专利名称：：早期检测麻痹性贝毒毒性的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物工程
技术领域：
的检测方法，具体是一种早期检测麻痹性贝毒毒性的方法。
背景技术：
：赤潮的频繁爆发，不仅恶化了海洋环境，更重要的是赤潮当中很多藻类可产生毒素，这些毒素在海产品中富集，通过食物链的传递使人在食用海产品后造成中毒现象。虽然藻毒素大多来自于有毒赤潮藻类，但藻类产生的毒素往往通过贝类、鱼类等媒介富集，造成人类中毒，因此这些毒素通常被称为贝毒，根据毒素的作用机制不同，藻毒素分为以下五种麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)、记忆缺失性贝毒(ASP)、神经性贝毒(NSP)和西加鱼毒(CFP)，其中麻痹性贝毒是目前研究最为广泛，也是对人类健康危害最大的赤潮毒素。而麻痹性贝毒(PSP)的基本结构是由两个胍盐基的四水化嘌呤，目前发现的大约20种化合物属于麻痹性贝毒一族，有以下几类(l)氨基甲酸酯类毒素(Carbamatetoxins),包括石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)、新石房蛤毒素(Neosaxitonxin，neoSTX)，漆沟藻毒素1-4(Gonyautoxins，GTX1-4);(2)N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocabamoyltoxins)，包括GTX5(Bl)、GTX6(B6)，C1-4;(3)脱氨基甲酰基类毒素(decarbamoyltoxins),包括dcSTX、dcneoSTX、dcGTXl-4;(4)N-羟基类毒素(N-hydroxycarb柳oyltoxins)包括hySTX和hyneoSTX。目前，用于麻痹性贝毒检测的方法有生物测试法(Bioassay)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用法(LC/MS)、酶联免疫法(ELISA)等。小白鼠生物检测法是目前唯一得到国际公认的标准生物检测麻痹性贝毒的方法，此法利用小白鼠腹腔注射麻痹性贝毒提取液后测定其死亡时间来反映毒素的含量，以"鼠单位"(MU)来表达，鼠单位的定义是一只20g重的小白鼠腹腔注射后在15min内死亡的毒素含量即为一个鼠单位。1MU的毒素含量相当于0.18g的STX。但是生物测试法因需要使用大量动物且只能定性不能定量受到批评，而且该法是在小鼠死亡的基础上得到麻痹性贝毒的含量，起不到早期预测的目的。化学法包括HPLC/MS/MS等仪器分析法，采用HPLC/MS/MS可以检测所有毒素成份及其含量，其准确性和重现性较高，检测时间比较短。其缺陷在于缺乏标准品，麻痹性贝类毒素由20多种化合物组成，目前能作为商品流通的标准物仅有89种(GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、STX、Neo、GTX5、GTX6、dcSTX)。而且高效液相色谱法不能同时检测大量样品，毒素标准品价格昂贵，样品前处理要求较高，需要昂贵的设备及高素质的操作人员，从而限制了高效液相色谱的使用。基于免疫技术开发的藻毒素ELISA方法，该方法的灵敏度可达到pg级，并具有更高的置信度，目前国外的一些化学试剂公司已有商品化的成套试剂盒出售。但我国依然属于空白，且全部依靠进口，昂贵的价格限制了贝类赤潮藻毒素检测的免疫方法在基层常规检测中的普及应用。经对现有技术的文献检索发现，GiresUsup，等在《Toxicon》(生物毒素)(2005，46:93-98)上发表的(Arapiddetectionmethodforparalyticshellfishpoisoningtoxinsbycellbioassay)(利用细胞快速检测麻痹性贝毒毒性的方法)，该文提出利用毒素对细胞的毒性作用来检测毒素方法，具体方法为在培养的神经细胞中加入^+通道活化剂藜卢定或化+/1(+41酶抑制剂乌本苷，细胞会由于Na+内流过多而造成肿胀，甚至死亡。但如果在以上过程中同时加入具Na+通道阻断作用的麻痹性贝毒毒素，Na+内流会因拮抗作用而受到限制，使得细胞成活，由此可以确定毒素的存在。其不足在于检测时间过长需要6小时甚至更长时间，细胞培养需要严格的培养条件和高素质的专业人员，所以该方法同样很难在现场和海产品市场推广。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，使其解决麻痹性贝毒现场、快速、大批量样品的检测分析及毒性早期检测问题，比目前国内常用的小鼠法相比时间提前2—10倍，而且个体没有出现任何症状，适于现场快速、大批量样品的检测分析及毒性早期检测。本发明仅需检测普通生化指标的改变，操作简单方便，适合现场和基层检测部门推广使用。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明采用乙酰胆碱和一氧化氮合酶作为生物标志物，利用该两种普通生化指标的变化特点检测贝类毒素的含量，具体方法为将现场贝类样品制作成检测液，然后用检测液腹腔注射小鼠，检测小鼠脑中乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力的变化，由乙酰胆碱(Ach)含量和一氧化氮合酶(N0S)活力水平得到麻痹性贝毒含量，从而早期检测麻痹性贝毒毒性。