专利名称：cAMP或cGMP的检测方法
cAMP或cGMP的检测方法
背景技术：
核苷酸在细胞的信号转导中起重要作用。例如，核苷酸cAMP涉及G 蛋白偶联受体(GPCR)的信号转导。
GPCR构成了最大类的药物靶点。在药物发明中，为了检测潜在的新 药针对GPCR的活性，需要监控受体在其所处细胞环境中的功能的测定 法。对于药物发明过程中甚为初期的高流通量篩选，这些功能试验需要是 简单而含有较少的步骤，是灵敏的以检测早期化合物的微小效应，而且它 们必须包含有力的读数，以适用于自动化的方式。
GPCR的功能测定可以依托于对第二信使分子的检测，以反映受体的 活化状态。这种第二信使分子是在腺苷酸环化酶活性的调节之下产生的环 腺苷酸(cAMP)。 XV. Thomsen等人总结回顾了 一下商业上可用的功能测定 试剂盒，所述试剂盒是基于荧光或化学发光读数来测定细胞内cAMP的水 平(Current Opinion in Biotechnology 2005， 16， 655-665)。
发明内容
这些试剂盒都耗时而且复杂。因此，本发明提供了一种检测cAMP的 简易测定法，及其在间接检测受体活性和筛选配体中的用途。
这项发明是基于 一个令人称奇的事实，通过核碱基修饰设计的带有 cAMP衍生物的缀合物能够淬灭荧光团的荧光发射，而cAMP不淬灭此荧 光团。
因此，本发明提供了一种体外检测混合物中cAMP方法，所述方法包 含a)将包含cAMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物相接触，其中 所述示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，以及
b)测量焚光变化。
4意外的是，这种试验也能够用于检测混合物中的cGMP。与cAMP不同，cGMP具有淬灭的能力，但是仅在其浓度大约在lmM及以上时才有作用。然而细胞内的cGMP浓度通常在低于1 mM几个数量级的范围内。
因此，本发明提供了体外检测混合物中cAMP或cGMP的方法，所述方法包括a)将包含cAMP或cGMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物相接触，其中所述示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，以及b)测量荧光变化。
优选将测量出来的荧光变化与对照比较。此对照可以是预定量的核苷酸的标准曲线。
术语"混合物"是指把两种或更多种物质混合在一起，并且在这种方式之下，每种物质都保持不变。所述混合物包括但并不限于细胞裂解物、细胞培养上清液、生物体液如血清、血浆、尿液、支气管灌洗液、唾液，以及像脑脊液之类的活组织检查。
术语"核苷酸"是指包含核碱基、糖以及一个(MP)、两个(DP)或者三个(TP)磷酸基团的分子。核碱基有五种，分别是腺嘌呤(A)、尿嘧啶(U)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)和胞嘧咬(C)。糖分子是核糖或者脱氧核糖(d)。
术语"环核苷酸"是指核苷酸，其中该磷睃基与糖的两个羟基键合，形成环状结构。这些包括环腺苷酸(cAMP)、环胞苷酸(cCMP)、环胸腺苷酸(cTMP)、环尿苷酸(cUMP)和环鸟苷酸(cGMP)。
此处所用的术语"cAMP淬灭剂"是指cAMP的衍生物，该衍生物能够淬灭测定中所用的荧光团。所述荧光团与该淬灭剂是共价相连的。该cAMP淬灭剂是用电子供体取代核碱基而产生的cAMP衍生物。如图11B所示，核碱基置换的位置是2位或8位。优选cAMP衍生物是2-(6-氨基已基)氨基-cAMP (2-AHA-cAMP) 、 8-(6-氨基已基)氨基-cAMP(8-AHA國cAMP)、 8-(8-氨基-3,6-二氧杂辛氨基(dioxaoctylamino))誦cAMP(8画ADOA-cAMP) 、 8-羟基-cAMP (8-OH-cAMP) 、 8-(4-巯基丁基硫(Mercaptobutylthio))- cAMP(8-MBT-cAMP)。其中最优选的衍生物是2-AHA-cAMP。术语"荧光团"是指当用特定波长^JC时发出荧光并且可静态淬灭的分子。荧光团优选溱衍生物，例如EP747447中所述的MR121,Evoblue30或JA314。此外优选可用的荧光团还有ATTO 5卯、ATTO 655、 ATTO 680、Atto 700 (Atto國Tec GmbH, Am Eichenhang 50， 57076 Siegen，德国)。更优选的荧光团是MR121或者Atto 700。
