专利名称：牛传染性鼻气管炎病毒重组毒株、其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种^aftft， ；W^及一种^f专染性鼻气管，毒^a,， i^^a^a饼勾
~法。本发明还涉及^^且 *{乍为判专染性鼻气管^^^^ 、 itft讯翁iJ^作为病毒载体用于
外源基因表达的应用，属于基因工程领域。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)，又称牛疱疹病毒1型(化W77e力eipesWiT/s t，e 7)，可引起的牛的以上呼吸道炎症为特征的急性接触性传染病。在临床上表现多种病 型，如上呼吸道黏膜炎症、脓疱性外阴阴道炎、龟头炎、结膜炎、幼牛脑膜脑炎、乳 房炎、流产等。IBRV在牛多种细胞如鼻甲、气管、肾、睾丸、肺、皮肤细胞和兔、猪、 狗、绵羊、山羊、马和人二倍体肾细胞(WI-38)培养物中生长良好，并产生细胞病变， 感染细胞有核内包涵体。病毒核酸为线性双股丽A，基因组全长为135 301nt， G + C 含量为72%，编码区占84%。病毒编码30 40种结构蛋白，其中有ll种为糖蛋白。 IBRV gE基因全长为1728bp，编码575个氨基酸残基，为病毒复制的非必需基因。 由牛传染性鼻气管炎病毒感染引起的牛传染性鼻气管炎(IBR)是引发养牛业重大
经济损失的疾病之一。本病最初在欧洲发生，1930年以前随着牛的输出而传到美国，
曾作为牛生殖器官感染症而蔓延，1955年Miller在美国首次报道，1956年Madin等
分离到病毒，1964年Huck确认了本病毒属于疱疹病毒。本病呈世界性分布，主要经
济损失在于延缓育肥牛的生长和增重及奶牛产奶量下降和流产等，对养牛业危害极大。
由IBRV引发的呼吸道疾病在美国每年可造成5亿美元的经济损失，在北美则高达10
亿美元。我国于1980年从新西兰进口牛中发现本病，随后在国内部分地区的农牧场及
奶牛场发现均有不同程度的感染和发病。国内陈永涧(1982)、崔言顺(1999)、杨春
明(2003)、肖定汉(2004)、朱远茂等(2005)等对我国部分地区牛只进行了血清学调査，发现国内牛只的IBR抗体阳性率从O. 12%到66. 7%不等。而肖定汉等(2005)对 14个牛场在1991-1995和1996-1999年间进行的调查表明，IBR血清抗体阳性率从 8.03%(114头)升高到65.4%(557头)。近年在进口牛只检疫中，广东出入境检疫局罗 琼等(2005)检测了 5000多只澳大利亚进口种牛，其中1505头血清样品呈现IBR抗 体阳性，并有两头分离到病毒。由此可知，国内无IBRV感染的牛场受内(国内部分地 区感染牛)和外来(携带病毒的进口牛只)的双重压力，该病的防治形势不容乐观。 在IBR阳性率不断升高的情况下，使用IBR疫苗来防控本病的重要性已日渐突出。
Madin等于1956年首次分离出IBRV后，同年就报道了第一个减毒活疫苗，充分 体现了用疫苗防控IBR的重要性，至今已开发出了多种常规的活苗和灭活苗。但这些 常规疫苗都存在致潜伏感染、散播病毒、无法区别野生毒与疫苗毒等缺点，已逐步被 安全性更好的基因缺失标记疫苗所替带。尽管现有疫苗的免疫效果令人不太满意，但 一般说来，疫苗可阻止临床症状的出现和减少感染后病毒的排出。使用传统的弱毒疫 苗或灭活疫苗的缺点是不能区别疫苗接种和自然感染所诱生的抗体，这样会干扰以血 清学检测来消灭本病的防制措施的实施。而利用缺乏特定糖蛋白的基因缺失和亚单位 疫苗，则可以解决这一问题。欧洲已于1995年开发出了 gE基因缺失疫苗，利用 gE-ELISA可区分自然感染和疫苗免疫牛。
牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)TK基因缺失苗于1984年首先在美国报道(Kit等， 1990)，采用鼻内、肌肉及静脉内试用接种均无致病性，其唯一的缺点是疫苗病毒仍具 有潜伏感染性。1994年澳大利亚学者Smith构建了一株BHV-1的TK基因缺失苗，肌 肉接种和静脉接种后能诱导机体产生良好的免疫原性，且无明显的副作用。同年荷兰 学者van Engelenburg等构建了 IBRV gE单基因和gE、 TK双基因缺失毒株，首次证实 了gE单基因缺失就可在很大程度上降低IBRV的毒力，且病毒增殖滴度未见下降，但 gE和TK双基因缺失毒株增殖滴度有一定下降。其中IBRV gE基因缺失毒株成了欧洲 后来生产并应用的IBRV gE基因缺失疫苗，也就是说欧洲主要是使用IBRV gE基因缺 失疫苗。此后，美国的Belknap等(1999)构建了 gE、 gG和US2三基因缺失毒株， 免疫与攻毒试验表明该毒株可使犊牛产生良好的免疫保护。目前已有多种IBRV单基
因、双基因乃至三基因缺失疫苗的问世，如美国己普遍使用IBRV TK基因缺失疫苗， 荷兰于1998年5月在全国范围内启动扑灭计划，推广使用IBRVgE基因缺失疫苗。此 外，欧洲的比利时也使用了 IBRVgE基因缺失疫苗，启动了 IBR扑灭计划(Ackerma皿 等，2006)。牛传染性鼻气管炎病毒的第一代基因缺失疫苗是TK基因缺失疫苗，而第 二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力较TK基因缺失疫苗又得到进一步 降低，同时可以建立相应的血清学鉴别诊断方法。目前，IBRV gE基因缺失疫苗在欧 洲己获得广泛应用(猫Dr匿n Little-羅den Hurk，2006)。
我国于1980年发现IBR后，中国兽药监察所周泰冲等(1981)研制了IBR弱毒
冻干疫苗，所用种毒为IBRVBartha-Nu/67，是由中国兽药监察所于1978年从匈牙利
引进的IBRV弱毒。该种毒是目前国内进行IBR病毒中和试验所用的病毒，是国内进行
IBR研究的一个参考毒株。用IBRVBartha-Nu/67制备的弱毒疫苗接种黑白花小乳牛2
周后，中和抗体滴度可达1:8以上，符合匈牙利IBR弱毒疫苗效力检验标准。中国农
业科学院兰州兽医研究所李崇华等(1988)禾lj用从四川牦牛体内分离的IBR85-Y毒株
制备了 IBR油乳剂灭活苗，免疫牦牛后用ELISA可测到较高水平的抗体。但这些疫苗
都未投入使用。这些都是国内早期IBR传统疫苗的研究。
在借鉴国外研究的基础上，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所张桂红等(1998)
构建了 IBRV TK基因缺失毒株，在TK基因缺失部位插入了 LacZ表达盒，用PCR可鉴
别TK基因缺失毒株与野生型毒株。牛传染性鼻气管炎病毒的TK基因缺失疫苗是第一
代基因缺失疫苗，而第二代基因缺失疫苗主要是gE基因缺失疫苗，其毒力较TK基因
缺失疫苗又得到进一步降低，同时可以建立相应的血清学鉴别诊断方法。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种牛传染性鼻气管 ，毒(IBRV)重i且转移载体，该重组转移载体将gE基因的大部分序列缺失。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 ——禾中4^[专染性鼻气管ife^毒(// /ectj'ows /wT/7'"e r/ i/ ot_rac/ ej't/s k"tas ， IBRV) H且转移载体，包括启动子、牛传染性鼻气管^ 因、终止子等，该重组转移载体中gE 基因包括起始密码子ATG在内的1134bp被缺失，在缺失了 gE基因的位置插入有LacZ 表达盒。
本发明所要解决的另 一 个技术问题是提供 一 种构建上述牛传染性鼻气管炎病毒 (IBRV) ^S转移载体的方法。
本发明所要解决的另一个技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种构建上述牛传染性鼻气管，毒(IBRV) ^a转移载体的方法，包括
