专利名称：测定双孢蘑菇褐变底物的方法
技术领域：
本发明涉及一种多酚物质种类的鉴定技术领域，特别涉及到一种测定双孢蘑菇褐变底物的方法。
背景技术：
褐变是双孢蘑菇采后商品品质降低的最主要特征，不仅影响产品外观质量，而且对风味和营养品质都有一定程度的损害。菇体内的多酚类物质在有氧存在的条件下，经多酚氧化酶的催化作用，将无色的酚类化合物氧化成红褐色的醌，醌再与氨基酸反应，氧化、缩合、重合生成类黑色聚合物是双孢蘑菇采后褐变的主要原因。酚类物质是酶促褐变的物质基础，一般说来生物体内含有多种酚类物质，但只有1种或少数几种是PPO的主要底物。因此研究双孢蘑菇中酚类物质的种类、含量以及主要褐变底物对研究其褐变机理以及褐变抑制措施均具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种能准确测定引起褐变的主要多酚的种类和含量、对研究其褐变机理以及褐变抑制措施均具有重要意义的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其技术内容为一种测定双孢蘑菇褐变底物的方法，依次包括双孢蘑菇中多酚的提取、多酚的分离、多酚物质种类鉴定和含量测定、主要褐变底物的确定四个步骤，其特征在于多酚物质种类的鉴定和含量测定采用高效液相色谱法法进行，步骤四中先通过分析多酚含量在贮藏过程中的变化与褐变度之间的关系，初步确定出可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类，然后对自然褐变产物及标准品褐变产物的紫外吸收光谱进行对照，进而确定导致双孢蘑菇褐变的主要底物。
所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，步骤1中多酚的提取条件和过程为取3～5克双孢蘑菇果肉，加10～20mL浓度为80％的色谱纯甲醇，冰浴研成匀浆，80℃超纯水水浴回流1小时，冷却后过滤，用浓度为80％的甲醇定容至20mL，即为双孢蘑菇中多酚提取液。
所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，步骤2中多酚的分离采用高效液相色谱法，其分析条件为WATERS600型HPLC，色谱柱为0.4cm×15cm反向C18柱，流动相为含甲醇15％～20％的水溶液，另加入甲醇水溶液1％～1.5％的色谱纯磷酸，流速为0.3～0.4ml/min，进样量10～20μl，检测器采用UV254nm，检测波长280nm。步骤1所得的多酚提取液在上述条件下经高效液相色谱仪分离，得到双孢蘑菇中多酚的色谱图。
所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，步骤3中多酚物质种类鉴定和含量测定采用外标法，具体过程为将多酚标准品配制成10～100mg/l的溶液，按步骤2的工艺对多酚标准品溶液进行分离，得到标准品色谱图，然后将双孢蘑菇中多酚的色谱图与标准品色谱图对照，两张谱图中保留时间一致的色谱峰所对应的多酚可判断为同一种物质，从而确定出双孢蘑菇中多酚的种类；根据双孢蘑菇提取液中某种多酚的浓度＝(该标准品溶液浓度/该标准品峰面积)×提取液中该多酚峰面积，从而计算出双孢蘑菇中该多酚的含量。
所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，步骤3中多酚标准品至少包括氨基酚、酪氨酸两种。
所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，步骤4中导致双孢蘑菇褐变底物种类的初步确定为按步骤1的工艺对贮藏了不同时间的双孢蘑菇中的多酚进行提取，然后按步骤2的工艺对提取液进行分离，根据各峰面积计算各多酚的含量在贮藏过程中的变化，同时利用色差计测定贮藏了不同时间的双孢蘑菇的褐变度，含量降低速度与双孢蘑菇褐变度增加速度一致的多酚即为可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类。
