专利名称：一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物分析领域。
技术背景日本血吸虫病是由日本血吸虫寄生在人或脊椎动物门脉-肠系静脉系统所引起的一 种人兽共患寄生虫病，主要分布在中国、菲律宾及印度尼西亚等西太平洋地区的一些国 家。估计目前有6.52亿人口受威胁，1.93亿感染者，有症状病例1,2亿。至2003年底， 我国有血吸虫病病人84.3万人，晚期血吸虫病病人2.4万人，近几年报告病人数呈上升 趋势。由于我国血吸虫病流行区人口众多，故血吸虫病仍然是我国重点防治的寄生虫病 之一。20世纪80年代中期，血吸虫病防治策略由消灭媒介螺蛳转向以化疗为主的综合性防 治措施，因此，血吸虫病的诊断工作显得尤为重要。寻找简便、快速、价廉、便于在疫 区推广应用、具有普查、临床实际诊断和疗效考核价值的检测方法，是当前迫切需要解 决的问题。对血吸虫病的诊断，早期常釆用病原学方法，但由于日本血吸虫在终宿主体 内的寄生有着特殊的生物学关系，导致在慢性病患者和低度感染者的粪便中难以査见病 原体，而且多数病原学方法操作繁琐，必须以更敏感和更简便的方法来替代或补充病原 学方法的不足，因此血吸虫病血清学诊断方法得到迅速发展，先后建立了皮内试验(ID)、 环卵沉淀试验(COPT)、间接红细胞凝集试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、 斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)等方法。在众多血清学诊断方法中，基于胶体金标记技术的免疫学诊断方法是近年来新兴的 一种简便快速的检测方法，由于它具有高度的特异性和敏感性，结果直观可靠，而且试 剂和样品用量少，无需专业的技术人员，简化了繁琐的操作过程，是目前发展最快的免 疫技术之一。 发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、灵敏、快捷的用于检测血 吸虫的硝酸纤维素膜及制备方法和应用。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案
一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜，包括硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上所吸附 的血吸虫抗原和少量的聚乙烯吡咯烷酮、明胶和Tween20。一种制备所述用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜的方法，包括以下步骤1、 预湿将硝酸纤维素膜浸入预湿液中，所述预湿液为含甲醇的磷酸盐缓冲液，室 温反应完成后，再于室温下在真空干燥器中干燥；2、 加血吸虫抗原用移液枪移取血吸虫抗原滴加到上述已预湿的硝酸纤维素膜上， 室温反应完成后，再于室温下在真空干燥器中干燥，再重复一次；3、 封闭将吸附了血吸虫抗原的硝酸纤维素膜浸入封闭液中，所述封闭液为含聚乙 烯吡咯垸酮(PVP)、明胶和Tween20的磷酸盐缓冲液(pH7.4)，室温反应lh，再于 室温下在真空干燥器中干燥过夜；4、 保存将制成的硝酸纤维素膜保存在4'C的冰箱中备用。所述磷酸盐缓冲液(PBS， pH 7.4)含有10 mM NaH2P04， 10 mM Na2HP04和100 mM NaCl。