专利名称：：一种以褶皱臂尾轮虫纯系进行环境监测的方法一种以褶铍臂尾轮虫纯系进行环境监测的方法
技术领域：
-本发明涉及利用褶皱臂尾轮虫单克隆纯系为生物模型建立了一套检测水体污染物对生物毒性大小的方法，尤其是可以对重金属毒性进行检验，属于生物环境毒理学研究领域。
背景技术：
：对于利用生物进行环境监测的方法，国内外主要利用植物和动物对污染物等毒性作用因子的反应来作为指标进行衡量。在植物方面，主要是以蚕豆根尖、洋葱根尖、大蒜根尖等植物根系中的细胞微核的产生情况来进行评判，这方面国内外有大量的研究报道；在动物方面，既有用血液淋巴细胞在毒性实验条件下出现微核的情况来评定，也有从生理生化角度，如利用鱼、虾产生应急蛋白等作为毒性检测指标。以上研究的实验生物材料主要是植物和体型较大的动物的血液，在水体污染物毒性评价方面，一些学者也探讨了利用轮虫种类和数量作为环境污染情况的指标来粗略的估计水体受污染情况，如陈菊芳2000年在"中国环境科学杂志"报道了水体浮游生物(主要是轮虫)与水质的关系，但没有进一步查阅到在这方面实际应用于环境监测的报道，至今也未见从褶皱臂尾构建单克隆纯系角度来研究环境污染物对水体生物影响方面的报道。褶皱臂尾轮虫单克隆纯系中的所有个体由于全部来源于同一个亲本，因而遗传背景都是相同的，这样可以最大程度的减少外界环境对受测试生物的影响，即最大程度地降低了背景，从而提高了实验结果的可靠性。
发明内容1、褶皱臂尾轮虫单克隆纯系建立方法选择活力较强的褶皱臂尾轮虫单个个体，用虹吸管吸入48孔(6x8)细胞培养板中进行培养，每孔中加入lmL(即1000uL)的淡水小球藻与培养液的混合液。培养时温度保持在25°C。经过7天的培养后，于解剖镜下挑选活力强的子代个体10个，分别放入另一个48孔细胞培养板中进行培养，在这个转移培养过程中逐步添加培养液，使体积达到1000uL。以上转移后培养的轮虫再经过7天培养，选择其中活力强的48个轮虫把其转移到另一个48孔培养板中的每个孔中进行单独培养，经过7天左右培养，可以使每个孔中的轮虫数量达到20-30个。这些^^虫共同组成了一个遗传背景相同，来自一个原始^^虫亲本的单克隆纯系，可以以此纯系轮虫进一步进行环境毒理实验，以探讨重金属对轮虫毒性影响，进而确定一套水体环境监测的生物监测方法。2、以轮虫死亡数目衡量重金属毒性的方法利用重金属镉离子(Cd2+)对以上建立的纯系褶皱臂尾轮虫进行毒性实验。CcT浓度梯度设为0.lmg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L六个从低到高的浓度，试验在48孔(6x8)细胞培养板中进行。用以上六种镉离子浓度水体分别对单个克隆纯系的不同平行组进行毒性试^睑，连续培养96小时，观察各孔中褶皱臂尾轮虫的死亡情况。于解剖镜(2xl0-20倍镜)下计数，各浓度设置6组平行，2组空白对照(不加入镉离子)，在3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h记录褶铍臂尾4仑虫个体死亡数目、存活数。经过观察统计，确定可以把18h时各镉离子浓度下轮虫的死亡数目作为指标来指示不同浓度镉离子对水体生物的有害影响。具体实施例方式一、轮虫采集从野外含有褶皱臂尾轮虫的水样中取水样，经80目的滤网过滤水样，由于大量枝角类不能滤过，留在滤网上，轮虫则存在于烧杯的水体中；再用250目的滤网过滤烧杯中的水体于另一烧杯中，过滤后，4仑虫则留在滤网上。用胶头滴管(口径约为0.4隨的细长玻璃吸管)吸取250目网上的液体，置于载玻片上，在解剖镜(4x10=40倍镜)下，用虹吸管吸取单个轮虫，其后再放置于10x10=100倍显微镜下鉴别轮虫的种类。二、轮虫饲养选用实验室恒温光照培养箱中培养淡水小球藻作为褶皱臂尾轮虫的辨料。投喂淡水小球藻时，小球藻(先浓缩置于离心管中，10000rpm,10min，倒去上清液)与轮虫培养液(筛选出轮虫后的水样经过煮沸，灭菌，冷却后成为培养褶皱臂尾轮虫的培养液)的比例为1:50，光照强度为1000-1200lx,L:D=14:IO，培养温度为25±1°C。三、褶皱臂尾轮虫纯系构建从采集的轮虫样本中，经解剖镜鉴别，选择活力较强的褶皱臂尾轮虫单个个体，用虹吸管吸入48孔(6x8)细胞培养板中进行培养，每孔中加入lmL(即lOOOuL)的淡水小球藻与培养液的混合液。培养时温度保持在25。C。经过7天的培养后，于解剖镜下挑选活力强的子代个体10个，分别放入另一个48孔细胞培养板中进行培养，在这个转移培养过程中逐步添加培养液，使体积恢复为1000uL。再经过7天培养，把48个轮虫再转移到另一个48孔培养板中的每个孔中进行培养，经过7天左右培养，可以使每个孔中的轮虫数量达到20-30个。这些轮虫共同组成了一个遗传背景相同，来自一个原始轮虫亲本的单克隆纯系，可以以此纯系轮虫进一步进行遗传毒理实验，以探讨重金属对轮虫的毒性影响，进而确定一套水体环境监测的生物监测方法。