所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，步骤4中导致双孢蘑菇褐变主要底物的确定为分别将初步确定出可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类的标准品在双孢蘑菇中PPO催化下的反应产物以及双孢蘑菇组织自然褐变产物在200nm～400nm之间进行紫外吸收光谱扫描，与双孢蘑菇组织自然褐变产物的紫外吸收光谱一致的标准品所对应的底物种类即为导致双孢蘑菇褐变的底物。
所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，步骤4中双孢蘑菇组织褐变度采用全自动色差计测定。
其工作原理为双孢蘑菇中的多酚类物质在多酚氧化酶的催化作用下发生酶促褐变是导致双孢蘑菇褐变的主要原因，双孢蘑菇中含有多种多酚类物质，但其中只有1种或少数几种是褐变的底物。本发明首先将双孢蘑菇中的多酚进行提取、分离和种类鉴定；然后测定双孢蘑菇贮藏过程中各多酚含量的变化和褐变度，含量降低速度与褐变度增加速度一致的多酚即可能为导致双孢蘑菇褐变的底物；最后将初步确定出可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类的标准品在双孢蘑菇中PPO催化下的反应产物以及双孢蘑菇组织自然褐变产物在200nm～400nm之间的紫外吸收光谱对照，与双孢蘑菇组织自然褐变产物的紫外吸收光谱一致的标准品所对应的底物种类即为导致双孢蘑菇褐变的底物。
本发明与现有技术相比，在初步确定出双孢蘑菇中褐变底物的基础上，利用紫外吸收光谱扫描技术，对可能的褐变底物标准品在双孢蘑菇中PPO催化下的反应产物以及双孢蘑菇组织自然褐变产物在200nm～400nm之间进行紫外吸收光谱扫描，通过紫外吸收谱图的对照，更准确地确定出了导致双孢蘑菇褐变的底物种类。
具体实施例方式
实例1步骤1多酚的提取，取5克双孢蘑菇果肉，加20mL浓度为80％的色谱纯甲醇，冰浴研成匀浆，80℃超纯水水浴回流1小时，冷却后过滤，用浓度为80％的色谱纯甲醇定容至20mL，得到双孢蘑菇中多酚的提取液；步骤2多酚的分离，利用高效液相色谱仪对多酚提取液进行分离，分离条件为WATERS600型HPLC，色谱柱为0.4cm×15cm反向C18柱，流动相为15％的甲醇水溶液，另加入甲醇水溶液1％的磷酸，流速为0.3ml/min，进样量10μl，检测器采用UV254nm，检测波长280nm，得到双孢蘑菇中多酚的色谱图。谱图中包含两个明显的色谱峰，保留时间分别为2.338min和3.117min，峰面积分别为129370mv·min和1795190mv·min。
步骤3多酚种类鉴定和含量测定，将氨基酚、酪氨酸、没食子酸、邻苯二酚的标准品分别配制成100mg/l的溶液，按步骤2的工艺对多酚标准品溶液进行分离，得到标准品色谱图。以上各标准品所对应色谱峰的保留时间和峰面积分别为氨基酚2.388min、1255822mv·min；酪氨酸3.134min、1427320mv·min；没食子酸5.741min、6308972mv·min；邻苯二酚14.177min、5020097mv·min。将双孢蘑菇中多酚提取液的色谱图与标准品溶液色谱图对照，可以确定双孢蘑菇多酚提取液色谱图中保留时间为2.338min的多酚为氨基酚，保留时间为3.117的多酚为酪氨酸。根据双孢蘑菇提取液中某种多酚的浓度＝(该标准品溶液浓度/该标准品峰面积)×提取液中该多酚峰面积，计算出双孢蘑菇多酚提取液中氨基酚的浓度为10.30mg/l，酪氨酸浓度为125.77mg/l，从而计算出双孢蘑菇中氨基酚含量为0.041mg/g，酪氨酸含量为0.503mg/g。步骤4褐变底物的确定按步骤1、2和3的方法，分别对采后当天、贮藏了3天、6天的双孢蘑菇中的多酚进行提取、分离及含量计算，得到当天、第3天、第6天氨基酚含量分别为0.041mg/g、0.024mg/g、0.016mg/g，酪氨酸含量分别为0.503mg/g、0.346mg/g、0.220mg/g。同时利用SC-80C型全自动色差计测定采后当天、贮藏了3天、6天的双孢蘑菇的褐变度，分别为91.23、87.37、79.64。从以上结果可以看出，氨基酚和酪氨酸的含量均随双孢蘑菇褐变度的增加而降低，说明二者均可能为导致双孢蘑菇褐变的底物；然后利用紫外分光光度计分别对氨基酚和酪氨酸的标准品在双孢蘑菇中PPO催化下的反应产物及双孢蘑菇组织自然褐变产物在200～400nm范围内进行紫外吸收光谱扫描，结果酪氨酸标准品褐变产物与双孢蘑菇组织自然褐变产物的紫外吸收峰出现在240nm，而氨基酚标准品褐变产物的紫外吸收峰出现在320nm，说明只有酪氨酸是导致双孢蘑菇褐变的底物。
