专利名称：一种牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定的样品制备方法
技术领域：
本发明涉及性激素测定中样品的制备技术，具体地说是一种我国重要海水养 殖对象_牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定中的样品制备方法。
背景技术：
性激素的测定已被用于多方面的研究和检测中。在鱼类中，通过检测鱼体性
激素水平，能研究鱼类生长发育，特别是性器官的发育情况和生殖周期；还有外 源性激素对鱼类自身的影响，以及鱼类性别分化和性别逆转等。此外，该技术也 可以应用到其它种类激素的提取及测量中。
目前，性激素水平主要是通过测定血清样品中的含量获得，而^fr较小的仔 稚幼鱼几乎f^佳甚至不能取到测定所需量的血清，所以相关的研究报道M都集 中在成鱼中。有关海水鱼仔稚幼鱼的性激素水平测定和调控研究报道国内尚未见 到，国外也仅有美国学者所报道的在夏牙鲆中通过用乙醚抽提、甲醇冷冻分离， 对其幼鱼雌二醇激素水平的测定分析。比较起来，本发明根据测定原理对样品制 备方法进行了优化，所需试剂少，操作步骤也较简单，经过放射免疫法测定，检 出水平较高。
发明内容
针对现有性激素样品处理方法在海水鱼类仔稚幼鱼上的应用限制，本发明提 供了一整套适用于牙鲆仔稚幼鱼的性激素(如睾酮和雌二醇)水平测定的样品制 备方法。
本发明的技术方案是
一种牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定的样品制备方法，包括如下步骤
1) 取活的或-8(TC保存的牙鲆仔稚幼鱼，秤量后，全鱼用蒸馏水清洗2 3遍， 用剪刀剪碎，置于研钵中。
2) 加入少量PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液，含有137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KC1, 10mmol/LNa2HPO4和2mmol/LKH2PO4, pH7.4)至浸湿，用液氮充分研
磨，匀浆液转入离心管中；然后继续加入少量PBS缓冲液至浸湿，重复研磨，使
最终加入的PBS缓冲液量为样品体重数值的8~12倍(不足1 mL的补齐至1 mL )。 收集的匀浆液用超声波粉碎2(M0秒钟。
3) 向匀浆液中加入PBS缓冲液体积1 2倍量的乙醚，翻转混匀，然后在3~5 。C下，6000~8000转/分钟离心8 10分钟。
4) 收集液相，将固相加入4^M沐积的PBS缓冲液，再加入PBS缓冲液体 积0,5 1倍的乙醚，混句，在3 5'C下，6000 8000转/分钟离心8~10分钟；收集 液相，固相重复本步操作，以更精确地体现样品中的性激素水平。
5) 将液相汇集在一起，颠倒混匀，然后静置分层，置于液氮中冷冻后取有机相。
6) 剩余的水相中加入等体积的乙醚，颠倒混匀，静置分层，于液氮中冷冻后 取有机相。
7) 将有机相汇集，置于通风橱，45 55。C水浴，充分挥发有机相；用PBS缓 冲液室温下充分溶解，将溶液储存于_ 2(TC待用。
本发明原理是鱼类的性激素存在于全身组织中，通过组织破碎，可将其释 放至匀浆液中，禾拥性激素能溶于有机相乙醚的特点，将其简单有效地从鱼的匀 浆液中抽提出来。
本发明的优点和积极效果如下
1、 本发明通过反复实验证明，釆用该方法的确可以获得用于进行性激素测定 的样品，并经放射免M法已经测定出牙鲆仔稚幼鱼样品中睾酮和雌二醇的含量。
2、 本发明工艺简单、成熟、成本低，可以制备出牙鲆仔稚幼鱼性激素测定的 样品，整个过程费时较短，也无须昂贵的试剂和特殊的仪器，不需要其它过多投 资。
3 、在本发明的操作中,釆用实验室常见的液氮进行样品有机相和水相的分离，
避免应用有毒甲醇进行冷冻分离，可以达到同样效果，并减少了甲醇对操作人员 的身体伤害。
4、本发明操作过程简单，结果稳定，可用于牙鲆从仔鱼到6.5 cm幼鱼的性