此处所用的术语"去淬灭剂"是指通过结合到cAMP淬灭剂上而逆转cAMP淬灭剂的淬灭效应的分子。其本质是去淬灭剂能够结合cAMP淬灭剂以及将,皮检测的环核苷酸，即cAMP或cGMP。
去淬灭剂可以是结合蛋白质。去淬灭剂优选是cAMP特异的抗体。此抗体可以是单克隆或者多克隆抗体。如果去淬灭剂是蛋白质，pH值需要调到该蛋白质能够结合的范围。通常这个范围是pH6.8到7.8。
本领域技术人员都熟知生产核苷酸特异抗体的方法，例如Kohler和Milstein (Nature 1975， 256: 495-497)描述了生产单克隆抗体的方法。
检测复合物包含示踪物和去淬灭剂。示踪物由共价连接于cAMP淬灭剂的荧光团组成。如果激发该检测复合物会发出荧光。当检测复合物接触到核苷酸，去淬灭剂结合一定百分比的游离核苷酸并从检测复合物中分离。此时示踪物不再被去淬灭，并且当被激发时仅显示出较低的荧光或者没有荧光。这个荧光的减少量可表示系统中存在的核苷酸的量。
荧光的改变可以与对照(如标准曲线)比较。通过测量将检测的预定量核苷酸的焚光变化，可以建立标准曲线。
本发明还提供了前述在混合物中测定cAMP浓度的方法的用途。此外，前述方法可以用来测定受体活性，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP。所述受体优选G蛋白偶联受体(GPCR)。
因此，本发明也提供了测定受体活性的方法，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP，所述方法包括
a) 使表达所述受体的细胞与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
b) 裂解细胞，和
6C)测量荧光变化。
或者，步骤b)可以放在步骤a)之前。优选的实施方案是测定GPCR活性的方法，包括
a) 使表达GPCR的细胞接触示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
b) 裂解细胞，和
c) 测量荧光变化。
或者，步骤b)可以放在步骤a)之前。
测量出来的荧光变化优选与对照比较。对照可以是关于预定量的cAMP或者cGMP的标准曲线。
另外，本发明还提供了前述为受体筛选配体方法的用途，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP。所述受体优选GPCR。
因此，本发明也提供了为受体筛选配体的方法，在该受体的信号转导中包含cAMP或cGMP,所述方法包括
a) 使候选化合物与表达所述受体的细胞相接触，
b) 加入示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
c) 裂解细胞
d) 测量荧光变化。
或者，步骤c)可以放在步骤b)之前。优选的实施方案是为GPCR篩选配体的方法，包括
a) 使候选化合物与表达所述受体的细胞相接触，
b) 往细胞中加入示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，
c) 裂解细胞
d) 测量荧光变化。
或者，步骤c)可以放在步骤b)之前。
优选将测量出来的荧光变化与对照比较。对照可以是关于预定量的核
7苷酸的标准曲线。
表达受体(例如GPCR)的细胞可以是内源表达所述受体的细胞，或者所述受体的转基因细胞。
用本领域众所周知的方法可以产生这样的转基因细胞。优选的方法包括以下步骤克隆编码目的受体的DNA,将所述DNA插入载体并将该载体导入细胞。所述载体优选包含序列段，其与细胞基因组中适于同源重组的序列段同源，这种情况适于同源重组，由此^使编码受体的DNA靶向插入到细胞基因组中。