实例2
步骤1多酚的提取，取3克双孢蘑菇果肉，加10mL80％甲醇，冰浴研成匀浆，80℃超纯水水浴回流1小时，冷却后过滤，用80％甲醇定容至20mL，得到双孢蘑菇中多酚的提取液。
步骤2多酚的分离，利用高效液相色谱仪分别对提取液和多酚标准品溶液进行分离，分析条件为WATERS600型HPLC，色谱柱为0.4cm×15cm反向C18柱，流动相为18％的甲醇水溶液，另加入甲醇水溶液1.2％的磷酸，流速为0.4ml/min，进样量15μl，检测器采用UV254nm，检测波长280nm，得到双孢蘑菇中多酚的色谱图。谱图中包含两个明显的色谱峰，保留时间分别为2.106min和3.004min，峰面积分别为77648mv·min和1077130mv·min。
步骤3多酚种类鉴定和含量测定，将氨基酚、酪氨酸、没食子酸、邻苯二酚的标准品分别配制成100mg/l的溶液，按步骤2的工艺对多酚标准品溶液进行分离，得到标准品色谱图。以上各标准品所对应色谱峰的保留时间和峰面积分别为氨基酚2.115min、1255810mv·min；酪氨酸3.104min、1427334mv·min；没食子酸5.702min、6308981mv·min；邻苯二酚14.100min、5020106mv·min。将双孢蘑菇中多酚提取液的色谱图与标准品溶液色谱图对照，可以确定双孢蘑菇多酚提取液色谱图中保留时间为2.106的多酚为氨基酚，保留时间为3.004的多酚为酪氨酸。根据双孢蘑菇提取液中某种多酚的浓度＝(该标准品溶液浓度/该标准品峰面积)×提取液中该多酚峰面积，计算出双孢蘑菇多酚提取液中氨基酚的浓度为6.18mg/l，酪氨酸浓度为75.46mg/l，从而计算出双孢蘑菇中氨基酚含量为0.041mg/g，酪氨酸含量为0.503mg/g。
步骤4褐变底物的确定，按步骤1、2和3的方法，分别对采后当天、贮藏了3天、6天的双孢蘑菇中的多酚进行提取、分离及含量计算，得到当天、第3天、第6天氨基酚含量分别为0.041mg/g、0.024mg/g、0.016mg/g，酪氨酸含量分别为0.503mg/g、0.346mg/g、0.220mg/g。同时利用SC-80C型全自动色差计测定采后当天、贮藏了3天、6天的双孢蘑菇的褐变度，分别为91.23、87.37、79.64。从以上结果可以看出，氨基酚和酪氨酸的含量均随双孢蘑菇褐变度的增加而降低，说明二者均为可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类；然后利用紫外分光光度计分别对氨基酚和酪氨酸的标准品在双孢蘑菇中PPO催化下的反应产物及双孢蘑菇组织自然褐变产物在200～400nm范围内进行紫外吸收光谱扫描，结果酪氨酸标准品褐变产物与双孢蘑菇组织自然褐变产物的紫外吸收峰出现在240nm，而氨基酚标准品褐变产物的紫外吸收峰出现在320nm，说明只有酪氨酸为导致双孢蘑菇褐变的底物。
上述测定过程所用试剂均为色谱纯，水为超纯水。
权利要求
1.一种测定双孢蘑菇褐变底物的方法，依次包括双孢蘑菇中多酚的提取、多酚的分离、多酚物质种类鉴定和含量测定、主要褐变底物的确定四个步骤，其特征在于多酚物质种类的鉴定和含量测定采用高效液相色谱法法进行，步骤四中先通过分析多酚含量在贮藏过程中的变化与褐变度之间的关系，初步确定出可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类，然后对自然褐变产物及标准品褐变产物的紫外吸收光谱进行对照，进而确定导致双孢蘑菇褐变的主要底物。
