专利名称：：一种利用生物传感器快速测定鱼皮胶原蛋白水解度的新方法
技术领域：
：本发明涉及胶原蛋白水解度的测定方法，属应用生物
技术领域：
。具体涉及应用谷氨酸氧化酶生物传感器测定胶原蛋白水解度的方法。采用本发明方法测定水解度，准确、快速，可在30s内得出数据，且能与微机联机，实施打印、数据分析与自动控制功能，可在一般实验室分析中应用，也可在胶原蛋白酶解制备活性肽的产业化生产中应用。
背景技术：
：-水产动物体内含有的胶原蛋白与陆生哺乳动物体内含有的胶原蛋白具有相同的特点，都是由三条多肽链构成的三股螺旋结构，氨基酸的主要组成也是甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸。同时，水产动物体内的胶原蛋白也具有.-些自身的特点和作用。与陆上动物相比，水产类胶原蛋白有其自身的特点。鱼明胶中的脯氨酸和羟脯氨酸的含量比动物明胶低得多，而鱼明胶中的蛋氨酸的含量却比动物明胶高得多。由于鱼明胶中的脯氨酸和羟脯氨酸的含量比陆生动物明胶低，在生产过程中蛋白结构易于破坏，致使其蛋白的组分中几乎不存在Y组分，而中低分子量的a组分含量较多，因而鱼明胶的胶凝温度比陆生动物明胶低。胶原蛋白中蕴藏着多种生物活性肽，如抑制血管紧张素转化酶活性、抑制血小板凝结活性、抗氧化活性、抗肿瘤活性等。胶原活性肽是以胶原为原料，经多种蛋白酶定向梯度水解后的产物，其分子量在2000Da以下。目前活性肽的生产方式主要有三种(l)从天然生物体中提取；(2)体外酶水解蛋白质产生；(3)通过化学方法和重组DNA技术合成。不同的生产方式各有特点，这取决于目的肽的长短、数量以及用途。天然产物中生物活性肽的含量很少，可作为生物活性肽进行研究，而用作食品是不可行的9化学合成法广泛用于生产高价的药用级肽，但是它的成本高，而且副产物会对人体有害。重组DNA技术合成法也被广泛应用，但是这种方法多用来生产长肽和蛋白质，而许多生物活性肽都是短肽，所以也限制了这种方法的使用。酶法生产生物活性肽具有很多优点，即生产条件温和、安全性高、价廉且控制反应时间就可以得到特定的活性肽，目前酶法在生物活性肽生产中得到广泛应用。在蛋白质水解产品的开发上，肽的开发可能为传统食品业开创出新的机会。酶法生产生物活性肽虽然具有很多优点，但在工业上酶解制备活性肽时，仍存在酶解过程复杂、繁琐、难于控制的问题，需探讨一种简洁、快速，可用于生产控制的测定方法以控制酶解过程，从而实现酶解制备活性肽的规模化生产。
发明内容本发明的目的是针对酶解制备活性肽时存在酶解过程复杂、繁琐、难于控制的问题提出的，本发明可为胶原蛋白酶解制备活性肽的产业化生产提供一种快速、准确测定酶解液水解度的新方法。步骤l:碱性蛋白酶酶解液的制备。在最佳水解温度45i:，pH8.5，加酶量90mg/kg条件下，制备底物浓度为5%、酶解时间分别为1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、4.5h的碱性蛋白酶酶解液。.步骤2:碱性蛋白酶酶解液谷氨酸含量和水解度的测定。通过电位滴定法测定上述酶解液水解度大小。吸取酶解液5ml于100ml容量瓶中，定容。吸取20ml于200ml烧杯中，加60ml蒸馏水，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗NaOH的ml数；再加入10ml40X的中性甲醛，混匀。用上述NaOH标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗NaOH标准溶液的ml数，同时做空白实验。测定结果如图l所示。随酶解时间的延长，鳕鱼皮胶原蛋白水解度呈逐渐增大趋势。谷氨酸含量测定采用SBA-40C型生物传感器分析。开机，自动清洗一次。.绿灯亮后，当屏幕处于自动零状态的O值时，把吸取好的5(HiL标准样品注入进样口。定标完成后，加入50pL酶解液进行谷氨酸含量测定。