此处所用的术语"配体"是指与受体结合的分子。配体可以是激动剂、拮抗物、调节子、部分激动剂或者部分拮抗物。
术语"激动剂"是指结合受体并能触发细胞内应答的分子。术语"部分激动剂"是指部分激活受体的分子。术语"拮抗物"是指一种分子，该分子结合受体，但是未能激活受体，而事实上阻断了激动剂对受体的活化作用。
本发明也涉及试剂盒，该试剂盒包含去淬灭剂和如前所述的与cAMP淬灭剂共价连接的荧光团。试剂盒包含的去淬灭剂和修饰的荧光团，可以是分开的形式或者是复合物的形式。
在分别测量各自荧光团水平的情况下，该试剂盒可能包含其他任何被认为恰当的成分，如合适的緩冲液、滤器等。
可选的，该试剂盒可以另外包含使用手册，用于解释关于确定GPCR活性的所有测量法中的结果。这样的手册尤其可以包括解释测量的荧光变化的信息，优选标准曲线。
现已对本发明进行了一般性描述，参考具体的实施例连同下列附图将对其有更好的了解，此处包括的实施例仅意在说明，并且除非另有说明，并没非意在限制。
图1显示MR121荧光团作为NHS酯用于标记实施例中的cAMP衍生物的分子结构。
图2显示MR121-2-ANA-cAMP的分子结构。
图3以测定细胞中cAMP浓度为例，图示说明其测定原理。裂解细胞并且在细胞裂解液中加入检测混合物。该检测混合物包含与cAMP淬灭剂(cAMP衍生物，如2-AHA-cAMP)连接的荧光团(如MR121)和cAMP抗体(如小鼠抗-cAMP的单克隆抗体)的复合物。由抗体去除了淬灭剂对荧光团的淬灭效应(等同于去淬灭剂)。当接触到cAMP时，该抗体与之结合，而不再与cAMP衍生物结合。在没有抗体的去淬灭效应的情况下，所述cAMP淬灭剂淬灭荧光团并且导致荧光信号的减弱。cAMP浓度越高，则焚光越弱。
图4图示说明MR121和色氨酸(a)、 2-AHA-cAMP (b)、 cAMP (c)的Stern-Volmer图。IG/I:荧光强度的变化(I。是没有淬灭剂情况下的荧光强度，I是有淬灭剂情况下的荧光强度)，t。/t:荧光寿命的变化(t。是没有淬灭剂情况下的荧光寿命，t是有淬灭剂情况下的荧光寿命)。
图5图示说明对于不同的cAMP衍生物(8-AHA-cAMP 、2画AHA-cAMP、 N-6-氨基己基-cAMP、 8-羟基-cAMP、 8-ADOA-cAMP、2'-AEC-cAMP、 8-MBT-cAMP)荧光强度的减少量。8-AHA-cAMP的超出约5mM的大的线性偏差是由于溶解性的问题。10/1:荧光强度变化。
图6图示说明示踪物MR121-2-AHA-cAMP的荧光的淬灭和去泮灭，此处用了两种不同的特异识别cAMP的抗体A和B。 Ab:抗体。
图 7图示说明在示踪物浓度固定的前提下(10 nMMR121-2-AHA-cAMP)抗-cAMP抗体的滴定。实验数据的拟合得到28 nM的IQ值。
图8图示说明两条cAMP标准曲线，其一在无细胞情况下(实心菱形)而另一在有细胞的情况下(空心菱形)，在无细胞和有细胞的情况下，分别拟合曲线得到IC50=109 nM和119 nM。
图9图示"i兌明毛喉素剂量-应答曲线和以10000个细胞/孔的cAMP标准曲线，拟合曲线得到cAMP的IC5。=102 nM、毛喉素IC5。=3.7 pM。
9图10 图示i兌明下列分子MR121-8-AHA-cAMP 、ATT05卯陽8國AHA-cAMP以及ATT0655-8-AHA-cAMP的Stern-Vollmer图。
图11显示环腺苷酸(cAMP)的化学结构(A)和cAMP的噪呤环(B)。图12显示cAMP衍生物的化学结构
A) : 2-(6-氨基己基)氨基-cAMP (2-AHA画cAMP)，
B) : 8-羟基誦cAMP (8-OH-cAMP)
C) : 8-(4-巯基丁^5克)-eAMP(8-MBT-cAMP)
D) : 8- (8-氨基-3， 6國二氧杂辛^J^) (8-ADOA画cAMP)
E) : 8國(6-氨基己基)^J^cAMP(8-AHA國cAMP)
F) : N-6-氨基己基-cAMP
G) : 2'画AEC-cAMP (AEC= 3國^J^-9-乙基呻喳)