一种利用所述用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜检测血吸虫抗体的方法，包括以下步骤1、 免疫反应将血吸虫抗体和纳米金标记的二抗以相同的体积比混合，将上述用于 检测血吸虫的硝酸纤维素膜浸入此混合溶液中；2、 清洗充分反应后，将上述结合了血吸虫抗体和纳米金标记的二抗的硝酸纤维素 膜先用0.5M的NaCl清洗，再用二次水清洗；3、 银染将清洗后的硝酸纤维素膜浸泡在新鲜配制的银染溶液中，所述银染溶液为 含AgNCb，对苯二酚的柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液(pH3.5)含有0.243 M柠 檬酸(C6H8OrH20) ， 0.163 M柠檬酸三钠(Na3C6H507.2H20)，放置暗处于室温下温育， 反应后将硝酸纤维素膜用二次蒸馏水清洗干净；4、 检测将硝酸纤维素膜置于血吸虫光学诊断仪上，用CCD摄像头摄像，将数据采 集输送至电脑中，读取灰度值，即相应的血吸虫抗体浓度值，灰度值与血吸虫抗体在 10ng/mL 10 pg/mL的范围内成线性关系。本技术利用纳米金标记第二抗体和银增强染色技术对血吸虫抗体进行快速免疫检 测，人血清中的血吸虫抗体能被固定于硝酸纤维素膜上的血吸虫抗原迅速捕获，并同时 夹心结合纳米金标记的第二抗体，洗去非特异性结合的蛋白质后，纳米金催化银离子还 原成金属银而沉积于硝酸纤维素膜上，引起膜的灰度发生变化，采用光学测定技术对血
吸虫抗体浓度进行定量测定。本发明的优点是l.所发明的方法通量高，非常适合疫区大规模样品的筛査。由于硝 酸纤维素膜的反应是在微孔板中进行，光学测定过程快速、简便，非常适于大量样品的 平行分析。2.能够实现对血吸虫抗体的快速、定量检测。固定血吸虫抗原的硝酸纤维素膜 可在检测前事先大批量的制备好，干燥保存于4'C冰箱中。检测时取出硝酸纤维素膜与检 测者血清和纳米金标记二抗混合孵育，银增强后即可进行灰度测定，整个检测时间不超过1小时，可平行分析至少ioo个样品。结合血吸虫光学诊断仪测定膜的灰度值，可对 血吸虫抗体含量进行准确的定量分析。3.检测所需的试剂与仪器便携且价格低廉。 一台血 吸虫光学诊断仪的价格仅为5000元左右。
具体实施方式
实施例h用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜的制备1、 预湿先将硝酸纤维素膜裁剪成())5mm的试纸条，再将剪好的硝酸纤维试纸条浸 入预湿液(含10% (v。/。))甲醇的磷酸盐缓冲液(PBS: 10mMNaH2PO4， 10mMNa2HPO4， 100mMNaCl， pH7.4))中，室温反应20min，再于室温下在真空干燥器中干燥45min。2、 加血吸虫抗原用移液枪移取30pL血吸虫抗原滴加到已预湿的硝酸纤维素膜上， 使其完全均匀地被覆盖，室温反应25min，再于室温下在真空干燥器中干燥45min，再重 复一次。3、 封闭将吸附了血吸虫抗原的硝酸纤维素膜浸入封闭液(含2% (wt%)聚乙烯 吡咯垸酮(PVP) ， 0.01% (wt%)明胶以及0.002% (wt%) Tween 20的磷酸盐缓冲液(pH 7.4))中，室温反应lh，再于室温下在真空干燥器中干燥过夜；最后，将制成的 硝酸纤维素膜保存在4'C的冰箱中。实施例2:血吸虫感染兔血清样品的检测将实施例l所制备的硝酸纤维素膜浸入血吸虫感染的兔血清样品和纳米金标记的羊 抗兔二抗(体积比1:1)的混合溶液中，在37。C反应30 min;将结合了血吸虫抗体和纳 米金标记的羊抗兔二抗的硝酸纤维素膜先用0.5M的NaCl清洗两次，再用二次蒸馏水清洗 三次，然后将清洗后的硝酸纤维素膜浸泡在新鲜配制的银染溶液(所述银染溶液为含 2.0mMAgNO3， 0.004g/mL对苯二酚的柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5) 含有0.243 M柠檬酸(C6H8OrH20) ， 0.163 M柠檬酸三钠(Na3C6H50r2H20))中，放 置暗处于室温下温育30min，反应完后将硝酸纤维素膜用二次蒸馏水清洗干净；将反应后
