ATM分子。
29. 权利要求28的方法，其中所述ATM分子是已活化的ATM多肽。
30. 权利要求27的方法，其中所述化合物增强所述COPl多肽结合至ATM多 肽或增强ATM多肽磷酸化所述COPl多肽。
31. 增强COPl多肽与ATM多肽的相互作用的方法，该方法包括将所述COPl 多肽和所述ATM多肽与 一种化合物接触，该化合物增强所述C0P1多肽 结合所述ATM多肽。
32. 权利要求30或31的方法，其中所述结合引起如下的一项或多项降解所 述C0P1多肽、激活COPl E3连接酶活性、激活COPl自我遍在蛋白化、 破坏COPl-p53复合物、降低COPl依赖性p53遍在蛋白化、提高COPl多 肽的细胞质/细胞核比例、和提高p53分子的表达水平。
33. 权利要求31的方法，其中该接触增强细胞中对DNA损伤的应答。
34. 权利要求27 - 30和33任一项的方法，其中该细胞存在DNA损伤或者存在 发生DNA损伤的风险。
35. 权利要求34的方法，其中所述细胞是A-T细胞。
36. 权利要求34的方法，其中所述细胞是癌细胞。
37. 权利要求27 - 30和33 - 36任一项的方法，其中所述对DNA损伤的应答包 括细胞凋亡或p53激活。
38. 权利要求37的方法，其中所述p53激活选自由激活p53依赖性反式激活、 激活p53诱导的凋亡、激活p21分子、诱导p21启动子、和诱导尸t/M4启动 子组成的组中的 一项或多项。
39. 权利要求26- 38任一项的方法，其中所述C0P1多肽是人C0P1多肽。
40. 权利要求28 - 39任一项的方法，其中所述ATM多肽是人ATM多肽。
41. 权利要求27-40任一项的方法，其中所述化合物增强对与人C0P1多肽 的丝氨酸387同源的氨基酸残基的磷酸化。
42. 权利要求41的方法，其中所述化合物增强对人COPl多肽的丝氨酸387的 磷酸化。
43. 权利要求27-42任一项的方法，其中所述化合物包含COPl多肽或其片 段，该COPl多肽或其片段包含与人COPl多肽的丝氨酸387同源的残基。
44. 权利要求27-42任一项的方法，其中所述化合物包含一种多肽，该多肽 包含与人COPl多肽的氨基酸残基377-400基本上相同的序列。
45. 权利要求43或44的方法，其中所述化合物在能够被磷酸化的氨基酸残基 上包含磷酸化。
46. 权利要求45的方法，其中所述氨基酸残基与人COPl多肽的丝氨酸387同源。
47. 权利要求27-42任一项的方法，其中所述化合物包含一种COPl多肽， 该COP 1多肽在与人COP 1多肽的丝氨酸387同源的残基上包含用苏氨 酸、谷氨酸或天冬氨酸替代丝氨酸。
48. 权利要求27-42任一项的方法，其中所述化合物包含一种COPl模拟化 合物。
49. 鉴定在包含ATM分子的细胞中增强对DNA损伤的应答的化合物的方法， 该方法包括在适合促进细胞中的DNA损伤的条件下，在存在或缺乏测试 化合物时，温育COPl多肽，并确定在存在所述测试化合物时，所述COPl 多肽的降解是否被增强，其中增强所述COPl多肽降解的化合物是增强对DNA损伤的应答的化合物。
50. 权利要求49的方法，其中所述确定是相对于对照而作出的。
51. 权利要求50的方法，其中所述ATM分子能够磷酸化所述COPl多肽。
52. 权利要求49-51任一项的方法，进一步包括确定由COPl E3连接酶活性 的激活、COP1自我遍在蛋白化的激活、COPl-p53复合物的破坏、COP1 依赖性p53遍在蛋白化的降低、COP1多肽的细胞质/细胞核比例的提高、 p53活性的升高、和p53分子表达水平的升高组成的组中的一项或多项是 否被所述化合物增强，其中此类增强指示所述化合物是增强对DNA损伤 的应答的化合物。
53. 权利要求52的方法，其中所述p53活性选自由激活p53依赖性反式激活、 激活p53诱导的凋亡、激活p21分子、诱导p21启动子、和i秀导PUMA启 动子组成的组中的 一 项或多项。
54. 权利要求49-53任一项的方法，其中适合促进DNA损伤的条件是辐射。
55. 权利要求49 - 54任一项的方法，其中对DNA损伤的应答包括细胞凋亡或 p53激活。