图13图示说明高达13 mM的cAMP、 cGMP、 cUMP和cTMP对MR121的淬灭(a)。 (b)图示说明在Stern-Vollmer图中，浓度高达10 的cAMP和cGMP对MR121的淬灭。在低浓度时，cAMP和cGMP都不淬灭MR121。
图14图示+兌明荧光减弱与cAMP和cGMP浓度的相关性(标准曲线)。图15图示说明以Atto700-2-AHA-cAMP为示踪物，以抗cAMP抗体
为去淬灭剂的情况下，荧光减弱与cAMP浓度的相关性(cAMP标准曲线)。
拟合曲线得到IC5。=48 nM。
实施例
除非另有指出，实施例中所提及的商业上可获得的试剂均根据厂商说明书使用。
试剂和使用仪器
cAMP、 cGMP、 2-AHA-cAMP、 8-AHA醫cAMP、 8-ADOA曙cAMP、2'-AEC-cAMP、 8-MBT-cAMP、 N-6-氨基己基-cAMP和8-羟基-cAMP购自Biolog Life Science Institute (28071 Bremen, Germany), MR121 NHS 酉旨和N-6-氨基己基國cAMP购自Roche diagnostics (Penzberg， Germany)， 和Atto 700 NHS酯购自Atto國Tec GmbH (Atto國Tec GmbH, Am Eichenhang 50， 57076 Siegen， Germany)。小鼠抗-cAMP单克隆抗体参照Kohler和 Milstein所述方法自行制备(Nature 1975， 256: 495-497)。
所有的实验都在含0.1。/。BSA(白蛋白，牛血清$96%,基本上无脂肪 酸，A6003， Sigma國Aldrich Chemie GmbH, Industriestrasse 25， CH-9471 Buchs， Switzerland)的PBS (pH 7.4)中进行。裂解细胞所用的是3 x PBS裂 解緩冲液(pH 7.4)，其含有0.1% BSA (牛血清白蛋白，组分V， $96%, 5480， Sigma-Aldrich Chemie GmbH)、 0.075% NP40(乙基苯基聚乙二醇，19628， USB Corporation, Cleveland, OH USA)以及0.3Xo NaN3 (分析纯，^99%, 712卯，Sigma-Aldrich Chemie GmbH)。细胞生长培养液是含有10% FCS 和1。/o青霉素-链霉素(Gibco 15140-122)的F-12K (Gibco 21127-002)。
所有的荧光强度测量都是通过装备有高压氙弧灯的平板::显示荧光读 出器(Evotec Technologies GmbH, Schnackenburgallee 114， D-22525 Hamburg, Germany)来完成，使用630 nm的激发滤光器(带宽50 nm)和695 nm的发射滤光器(带宽55 nm)测量MR121,使用655 nm的激发滤光器(带 宽50 nm)和710 nm的发射滤光器(带宽40 nm)测量Atto 700。通过使用衰 减滤光器和改变瀑光时间，将荧光强度调节到所用iCCD相机最强信号的 约60%。寿命的测量是通过平板::显示TRF读出器(Evotec Technologies GmbH, Schnackenburgallee 114， D-22525 Hamburg, Germany)来进行，该 仪器使用OPO系统作为光源(GWU Lasertechnik Vertriebsgesellschaft m.b.H.， 50374 Erftstadt， Germany),激发波调至630 nm且发射波调至695 nm。
所有实验都是在384孔微量滴定板(Costar 384,黑色透明(black with clear)、平底、组织培养处理的，Prod. No. 3712)中完成的。总测定体积在 30-40 jtl之间变动。
ii实施例1: MR121的淬灭 1.1环核苷酸的淬灭能力