2.根据权利要求1所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其特征在于步骤1中多酚的提取条件和过程为取3～5克双孢蘑菇果肉，加10～20mL浓度为80％的色谱纯甲醇，冰浴研成匀浆，80℃超纯水水浴回流1小时，冷却后过滤，用浓度为80％的甲醇定容至20mL，即为双孢蘑菇中多酚提取液。
3.根据权利要求1所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其特征在于步骤2中多酚的分离采用高效液相色谱法，其分析条件为WATERS600型HPLC，色谱柱为0.4cm×15cm反向C18柱，流动相为含甲醇15％～20％的水溶液，另加入甲醇水溶液1％～1.5％的色谱纯磷酸，流速为0.3～0.4ml/min，进样量10～20μl，检测器采用UV254nm，检测波长280nm。步骤1所得的多酚提取液在上述条件下经高效液相色谱仪分离，得到双孢蘑菇中多酚的色谱图。
4.根据权利要求1所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其特征在于步骤3中多酚物质种类鉴定和含量测定采用外标法，具体过程为将多酚标准品配制成10～100mg/l的溶液，按步骤2的工艺对多酚标准品溶液进行分离，得到标准品色谱图，然后将双孢蘑菇中多酚的色谱图与标准品色谱图对照，两张谱图中保留时间一致的色谱峰所对应的多酚可判断为同一种物质，从而确定出双孢蘑菇中多酚的种类；根据双孢蘑菇提取液中某种多酚的浓度＝(该标准品溶液浓度/该标准品峰面积)×提取液中该多酚峰面积，从而计算出双孢蘑菇中该多酚的含量。
5.根据权利要求4所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其特征在于步骤3中多酚标准品至少包括氨基酚、酪氨酸两种。
6.根据权利要求1所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其特征在于步骤4中导致双孢蘑菇褐变底物种类的初步确定为按步骤1的工艺对贮藏了不同时间的双孢蘑菇中的多酚进行提取，然后按步骤2的工艺对提取液进行分离，根据各峰面积计算各多酚的含量在贮藏过程中的变化，同时利用色差计测定贮藏了不同时间的双孢蘑菇的褐变度，含量降低速度与双孢蘑菇褐变度增加速度一致的多酚即为可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类。
7.根据权利要求1所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其特征在于步骤4中导致双孢蘑菇褐变主要底物的确定为分别将初步确定出可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类的标准品在双孢蘑菇中PPO催化下的反应产物以及双孢蘑菇组织自然褐变产物在200nm～400nm之间进行紫外吸收光谱扫描，与双孢蘑菇组织自然褐变产物的紫外吸收光谱一致的标准品所对应的底物种类即为导致双孢蘑菇褐变的底物。
8.根据权利要求1所述的测定双孢蘑菇褐变底物的方法，其特征在于步骤4中双孢蘑菇组织褐变度采用全自动色差计测定。
全文摘要
本发明涉及一种测定双孢蘑菇褐变底物的方法，依次包括双孢蘑菇中多酚的提取、多酚的分离、多酚物质种类鉴定和含量测定、主要褐变底物的确定四个步骤，其特征在于多酚物质种类的鉴定和含量测定采用高效液相色谱法进行，步骤四中先通过分析多酚含量在贮藏过程中的变化与褐变度之间的关系，初步确定出可能导致双孢蘑菇褐变的底物种类，然后对自然褐变产物及标准品褐变产物的紫外吸收光谱进行对照，进而确定导致双孢蘑菇褐变的主要底物。一般说来生物体内含有多种酚类物质，但只有1种或少数几种是多酚氧化酶的主要底物，本发明能准确测定引起双孢蘑菇褐变的主要多酚的种类和含量，对进一步研究其褐变机理以及褐变抑制措施均具有重要意义。
文档编号G01N21/31GK101038279SQ20071001434
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月18日 优先权日2007年4月18日
发明者朱继英, 王相友, 王娟 申请人:山东理工大学