四、镉离子(Cd2+)毒性试验(一)实验条件(1)实验中培养褶皱臂尾轮虫的液体是淡水小球藻与培养液的混合液，其中小球藻与轮虫培养液(筛选出轮虫后的水样经过煮沸，灭菌，冷却后成为培养褶皱臂尾轮虫的培养液)加入的比例为1:50。(2)培养容器为48孔细胞培养板，每孔中混合液的体积为1000uL。(3)光照强度为1000-1200lx,L:D=14:10;置于恒温光照培养箱中培养，培养温度为25土rc。(二)镉离子(Cd2+)毒性试验方案(1)Cd^农度梯度设为0.lmg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L，试验在48孔(6x8)细胞培养板中进行(具体实验设置见表1)。用以上六种镉离子浓度水体分别对单个克隆纯系的不同平行组进行毒性试验，连续培养96小时，观察各孔中褶皱臂尾轮虫的死亡情况。于解剖镜(2x10=20倍镜)下计数，各浓度设置6組平行，2组￡白对照(不加入镝禹于)，在3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h记录褶皱臂尾轮虫个体死亡数目、存活数。表lCcT浓度梯度设置(单位毫克/升)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)每孔中实际加入镉离子体积公式:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(三)实验结果经过96小时连续观察，确定第18小时为统计数据资料的最佳时间，此时最高浓度(Cd"农度4.Omg/L)的培养孔中，轮虫出现了最大死亡数目的峰值，而其后，如24小时时，此培养孔中轮虫则全部死亡。表318h褶皱臂尾轮虫的死亡计数(单位个)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>五、统计分析结果以表3中镉离子毒性处理18小时时各镉离子浓度下轮虫的死亡数目为观测值，对各镉离子浓度间的处理效应有无进行方差分析，并进行多重比较。结果表明，0.lmg/L和0.2mg/L镉离子浓度间差异不显著，而其它处理间均存在着极显著差异。说明镉离子浓度含量在0.2mg/L以下的水体为衡量镉离子对生物污染的最高安全浓度。由此方法可以依次制定其它重金属等污染物在水体中的安全浓度等指标。权利要求1、褶皱臂尾轮虫单克隆纯系建立方法选择活力较强的褶皱臂尾轮虫单个个体，用虹吸管吸入48孔(6×8)细胞培养板中进行培养，每孔中加入1mL(即1000uL)的淡水小球藻与培养液的混合液。培养时温度保持在25℃。经过7天的培养后，于解剖镜下挑选活力强的子代个体10个，分别放入另一个48孔细胞培养板中进行培养，在这个转移培养过程中逐步添加培养液，使体积恢复为1000uL。再经过7天培养，分别转移轮虫到另一个48孔细胞培养板中进行扩大培养，由此可以建立一个遗传背景相同，来自一个原始轮虫亲本的单克隆纯系。2、以轮虫死亡数目衡量重金属毒性的方法利用重金属镉离子(Cd2+)对以上建立的纯系褶皱臂尾轮虫进行毒性实验，Cc^+浓度梯度设为0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L六个从低到高的浓度，试验在48孔(6X8)细胞培养板中进行。用以上六种镉离子浓度水体分别对轮虫单个克隆纯系的不同平行组进行毒性试验，连续培养96小时，观察各孔中褶皱臂尾轮虫的死亡情况。于解剖镜(2X10=20倍镜)下计数，各浓度设置6组平行，2组空白对照(不加入镉离T)，在3h、6h、9h、12h、15h、18h、21h、24h、30h、36h、48h、60h、72h、96h记录褶鮍臂尾轮虫个体死亡数目、存活数。以18h时各镉离子浓度下轮虫的死亡数目为观测值，对各镉离子浓度间的处理效应有无进行方差分析检验，并进行多重比较。全文摘要本发明是一种以褶皱臂尾轮虫纯系进行环境监测的方法，即利用一种水体浮游生物(褶皱臂尾轮虫)建立一个水体环境污染物毒性的监测方法，属于环境生物学领域，其特征在于以纯系轮虫作为受试模型来检测诸如重金属镉(本发明以检测镉离子毒性来说明此方法的具体应用)的最高安全浓度。其技术方案要点是，首先利用单个轮虫亲本培育出由一定数量子代轮虫组成的纯系，这样可以保证受试生物的遗传背景相同，提高检测的准确性，其次利用不同镉离子浓度梯度对这些纯系进行分组毒性实验，检测结果表明，18小时时可以作为镉离子在水体中对于生物产生毒害的检验时间点，镉离子浓度在0.2mg/L以下属于安全浓度。此发明可以为制定水体污染物的安全浓度提供生物毒性实验材料和科学依据。文档编号G01N33/18GK101162224SQ200710132448公开日2008年4月16日申请日期2007年9月17日优先权日2007年9月17日发明者静徐,阎斌伦,陈建华,焕高申请人:淮海工学院