将20 pi MR121 (溶于PBS，终浓度20 nM)和20 pl溶于PBS的淬灭 剂(测定中DMSO的终浓度为1.25%)加入微量滴定板。室温培育30分钟 之后测量荧光和寿命。测试的环核苷酸浓度为0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 1.6、 3.2、 6.4及12.8 mM。
较高浓度的cGMP能淬灭MR121 (图13a)。然而，由于cGMP在测 定中达不到这种浓度，这种淬灭并不会影响该测定窗。在浓度较低，最高 至10 jiM的情形下(与细胞内浓度范围相对应)，cAMP和cGMP都不会淬 灭荧光团(图13b)。在用MR121-2-AHA-cAMP示踪的置换测定中，用cAMP 或cGMP置换的测定窗其1/1。从1 (结合抗体使MR121-2-AHA-cAMP去淬 灭)变为1.7 (由2-AHA-cAMP淬灭MR121)。
1.2用cAMP矛汴生物淬灭
为了分析淬灭的机制，测量游离MR121的荧光强度和荧光寿命作为 不同分子(色氨酸、cAMP、 2-AHA-cAMP、 8-AHA-cAMP、 8-ADOA-cAMP、 2，-AEC-cAMP、 N-6誦氨基己基國cAMP、 8陽MBT-cAMP及8國羟基-cAMP, 见图4、 5)的函数。
将20 jil MR121 (溶于PBS,终浓度20 nM)和20 pl溶于PBS的淬灭 剂(测定中DMSO的终浓度为1.25%)加入微量滴定板。室温培育30分钟 之后测量荧光和寿命。使用色氨酸的测定中观察到荧光强度的减弱而荧光 寿命并没有变化。令人惊讶的是，2-AHA-cAMP、 8-AHA-cAMP、 8-ADOA-cAMP、 8-MBT-cAMP及8-羟基-cAMP的荧光强度都有显著减弱 (同时荧光寿命不变)，而cAMP、 2，-AEC-cAMP及N-6-t^己基-cAMP 一点都没有显示出来淬灭。由参考文献2-5项类推我们得出结论，MR121 与2画AHA-cAMP、 8-AHA-cAMP、 8-ADOA-cAMP、 8國MBT-cAMP及8-羟基-cAMP形成无荧光的基态复合物，但是不与cAMP、 2，-AEC-cAMP 及N-6-氨基己基-cAMP形成此类复合物。
在2-AHA-、 8-AHA-及8-ADOA-cAMP中，连接体是通过胺键与腺苷酸的嘌呤环系统直接偶联，在8-MBT-cAMP中通过硫，和在8-羟基 -cAMP中通过氧键与腺苷酸的噤呤环系统直接偶联。然而，在N-6-氨基己 基-cAMP和2，-AEC-cAMP中，连接体是偶联于腺苷酸的胺基基团或者核 糖部分。显然，腺苷酸的修饰导致了其环系统电子态的变化，这种变化随 后促进其与溱染料形成复合物。
在图5中，对所有研究的cAMP衍生物进行荧光强度变化(I。/I)的作图。 締合常数Ks的计算是从图的线性区域(最高至3.2 mM)而来， 8誦AHA國cAMP、 8-ADOA-cAMP、 2國AHA-cAMP、 8-MBT-cAMP及8曙羟基 -cAMP分别对应于514]Vr1、 475 M"、 512 M-1、 758 M"和236 M-1 。该淬 灭非常有效，大多数cAMP衍生物的Ks值与文献中报道的色氨酸的IQ值 (约2加M,相比是后者的两倍以上。
当MR121-2-AHA-cAMP与cAMP特异的抗体相结合，这种无荧光的 复合物不能形成，并且观察到MR121荧光强度的增强(图6)。在含有0.1% BSA的PBS中测量20 nM游离的MR121、 20 nM MR121-2画AHA画cAMP (淬灭最强)的荧光强度，以及20 nM MR121-2-AHA-cAMP和1000 nM抗 体的混合物(去淬灭最强)的荧光强度。
与游离的MR121 (100%)相比，示踪物显示的荧光强度为25%。抗 体A去淬灭荧光至61V。，抗体B去淬灭萸光至87。/。。显然，去淬灭的程 度也依赖于抗-cAMP抗体的结合亲和力以及构成抗体结合结构域的氨基 酸序列。在抗体结合域附近存在的色氨酸可以在一定程度上淬灭MR121 的荧光。这便能解释不同的抗体显示出不同的去淬灭程度。
对于该测定，关键在于，所用的抗体要识别作为示踪物的经过标记和 修饰的cAMP和细胞产生的"纯的"cAMP。为了进一步改善该试验，我 们使用了抗体A，尽管其去淬灭效果相较而言差于抗体B。可是抗体A能 更有效的用cAMP置换示踪物，而且对于M强有力的测定法，这个全淬 灭-全去淬灭窗已经足够好。