(1) 按照常规方法提取IBRV基因组DNA;
(2) 以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2为引物，以IBRV基因组DNA为摸板，按照 常规PCR方法进行扩增，得到上游同源重组臂；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4为引 物，以IBRV基因组DNA为摸板，按照常规PCR方法进行扩增，得到下游同源重组臂；
(3) 将所扩增的上、下游同源重组臂分别克隆于T Easy载体后测序；利用限 制性内切酶AsuII与NsiI酶切正向插入的上游同源重组臂质粒，回收质粒部分；同时 用HindIII与Nsil酶切正向插入的下游同源重组臂质粒，回收相应的下游同源重组臂 片段；先用回收的质粒和片段进行连接，再用Klenow大片段酶补平，用TJ)NA连接酶 连接，将连接产物转化感受态细菌，筛选出gE基因缺失1134bp的转移载体；
(4) 将LacZ表达盒插入转移载体上游同源重组臂的下游，将下游同源重组臂定 向插入LacZ表达盒的下游，即得。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种牛传染性鼻气管，毒(IBRV) ^a毒株。
本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种牛传染性鼻气管彌毒(IBRV)軍组毒株(IBRV46)，该^S毒株中牛传染性鼻气管炎 病毒的gE基因包括起始密码子ATG在内的1134bp被缺失。
将本发明的牛传染性鼻气管ife^毒(IBRV) ^a转移载体与IBRV基因组共转染后， 筛选，即得。
本发明牛传染性鼻气管ife^毒(IBRV) ^a^a勺微生物保藏号是CGMCC NO. 2102; 分类命名是7/Lfec"ows Zw&e 2^/7"潔力ei"s w'r蹄保藏时间是2007年7
月6日；保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址北
京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
本发明判专染性鼻气管ife^毒(IBRV)塾且 *主要具有以下几方面的鹏前景
1、 制备预防和治疗传染性鼻气管ife^毒的;Sffi。
2、 可制备成诊断试剂，按照常规的分子生物学方法或血清学方法，将gE基因缺 失毒株的感染与野毒株的感染加以区别开来。这对流行病学的调査和传染性鼻气管ife^ 毒,方和治疗极为觀。
3、 可以进一步将其进行改构或缺失，例如，可将TK (胸苷激酶)及其它病毒非 必需基因缺失，得到突变毒株并进一步制备成疫苗等。
5、将其作为外源基因的表达载体。
总之，本发明牛传染性鼻气管炎病毒gE基因缺失毒株(IBRV46)的成功构建，为 IBRV gE基因缺失疫苗及鉴别诊断试剂、IBRV多基因缺失毒株构建及疫苗与IBRV表达 外源基因重组病毒构建等的研究奠定了坚实的基础。
具体实施例方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的 目的，决不限制本发明的保护范围。 本发明利用我国从匈牙利引进的IBRV Bartha-Nu/67弱毒株构建了 IBRV gE基因 缺失毒株IBRV46，该毒株的gE基因编码核苷酸包括起始密码子ATG在内的1134bp已 被成功缺失(gE基因全长为1728bp) 。 IBRV gE基因缺失毒株IBRV46的构建过程如下
1. IBRV基因组DNA模板的制备