测定结果如图2所示。随酶解时间的延长，鳕鱼皮胶原蛋白酶解液中谷氨酸含量也呈逐渐增大趋势。步骤3:谷氨酸含量和水解度大小的回归分析。从图3可以看出，数据点基本落在一条直线附近。由此看出，变量X(谷氨酸含量)与Y(水解度)的关系存在线性关系。但是由于并非所有的数据点完全落在一条直线上，因此X与Y的关系并没有确切到可以唯一地由一个X值确定一个Y值的程度，即实际测量值与回归值之间存在着偏差。根据实验数据，得到回归方程y-0.7811x+5.9172，不论是通过相关系数检验(IrI=0.9658〉rmin=0.754)、F检验(F=69.46>F001(1，5)=16.26)还是标准误差(0.251)(见表l、表2)，都表明X(谷氨酸含量)与Y(水解度)有十分显著的线性关系，证明通过测定谷氨酸含量来预测被测酶解物水解度大小有实际应用价值。表1回归统计分析<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2实验水解度与理论水解度的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>权利要求1.一种利用生物传感器快速测定胶原蛋白水解度的新方法。它是利用碱性蛋白酶水解大分子胶原蛋白生成小分子多肽的同时，酶解产物里游离氨基酸含量逐渐增加，其增加的量与水解度大小呈正相关，因此，通过检测酶解液中氨基酸总量或某一种氨基酸含量(如谷氨酸含量)可计算出水解度的大小。本方法采用谷氨酸氧化酶生物传感器，根据谷氨酸与谷氨酸氧化酶反应生成酮酸和H2O2的原理，生成的H2O2与生物传感器中H2O2电极接触产生电流信号，该电流信号与谷氨酸浓度成线性比例关系，经微机处理后，可直接显示结果。选取碱性蛋白酶，在pH8.5、水解温度45℃、加酶量90mg/kg、底物浓度2％的条件下水解鳕鱼皮胶原蛋白，取酶解液50μL，注入谷氨酸氧化酶生物传感器反应池，20s后读数，根据谷氨酸含量与水解度的计算公式y＝0.7811x+5.9172计算水解度。本方法特点快速、准确，可用于一般实验室分析或工业上用胶原蛋白生产活性肽的过程进行测定和控制。2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于所测样品为碱性蛋白酶水解鳕鱼皮胶原蛋白的酶解物，酶解条件为pH8.5、水解温度45°C、加酶量90mg/kg、底物浓度2%。3.根据权利要求1所述的测定方法，采用谷氨酸氧化酶生物传感器测定谷氨酸含量时，谷氨酸氧化酶生物传感器为SBA-40C型生物传感分析仪，进样量为50pL，谷氨酸含量与水解度的计算方程y=0.781lx+5.9172，方.程相关系数r=0.9658413，F值为69.46。全文摘要本方法是利用碱性蛋白酶水解大分子胶原蛋白生成小分子多肽的同时，酶解产物里游离氨基酸含量逐渐增加，其增加的量与水解度大小呈正相关，因此，通过检测酶解液中氨基酸总量或某一种氨基酸含量(如谷氨酸含量)可计算出水解度的大小。本方法采用谷氨酸氧化酶生物传感器，根据谷氨酸与谷氨酸氧化酶反应生成酮酸和H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>的原理，生成的H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>与生物传感器中H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>电极接触产生电流信号，该电流信号与谷氨酸浓度成线性比例关系，经微机处理后，可直接显示结果。本方法特点快速、准确，可对工业上用胶原蛋白生产活性肽的过程进行测定和控制。文档编号G01N27/416GK101246140SQ20071001496公开日2008年8月20日申请日期2007年6月16日优先权日2007年6月16日发明者刘尊英,杰徐,曾名勇,李八方申请人:中国海洋大学