实施例2:抗cAMP抗体Kd值的测定
抗-cAMP抗体(抗体A)与MR121-2-AHA-cAMP的结合亲和力，是通
13过在1 x裂解緩冲液中用抗体滴定示踪物的几个浓度(2， 6， 10， 15和20 nM) 而测定的。将20 pl抗-cAMP稀释液加入384孔孩i量滴定板， 一组四个重 复。接着将20 pi MR121-2-AHA-cAMP加入每个孔内，在384孔摇动器上 室温孵育30分钟，然后进行荧光强度读数。通过将未加入抗体的数值设定 为0%使数据归一化。图7显示了相应的滴定曲线。由四参数模型拟合得 出Kd值，在不同的示踪物浓度下Kd值在25到29nM之间。
实施例3:剂量-应答曲线
cAMP
基于Kd =28 nM , 选用 40 nM抗-cAMP抗体和20 nM MR121-2-AHA-cAMP对cAMP进行灵敏检测，cAMP的ICs。值在100 nM 左右。图8显示了两条cAMP标准曲线， 一条在无细胞的情况下， 一条在 有细胞的情况下。对于无细胞情况下的标准曲线，将20^稀释于含0.1% BSA的PBS屮的cAlV化在384孔椒量湳定板中滴足，接着力口入10 pl检测 混合物(120 nM抗-cAMP抗体和60 nM MR121-2-AHA-cAMP溶于3 x裂 解緩沖液中)。对于有细胞情况下的标准曲线，按照10,000个细胞/孔 (CHO-Kl)在25 pl培养液中铺板，在37°C保持20小时。然后去除培养液， 加入20 jliI稀释于含0.1% BSA的PBS中的cAMP，接着加入10 jil检测混 合物。培养板接着在384孔摇动器上室温孵育，最后读出荧光信号。两条 标准曲线测定的ICs。值相似(在无细胞和有细胞的情况下，分别为109 nM 和119nM，见图8)。
从时间和对DMSO和BSA的耐受性的方面考虑，在无细胞的情形下， 用裂解緩冲液中的检测复合物检验了 cAMP标准曲线的稳定性。高达5% 的DMSO和0.8%的BSA不会改变ICso值，并且也没有观察到信号上重 大的跌落。信号和IC幼值稳定了至少六小时。
图15显示了 cAMP剂量-应答曲线，该曲线是在5 nM Atto700-2-AHA-cAMP示踪物和5 nM抗体，IC幼值为48 nM的条件下完 成的。将cAMP稀释于含0.1% BSA的PBS中。在384孔微量滴定板中滴 定的cAMP稀释液，并加入10 pl检测混合物。培养板接着在384孔摇动器上室温孵育，最后读出荧光信号。
cGMP
图14显示了 cAMP和cGMP标准曲线的对比，所述曲线是在20 nM MR121-2-AHA-cAMP示踪物和40 nM抗体，cAMP的IC幼值为134 nM 及cGMP的IC幼值为387 nM的条件下完成的。ICs。值以及cAMP和cGMP 的灵敏度依赖于抗体的选择。不同的抗体可能对于cGMP更敏感，而对 cAMP则不那么敏感。
cAMP和cGMP稀释于含0.1% BSA的PBS中。对于无细胞的标准曲 线，20^1的cAMP稀释液和20|nl的cGMP稀释液将在384孔微量滴定板 中被滴定，并加入10 pl检测混合物(40 nM抗-cAMP抗体和20 nM MR121-2-AHA-cAMP溶于3 x裂解緩冲液中)。培养板接着在384孔摇动 器上室温孵育，最后读出荧光信号。
实施例4: cAMP细胞测定
用CHO-K1细胞测定了毛喉素的剂量-应答曲线。2,500到20,000个细 胞/孔的细胞铺在培养板中，在25jil培养液中37。C培养20小时。去除培 养液，加入10 Jul含0.1% BSA的PBS和1 mM IBMX，细胞在37。C培养 60分钟。加入10 ^在PBS中的毛喉素稀释液从0.01到300 jiM (在20 测定体积中的终浓度)，该稀释液中还包括0.1 % BSA以及1 mM IBMX, 然后在37。C再孵育30分钟。接着通过加入溶于3 x裂解緩冲液中的10 jtl 检测混合物(在30 jil中终浓度为20 nM MR121-2-AHA-cAMP和40 nM抗 -cAMP抗体)裂解细胞。培养板接着在384孔摇动器上室温孵育，最后读 出荧光信号。用10,000细胞/孔的测定获得cAMP的最高水平和毛喉素的 最小IC幼值(3.7 pM)。图9显示了毛喉素剂量-应答曲线和用10,000细胞/ 孔的试验的cAMP标准曲线。