参照Pignatti等报道的方法抽提IBRV基因组DNA，并略做改进。用IBRV Bartha-Nu/67接种牛胎鼻甲细胞单层，待细胞出现80%病变后，用预冷的0. 01MpH7. 4 PBS洗两遍细胞单层，刮取细胞后低速离心，将细胞悬浮于PBS中，置一7(TC保存备 用。取上述悬浮细胞液lml，加入9倍DNA提取液(10mM Tris-HCl pH8. 0， 10mM EDTA pH8. 0， 0. 5% Triton X- 100)，于室温作用20min后加入2M NaCl使终浓度至0. 2M， 4°C 3400r/min离心10min。取上清液加RNase A至100 u g/ml， Proteinase K至100 ug/ml， SDS至O. 5%， 37。C水浴30min。等量酚、酚/氯仿各抽提一次，两倍无水乙 醇于4。C放置20min， 4°C 12000r/min离心15min。 70%乙醇洗2次，然后溶解于50 ul TE (pH8.0)，紫外分光光度计测定病毒DNA含量。
2. gE基因缺失转移载体的构建
参照已发表的IBRV全基因组序列(Benebank登录号为NC 001847)，分别设计两 对引物，用于扩增构建gE基因缺失转移载体的上下游同源重组臂。扩增上游同源重组 臂的引物为
gIF 5， -GCG CGT CGG CGA CTC AAG CCA T-3' 120234 120255 (SEQ ID N0:1); gIR 5， -GAC CGT GTC GAC CGA AGC CGA g-3， 121842 121821(SEQ ID N0:2)，扩增片段为1609bp。
扩增下游同源重组臂的引物为gESmalF 5' - CCC CCG GGC TTT ACG TCT TTG TGC T-3' (SEQIDN0:3)， gENsiR 5， -CCA TGC ATG GGC CGG GGC ACT
ACC T-3' (SEQIDN0:4)， 扩增片段为1609bp。 PCR反应条件93。C预变性3min; 95°C 45s， 65°C 45s， 72°C 3min， 30个循环后，72。C延伸10min。取扩增产物电泳， 用胶回收试剂盒回收目的片段，克隆于T Easy Vector后测序。利用限制性内切酶AsuII 与Nsil酶切正向插入的上游同源重组臂质粒，回收质粒部分；同时用HindIII与Nsil 酶切正向插入的下游同源重组臂质粒，回收相应的下游同源重组臂片段。然后先用回 收的质粒和片段进行连接，再用Kl冊now大片段酶补平，用T4DNA连接酶连接，将连 接产物转化感受态细菌，筛选出gE基因缺失的转移载体，缺失1134bp。
同时构建在gE基因缺失部分插入LacZ表达盒的gE基因缺失转移载体。构建LacZ 表达盒所用的引物为LdgEF: 5， -TTT TCg AAT gCT TCg CgA TgT ACg ggC CAg-3， ， LdgER: 5， - ATT CCC ggg gCA TCC CCA gCA TgC CTg CTA T -3，。利用pcDNA3. 1(+)作为模板，用上述引物扩增带有完整CMV启动子和poly A的 片段，将其克隆入T easy Vector后用HindIII与XbaI双酶切，回收质粒部分。同时 用HindIII与Xbal双酶切pcDNA3. 1HisLacZ质粒，回收LacZ片段，将其定向插入带 有完整CMV启动子和BGA poly A片段的质粒中，获得LacZ表达盒。先利用AsuII与 Nsil位点将LacZ表达盒插入gE基因缺失转移载体上游同源重组臂的下游，然后利用 Smal与Nsil位点将下游同源重组臂定向插入LacZ表达盒的下游，即获得了带有LacZ 表达盒的gE基因缺失转移载体。
3.转染用IBRV基因组DNA的制备
参照Morgan等(1990)报道的方法制备IBRV基因组DNA。用IBRV Bartha-Nu/67 接种牛胎鼻甲细胞单层，待细胞出现80%病变后，用预冷的0. 01M pH7. 4 PBS洗两遍 细胞单层，加入细胞裂解液(lOraMTris-HC1 pH8. 0， ImM EDTA pH8. 0， lOOmMNaCl， SDS 至O. 5%， Proteinase K至200iig/ml) 4ml (100cm2玻璃培养瓶)作用20min。然后将 细胞裂解物加入10ml离心管中，在37。C下孵育3h。用等酚抽提l次，用等量酚/异戊 醇(24:1)抽提2次，加两倍无水乙醇于-2(TC保存备用。用于转染时，在16。C以12 000g 离心15min，用75%乙醇洗2次，每次离心5分钟。将上:清液倒掉，干燥15min，用 适量去离子水悬浮，于37。C下孵育lh，即可用于转染。