56. 用于鉴定增强COPl多肽与ATM多肽的相互作用的化合物的方法，该方 法包括a) 在存在或缺乏测试化合物时，将COPl多肽和ATM多肽一起温育；并b) 确定该测试化合物是否增加或稳定所述COPl多肽结合至所述ATM 多肽，其中增加或稳定所述COPl多肽结合至所述ATM多肽的测试化合物是增 强COPl多肽与ATM多肽的相互作用的化合物。
57. —种分离的肽，其基本上是由与人COP1的氨基酸残基377-400基本上相 同或同源的氨基酸序列组成的。
58. —种分离的肽，其基本上是由图6中所示的氨基酸序列组成的。
59. 权利要求57或58的肽，其中所述肽包含对SQ基序中的丝氨酸的替代。
60. 权利要求59的肽，其中所述替代是天冬氨酸或谷氨酸替代。
61. 分离的或重组的被磷酸化的COPl肽，其包含与人COPl多肽的S387同源 的磷酸化。
62. 分离的或重组的被磷酸化的COPl肽，其在与人COPl多肽的S387同源的 氨基酸残基上包含天冬氨酸或谷氨酸替代。
63. 权利要求57 - 62任一项的肽的COPl模拟化合物。
64. 编码权利要求57 - 62任一项的肽或权利要求63的模拟物的核酸分子。
65. —种载体，其包含可操作地连接到启动子上的权利要求64的核酸分子。
66. 权利要求65的载体，进一步包含可操作地连接至启动子的ATM核酸分 子。
67. —种宿主细胞，其包含权利要求65或66的载体。
68. 特异性结合一种氨基酸序列的试剂，该氨基酸序列在与人COPl的丝氨 酸387同源的氨基酸残基上被磷酸化。
69. 按照权利要求68的试剂，其中该氨基酸序列是S387被磷酸化的人COPl。
70. 按照权利要求69的试剂，其中该试剂是抗体。
71. 编码权利要求68的试剂或权利要求70的抗体的核酸分子。
72. —种载体，其包含可操作地连接至启动子的权利要求71的核酸分子。
73. —种宿主细胞，其包含权利要求72的载体。
74. —种试剂盒，其包括权利要求68的试剂或权利要求70的抗体，以及使用 说明书，该使用说明书对检测细胞中的被磷酸化的COPl分子进行说明。
75. —种药用组合物，其包含权利要求57-62任一项的肽或权利要求63的模 拟物或编码该肽或才莫拟物的核酸序列。
76. 治疗需要治疗的受试者中的DNA损伤或癌症的方法，该方法包括给该受 试者施用治疗有效量的权利要求57 - 62任一项的肽或者权利要求63的 模拟物。
77. 治疗需要治疗的受试者中的DNA损伤或癌症的方法，该方法包括给该受 试者施用治疗有效量的权利要求64的核酸。
78. 治疗需要治疗的受试者中的DNA损伤细胞或癌症的方法，该方法包括给 该受试者施用选自由增强COP1多肽结合至ATM多肽的化合物和增强 ATM多肽磷酸化所述COPl多肽的化合物组成的组的化合物。
79. 按照权利要求78的方法，其中该化合物以有效的在DNA损伤细胞或癌症 中增强COP 1多肽磷酸化的量施用。
80. 由权利要求49或56的方法所鉴定的化合物。
81. 权利要求57-62任一项的肽、权利要求63的模拟物或权利要求80的化合 物用于制备治疗受试者中的DNA损伤或癌症的药物中的用途。
82. —种哺乳动物细胞，其包含编码C0P1分子的重组核酸分子和编码ATM 分子的重组核酸分子。
83. 权利要求82的哺乳动物细胞，进一步包含编码p53分子的重组核酸分子。
84. 权利要求82或83的哺乳动物细胞，其中所述ATM分子是已激活的。
85. 权利要求82- 84任一项的哺乳动物细胞，其中所述C0P1分子是被组成 性磷酸化的或者组成性非磷酸化的。
86. 权利要求85的哺乳动物细胞，其中S387上的突变防止COPl在387上一皮磷 酸化，从而使得该COPl分子在S387上组成性非磷酸化。
全文摘要
本发明提供COP1分子和COP1活性调控物，以及使用它们的方法，包括其诊断和治疗用途。此类分子可用于检测DNA损伤及用于在受试者中调控对DNA损伤的应答和p53活性。本发明还提供用于筛选能够调控COP1活性的测试化合物的试剂和试剂盒。
文档编号G01N33/50GK101384727SQ200680053246
公开日2009年3月11日 申请日期2006年12月21日 优先权日2005年12月31日
发明者戴维·多南 申请人:健泰科生物技术公司