实施例5: ATT05卯和ATT0655的淬灭
分别在微量滴定板中加入20 pl的ATT05卯和ATT0655 (溶于PBS 中，终浓度20 nM)以及溶于PBS (测定中DMSO终浓度1.25%)的20 ^tl
15淬灭剂(8-AHA-cAMP)。在室温孵育30分钟后，测量荧光和寿命。结果并 入Stern-Vollmer图。締合常数Ks的计算是从图的线性区域(最高至3.2 mM) 而来的。
Atto590和Atto655能被8-AHA-cAMP淬灭，其Ks值分别为Ks=282 M"和Ks-347M"(图10)。
权利要求
1. 体外检测cAMP或cGMP的方法，其包括a)使包含cAMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中所述示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，和b)测量荧光变化。
2. 根据权利要求l的方法，其中该混合物是细胞裂解物。
3. 体外测定受体活性的方法，其中受体的信号转导包括cAMP或 cGMPa) 使表达所述受体的细胞与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中示 踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，b) 裂解细力包，和c) 测量荧光变化。
4. 体外为受体筛选配体的方法，其中受体的信号转导包括cAMP或 cGMP，所述方法包括a) 使候选化合物与表达所述受体的细胞接触b) 向细胞加入示踪物和去淬灭剂的复合物，其中示踪物是共价连接在 cAMP淬灭剂上的荧光团，c) 裂解细胞，和d) 测量荧光变化。
5. 根据权利要求3或4的方法，其中该受体为GPCR。
6. 根据权利要求1-5中的任一项的方法，其中所述的cAMP淬灭剂为 2-AHA-cAMP 、 8-AHA-cAMP 、 8國ADOA國cAMP 、 8國OH-cAMP或 8國MBT画cAMP。
7. 根据权利要求1-5中的任一项的方法，其中所述的cAMP淬灭剂为 2誦AHA國cAMP。
8. 根据权利要求1-7中的任一项的方法，其中所述的荧光团为 MR121、 Evoblue30、 JA314或Atto700。
9. 根据权利要求l-8中的任一项的方法，其中将测量的荧光变化与对 照进行比较。
10. 根据权利要求1、 2、 6-9中任一项的方法的用途，其用于确定混 合物中的cAMP或cGMP的浓度。
11. 试剂盒，其包含去淬灭剂和共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团。
12. 根据权利要求ll的试剂盒，其中cAMP衍生物是2-AHA-cAMP、 8-AHA陽cAMP、 8-ADOA國cAMP、 8誦OH画cAMP或8画MBT-cAMP。
13. 基本如前所述的方法和用途，尤其是参考前述实施例。
全文摘要
本发明涉及一种cAMP或cGMP的检测方法，所述方法为体外检测法，其包括a)使包含cAMP的混合物与示踪物和去淬灭剂的复合物接触，其中示踪物是共价连接在cAMP淬灭剂上的荧光团，和b)测量荧光变化。此外，本发明涉及所述方法用于确定混合物中cAMP或cGMP浓度的用途，用于确定受体活性的用途，其中受体的信号转导包含cAMP或cGMP，以及用于为这类受体筛选配体的用途。
文档编号G01N21/00GK101464250SQ20071015973
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月21日 优先权日2006年12月21日
发明者D·罗特, H·马蒂勒, T·恩德勒 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司