4. IBRV基因组的磷酸钙沉淀法转染
核酸一磷酸钙沉淀的制备取2只1.5ml离心管，分别标记为A管和B管。在A 管中分别加入2MCaCl2、 IBRV基因组DNA、线性化的转移载体质粒，最后加去离子水 至300ul，其中CaCL终浓度为140函，IBRV基因组DNA含量为5u g，线性化的转移 载体质粒DNA含量为g。 B管加2XHBSP (1. 5mM Na2HP04， 10raMKCl， 280mMNaCl， 12mMGlucose， 50mM H印es， pH7. 05) 300ul。 A管各成份充分混匀后，将B管溶液缓 慢逐滴加入A管(约l一2分)，用吸管吹打6次后，在室温下孵育30分钟。用MEM 冲洗牛鼻甲细胞单层(60mm培养平皿)2次，将上述制备的核酸一磷酸钙沉淀加到细 胞单层上吸附2h。然后加入5X胎牛血清的MEM培养液，过夜。次日用0.01M、 pH7. 4 PBS洗培养平皿1次，加25%DMS0 (用1XHBSP配制)，作用4min。将DMSO吸出，用 MEM洗2次，加入含2。/。胎牛血清的MEM培养液，继续培养。待观察到细胞病变后收取 培养皿，经3次冻融后于-2(TC结冻保存。
5. IBRV gE基因缺失重组病毒的筛选与鉴定 重组病毒的筛选策略是先用带有LacZ表达盒的gE基因缺失转移载体质粒与
IBRV基因组共转染后，利用加X-gal底物的方法进行蓝白斑筛选，首先筛选出表达 LacZ基因的IBRV gE基因缺失重组病毒，即蓝斑病毒。然后制备表达LacZ基因的IBRV gE基因缺失重组病毒基因组DNA，与不带有LacZ表达盒的gE基因缺失转移载体质粒 共转染，筛选出不带LacZ表达盒的gE基因缺失重组病毒，即白斑病毒。筛选方法如 下
用0. 2陶针式滤器将有病变的转染细胞培养液滤过，按1:10作倍比稀释，接种 MDBK细胞的24孔培养板，于37'C吸附lh，然后将病毒液吸出，每孔加0.5ml的lX 甲基纤维素。待出现病变后，将甲基纤维素吸出，用MEM液洗3次，然后每孔加1% 琼脂糖(含X-gal的浓度为15(mg/ml)，在室温下待凝固后继续培养。根据病毒蚀斑 的颜色来筛选重组病毒。用上述方法筛选到了一株gE基因缺失重组病毒，命名为IBRV
46。
用PCR对重组病毒进行了鉴定，上游引物为5' —CgC gTg TgT CTT ggT TTC Tg - 3，，下游引物为5， 一Tgg TCg gCA AgC Tgg TgT AT - 3，，从IBRV gE基因未缺失 毒株DNA中可扩增出长为1668bp片段，从gE基因缺失的IBRV46毒株中可扩增出约 500bp的片段，说明gE基因已被成功缺失。用Reed-Muench法测定病毒滴度，IBRV46 的TC瓜。为1077ml， gE基因未缺失弱毒株的TC瓜。为1077ml，病毒滴度未见下降， 符合制备疫苗的要求。
序列表
SE,NCE LISTING
<iio〉中闺农业科学院哈尔滨兽K研究所
<i20〉屮传染性鼻气管炎病毒:虽组毒株、it构^方法及Kv:ffl
<i30> P0886 <160〉 4
<170> Patentln version 3.1
<210〉 1
<211〉 21
<212〉 DNA
<213〉 Artificial
"00> 1
gcgcgtcggc g ictC33gcc a 21
<210〉 2
<211〉 22
<212〉 瞧
<213〉 Artificial
〈400〉 2
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200710129866.2