的硝酸纤维素膜置于血吸虫光学诊断仪上，用CCD摄像头摄像，将数据采集输送至电脑 中，读取灰度值，即相应的血吸虫抗体浓度值，牛血清白蛋白等杂蛋白引起的背景干扰 较小。结果表明，该光学检测技术可以对血吸虫感染兔血清样品进行快速检测，灰度值 与血吸虫抗体在10ng/mL 10ng/mL的范围内成线性关系。实施例3:血吸虫感染人血清样品的检测利用该光学检测技术对20例疫区可疑病人的血清样品进行检测。将固定有血吸虫抗 原的硝酸纤维素膜与可疑病人的血清样品和纳米金标记的羊抗人二抗的混合溶液一起于 37'C孵育30 min，再将其浸泡在新鲜配制的银染溶液中(所述银染溶液为含 2.0mMAgNO3， 0.004g/mL对苯二酚的柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液(pH3.5) 含有0.243 M柠檬酸(C6H807.H20) ， 0.163 M柠檬酸三钠(Na3C6H50r2H20))，放 置暗处于室温下温育30min，反应完后将硝酸纤维素膜用二次蒸馏水清洗干净。最后， 在血吸虫光学诊断仪上检测反应后的硝酸纤维素膜的灰度值。20例可疑病人的血清样品 中，5例为阴性，说明是血吸虫未感染血清，15例为阳性，说明是血吸虫感染血清。结 果表明，该光学检测技术可以对血吸虫感染的人血清样品进行快速、准确的测定。
权利要求
1、一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜，其特征在于所述硝酸纤维素膜上吸附了血吸虫抗原，少量的聚乙烯吡咯烷酮、明胶和Tween 20。
2、 一种制备权利要求1所述用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜的方法，包括以下步骤:a、 预湿将硝酸纤维素膜浸入预湿液中，所述预湿液为含甲醇的磷酸盐缓冲液，室 温反应完毕后，再于室温下在真空干燥器中干燥；b、 加血吸虫抗原将血吸虫抗原滴加到上述己预湿的硝酸纤维素膜上，室温反应完 毕后，再于室温下在真空干燥器中干燥，再重复一次；C、封闭将吸附了血吸虫抗原的硝酸纤维素膜浸入封闭液中，所述封闭液为含聚乙 烯吡咯烷酮、明胶和Tween20的磷酸盐缓冲液，室温反应完成后，再于室温下在真空干 燥器中干燥过夜；d、保存将制成的硝酸纤维素膜保存在4t:的冰箱中备用。
3、 根据权利要求2所述的制备用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜的方法，其特征在于 所述磷酸盐缓冲液含有10 mM NaH2P04、 10 mM Na2HP04和100 mM NaCl。
4、 一种利用权利要求1所述的用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜检测血吸虫抗体的方 法，包括以下步骤a、 免疫反应将血吸虫抗体和纳米金标记的二抗以相同的体积比混合，将所述用于 检测血吸虫的硝酸纤维素膜浸入此混合溶液中；b、 清洗充分反应后，将上述结合了血吸虫抗体和纳米金标记的二抗的硝酸纤维素 膜先用NaCl清洗，再用二次水清洗；C、银染将清洗后的硝酸纤维素膜浸泡在新鲜配制的银染溶液中，所述银染溶液为 含AgN03，对苯二酚的柠檬酸盐缓冲液，放置暗处，反应后将硝酸纤维素膜用二次蒸馏 水清洗干净；d、检测将硝酸纤维素膜置于血吸虫光学诊断仪上，用CCD摄像头摄像，将数据采 集输送至电脑中，读取灰度值，即相应的血吸虫抗体浓度值，灰度值与血吸虫抗体在 10ng/mL 10 ng/mL的范围内成线性关系。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜上吸附了血吸虫抗原，少量的聚乙烯吡咯烷酮、明胶和Tween20。本发明的优点在于所用方法通量高，非常适合疫区大规模样品的筛查，能够实现对血吸虫抗体的快速、定量检测。
文档编号G01N33/569GK101149380SQ20071003606
公开日2008年3月26日 申请日期2007年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者俞汝勤, 吴朝阳, 霞 楚, 沈国励, 蒋健晖, 金雪芳 申请人:湖南大学