激素含量测定的样品制备。本发明不仅可以用于牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定的
样品制备，也适用于其它鲆鲽鱼类仔稚幼鱼性激素测定的样品制备，其技术方案 和其中的一些处理参数也适用于其它海水鱼类仔稚幼鱼性激素测定的样品制备，
甚至于其它种激素测定的样品制备，这为进行海水鱼类仔稚幼鱼期的内分泌调控 研究提供了样品和技术支持。因此，其适用范围较广。
具体实施例方式
下面结合实例详述本发明。
实施例1
1)取新鲜的牙鲆仔稚幼鱼(全长，0.8cm),秤量(0.004g)后，全鱼用蒸 馏水清洗2遍，置于研钵中。
2 )加入少量PBS缓冲液(含有137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KC1， 10 mmol/L Na2HP04和2mmol/LKH2P04, pH7.4)至浸湿，用液氮充分研磨，勻浆液转入 离心管中；加PBS缓冲液至鱼体重量数值的10倍(本次应该补齐至lmL),再 用超声波粉碎20秒钟。
3 )向匀浆液中加入PBS缓冲液体积2倍量的乙醚，翻转混匀5分钟后于4 。C下，6000转/分钟离心IO分钟。
4) 收集液相，将固相加入6i沐积的PBS缓冲液，再加入PBS缓冲液体积 l倍的乙醚，混勾，4。C下，6000转/分钟离心IO分钟；收集液相，固相重复本步 操作1次。
5) 将液相汇集在一起，颠倒混勾，然后静置，分层；将分层后的液体放于液 氮中快速冷却，待水相被冷冻后回收有机相。
6) 剩余的水相中加入等体积的乙醚，混勻，静置分层，水相冷冻后取有机相。
7) 将有机相汇集，置于通风橱，45'C水浴，充分挥发有机相；用PBS缓冲 液0.5 mL室温下充分溶解，将溶液储存于-2(TC待用。
8辨品用山东省潍坊巿三维诊断技术有限公司的睾酮放射免疫试剂盒和雌二 醇放射免疫试剂盒，在DFM - 96型10管放射免疫计数器上测定其睾酮和雌二醇 含量分别为0.089 ng/mL和0.013 pg/mL。
实施例2
1)取新鲜的牙鲆仔稚幼鱼(全长，3.2 cm),秤量(0.55 g)后，全鱼用蒸 馏水清洗3遍，用剪刀剪碎，置于研钵中。
2 )向研钵中加入少量PBS缓冲液(含有137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KC1, 10 mmol/L Na2HP04和2腿ol/L KH2P04， pH 7.4)至浸湿，用液氮充分研磨，勻 浆液转入离心管中；然后继续加入PBS缓冲液，重复操作，最后加PBS缓冲液
至鱼体重量数值的9倍，再用超声波粉碎30秒钟。
3) 向匀浆液中加入PBS缓冲液体积2倍量的乙醚，翻转混匀5分钟后于4 。C下，7000转/分钟离心9分钟。
4) 收集液相，将固相加入5倍体积的PBS缓冲液，再加入PBS缓冲液体积 l倍的乙醚，混勾，4。C下，7000转/分钟离心9分钟；收集液相，固相重复本步 操作1次。
5) 将液相汇集在一起，颠倒混匀，然后静置，分层；将分层后的液体放于液 氮中快速冷却，待水相被冷冻后回收有机醚相。
6) 剩余的水相中加入等体积的乙醚，混句，静置分层，7诚冷冻后取有机相。
7) 将有机相汇集，置于通风橱，5(TC水洛，充分挥发有机醚相；用PBS缓 冲液1 mL室温下充分溶解，将溶液储存于-2(TC待用。
8淋品用山东省潍坊巿三维诊断技术有限公司的睾酮放射免疫试剂盒和雌二 醇放射免疫试剂盒，在DFM _ 96型10管放射免疫计数器上测定其睾酮和雌二醇 含量分别为0.446 ngtoL和0.503 pg/mL。
实施例3
1) 取-80。C保存的牙鲆仔稚幼鱼(全长，6.5 cm),秤量(2.39g)后，全鱼 用蒸馏水清洗3遍，用剪刀剪碎，置于研钵中。
2) 向研钵中加入少量PBS缓冲液(含有137 mmol/LNaCl， 2.7 mmol/L KC1, 10 mmol/LNa2HP04和2 mmol/L KH2P04, pH 7.4)至浸湿，用液氮充分研磨，匀 浆液转入离心管中；然后继续加入PBS缓冲液，重复操作，并保证最终加入的 PBS缓冲液量至鱼体重量数值的8倍，再用超声波粉碎40秒钟。