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权利要求
1、一种牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus)重组转移载体，包括启动子、牛传染性鼻气管炎病毒基因、终止子等，其特征在于所述牛传染性鼻气管炎病毒基因中gE基因包括起始密码子ATG在内的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表达盒。
2、 一种构建权利要求1所述^1^&#^管|^ 1&转移载体的方法，包括-(1) 按照常规方法提取IBRV基因组DNA;(2) 以SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2为引物，以IBRV基因组丽A为摸板，按照 常规PCR方法进行扩增，得到上游同源重组臂；以SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4为引 物，以IBRV基因组DNA为摸板，按照常规PCR方法进行扩增，得到下游同源重组臂；(3) 将所扩增的上、下游同源重组臂分别克隆于T Easy载体后测序；利用限制 性内切酶AsuII与NsiI酶切正向插入的上游同源重组臂质粒，回收质粒部分；同时用 HindIII与Nsil酶切正向插入的下游同源重组臂质粒，回收相应的下游同源重组臂片 段；先用回收的质粒和片段进行连接，再用大片段酶补平，用T.，DNA连接酶连接，将 连接产物转化感受态细菌，筛选出gE基因缺失U34bp的转移载体；(4) 将UcZ表达盒插入转移载体上游同源重组臂的下游，将下游同源重组臂定 向插入LacZ表达盒的下游，即得。
3、 一种4^^l4鼻气管i^^ (J/ f"ecti'o脂6ow'iie rAi加加d eitfs k/jt"s) IBRV46,^Effi^:该SS^t中4^l4^气管J^^JgE基因包括起始密码子ATG 在内的1134bp被缺失。
4、 按照权承展求3的特嫩鼻气管魏毒(Ji fec"ous Zwi/ e rM加f潔力eif j.s ra> s) ML毒株IBRV46,其微生物保藏号是CGMCC節.2102。
5、 权利要求3或4的4^^ft鼻气管^tlffi,IBRV46在制备预防、治疗或诊 断4K微主鼻气管^i^M中的鹏
6、 一种预防或治疗的4^专#1*鼻气管炎6^鱼11组，，含有fe^麼求3或4^jl]Mm专染 性鼻气管!8i^^a,IBI V46和药学上可接受的载体或佐剂。
7、 权承BStlfiW^ft鼻气管l^figl转移载体作为外源基因的表达载体的应用。
8、 权利要求3或4的牛"f与^r主鼻气管^^Wl毒株IBRV46作为外源基因的表达载 体的应用。
全文摘要
本发明公开了一种牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)重组转移载体，其构建方法。本发明还公开了用该重组转移载体与IBRV基因组DNA共转染后所得到的重组毒株IBRV46。本发明重组转移载体中gE基因包括起始密码子ATG在内的1134bp被缺失，在缺失了gE基因的位置插入有LacZ表达盒。本发明重组毒株可用于制备预防和治疗传染性鼻气管炎病毒的疫苗。也可制备成诊断试剂，按照常规的分子生物学方法或血清学方法，将gE基因缺失毒株的感染与野毒株的感染加以区分。此外，还可以进一步将其进行改构或将其非必需基因缺失，得到突变毒株并进一步制备成疫苗等。
文档编号G01N33/571GK101353670SQ20071012986
公开日2009年1月28日 申请日期2007年7月27日 优先权日2007年7月27日
发明者朱远茂, 王延辉, 童光志, 飞 薛 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所