3) 向匀浆液中加入PBS缓冲液体积2倍的乙醚，翻转混匀5分钟后于4。C 下，8000转/分钟离心8分钟。
4) 收集液相，向固相中加入4倍体积的PBS缓冲液，再加入PBS缓冲液体 积l倍的乙醚，混匀，4。C下，8000转/分钟离心8分钟；收集液相，固相重复本 步操作1次。
5) 将液相汇集在一起，颠倒混匀，然后静置，分层；将分层后的液体放于液 氮中快速冷却，待水相被冷冻后回收有机醚相。
6) 剩余的水相中加入等体积的乙醚，混勾，静置分层，水相冷冻后取有机相。
7) 将有机相汇集，置于通风橱，55'C水洛，充分挥发有机相；用PBS缓冲 液1.5 mL室温下充分溶解，将溶液储存于-2(TC待用。
8 )样品用山东省潍坊市三维诊断技术有限公司的睾酮放射免疫试剂盒和雌二 醇放射免疫试剂盒，在DFM - 96型10管放射免疫计数器上测定其睾酮和雌二醇 含量分别为1.516 ng/mL和6.191 pg/mL。
权利要求
1、一种牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定的样品制备方法，其特征在于，具体步骤如下1)取活的或-80℃保存的牙鲆仔稚幼鱼，秤量后，全鱼用蒸馏水清洗2～3遍，用剪刀剪碎，置于研钵中；2)加入PBS缓冲液浸湿，用液氮充分研磨，匀浆液转入离心管中；然后继续加入PBS缓冲液浸湿，重复研磨，使最终加入的PBS缓冲液量为样品体重数值的8～12倍，收集的匀浆液用超声波粉碎20～40秒钟；3)向匀浆液中加入PBS缓冲液体积1～2倍量的乙醚，翻转混匀，然后在3～5℃下，6000～8000转/分钟离心8～10分钟；4)收集液相，将固相加入4～6倍体积的PBS缓冲液，再加入PBS缓冲液体积0.5～1倍的乙醚，混匀，在3～5℃下，6000～8000转/分钟离心8～10分钟；收集液相，固相重复本步操作；5)将液相汇集在一起，颠倒混匀，然后静置分层，置于液氮中冷冻后取有机相；6)剩余的水相中加入等体积的乙醚，颠倒混匀，静置分层，于液氮中冷冻后取有机相；7)将有机相汇集，置于通风橱，45～55℃水浴，充分挥发有机相；用PBS缓冲液室温下充分溶解，将溶液储存于-20℃待用。
2、 按照权利要求1所述的牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定的样品制备方法，其 特征在于所述的PBS缓冲液均为磷酸盐缓冲液，含有137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/LKCl， 10匪ol/LNa2HPO4和2mmol/LKH2P04, pH7.4。
3、 按照权利要求1所述的牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定的样品制备方法，其 特征在于步骤(2)中最终加入的PBS缓冲液量，不足1 mL的补齐至1 mL。
全文摘要
本发明公开一种牙鲆仔稚幼鱼性激素水平测定的样品制备方法，首先取牙鲆仔稚幼鱼，测量后加入液氮研磨，超声波粉碎，加入乙醚混匀；经离心保存液相，再将固相加PBS缓冲液和乙醚混匀，离心保留液相；然后将液相混匀、静置、分层。分层后的液体放于液氮中快速冷却，回收有机相；水相再加乙醚混合静置、分层，液氮中快速冷却，回收有机相，将其汇集放置在通风橱中，45～55℃水浴，挥发有机相；再用PBS缓冲液溶解，储存于-20℃备用于放射免疫法测定。本发明操作过程简单，结果稳定，可用于牙鲆从仔鱼到6.5cm幼鱼的性激素含量测定的样品制备，也适用于其它鲆鲽鱼类幼鱼甚至其它海水鱼类内分泌激素调控的研究中，其适用范围广泛。
文档编号G01N1/28GK101344466SQ20071001528
公开日2009年1月14日 申请日期2007年7月11日 优先权日2007年7月11日
发明者鹏 孙, 锋 尤, 张培军, 徐永立, 奔 杨 申请人:中国科学院海洋研究所