本发明具体包括以下步骤(1)制备样品检测液贝类样品采集处理后，溶于HC1中得样品原液，原液用生理盐水稀释得到样品检测液。所述的HC1，其浓度为0.lmol/L。(2)小鼠暴露选择健康的ICR(InstituteofCancerResearcch，美国癌症研究所)品系成年小鼠，用检测液对小鼠进行腹腔注射，15min后取材。(3)脑匀浆制备取注射后小鼠的脑组织碎块放入匀浆介质中进行匀浆。所述的匀浆介质是由三羟甲基胺基甲烷(Tris)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，蔗糖配置而成，其摩尔比为Tris:EDTA-2Na:蔗糖=100:1:100。其配置方法为，将Tris，EDTA-2Na用水溶解，再用20Ommol/LHC1进行滴定至pH偏弱碱性，然后加蔗糖，以微波进行消毒，冷却后放入冰箱备用。(4)测定乙酰胆碱(Ach)含量ACh和碱性盐酸羟胺反应生成乙酰羟胺酸，产物在酸性条件下与三氯化铁形成棕黄色化合物，于波长540mn处测其吸光度。(5)测定一氧化氮合酶(N0S)活力N0S催化左旋精氨酸和分子氧反应可生成一氧化氮(N0)，N0与亲核性物质生成有色化合物，在波长530nm处测定其吸光度，根据吸光度计算出N0S活力。(6)结果判断依据乙酰胆碱(Ach)含量和NOS活力水平分析麻痹性贝毒含量，从而早期检测其毒性。本发明的特征是用现场贝类检测液暴露小鼠，通过神经递质指标变化来检测麻痹性贝毒毒性。神经递质是化学传递物质，主要在神经元中合成并储存于突触前囊泡内，信息传递过程中由突触前膜释放到突触间隙，作用于相邻神经元突触后膜，从而产生生理效应。按照神经信息生物学的划分，神经递质属于细胞外的信使物质，被称为第一信使。它可以通过作用于特定的受体，导致细胞内生理状态的改变或新物质产生，如细胞电势的改变、开放离子通道、激活胞内第二信使，从而将外界信息传入细胞内。神经递质在神经系统复杂而统一的信息传递过程中起着非常重要的作用。因本发明中采用的指标为神经递质指标乙酰胆碱(Ach)和一氧化氮合酶(N0S)，这些指标变化不受现场贝类种类的影响，指标检测不需要昂贵的仪器设备，克服了细胞培养繁琐而又非常专业细致的工作，可以在2小时内确定检测结果，完全可以在现场进行，能同时反应毒素水平与毒力特点。在中枢神经系统中，乙酰胆碱主要存在于大脑皮层、纹状体、海马、丘脑等处，与学习记忆、感觉运动等神经活动有密切关系。而一氧化氮合酶是合成一氧化氮(N0)的关键酶，一氧化氮合酶主要存在于神经吞噬细胞以及神经细胞中。正常情况下，该两种神经递质含量比较稳定，乙酰胆碱作为细胞外的信号分子，储存于囊泡中，神经活动兴奋期，Ca"进入细胞产生兴奋释放偶联，使囊泡与突出前膜结合，胞裂释放乙酰胆碱，释放至突触间隙的乙酰胆碱绝大部分被胆碱酯酶水解。而麻痹性毒素的作用会影响乙酰胆碱的信号传导过程，使得乙酰胆碱无法释放，导致含量的升高。对于一氧化氮合酶正常情况下机体很少表达，但麻痹性贝毒毒素可以诱导一氧化氮合酶的表达。神经递质乙酰胆碱和一氧化氮合酶对麻痹性贝毒很高的灵敏度，在极低的麻痹性贝毒剂量和极短的暴露时间下，乙酰胆碱和一氧化氮合酶活力就出现了显著的改变。说明麻痹性贝毒暴露下小鼠脑乙酰胆碱和一氧化氮合酶活力变化有一定的提前性。所以利用该技术既可用于定量表征麻痹性贝毒剂量-效应(反应)关系，还可以早期检测麻痹性贝毒毒性。随着我国生活水平的提高，公众对海产品的消费日益增加，海产品贝类在养殖过程中容易受到赤潮毒素污染，且目前缺乏海产品的市场准入机制。近年来在我国东海和南海曾多次发生以有毒亚历山大藻为主要赤潮生物之一的大面积赤潮，严重危害海水养殖业和海岸环境。而本发明能够提高麻痹性贝毒毒素检测灵敏度和縮短检测时间，可以保护公众健康及海洋生态环境安全。目前全球赤潮藻毒素检验市场规模超过320亿美元，在我国海产品贝类中赤潮藻毒素的检测还只能用小鼠测试法、高效液相色谱法、色谱/质谱联用法来检测某些毒素，耗时较长，且灵敏度较低。在国外免疫诊断试剂盒已初步用于分析不同类型的藻毒素，这种免疫测试的敏感性要比相应的鼠生物测试法或HPLC方法敏感得多，但价格相当昂贵如96孔直接ELISA试剂盒价格为275欧元，麻痹性贝毒毒素单样检测为18欧元。而本发明能够快速现场检测麻痹性贝毒毒素，与单样毒素检测价格相比至少减少5倍。具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本发明实施例整个检测过程从贝类送检到最后得到结果不会超过2小时，极大縮短了检测时间。本发明所需要的仪器设备为分光光度计、台式低速离心机、水浴锅、手术剪刀、滤纸、移液管、烧杯等，这些设备非常普通、价格便宜，而且完全可以进行便携式的组装。本发明所需要的试剂为盐酸、氢氧化钠、生理盐水、三羟甲基氨基甲垸、乙二胺四乙酸二钠、蔗糖、蒸馏水、硫酸毒扁豆碱、三氯乙酸、三氯化铁、无水磷酸二氢钠等，这些试剂也是非常普通和常见的试剂，所需要的试剂也可以以试剂盒的形式进行携带。所以本发明极大縮短了检测时间，显著降低了检测成本，所需的人员技术水平不高，非常适合基层现场快速检测，符合我国国清。实施例1样品检测液的制备贝类样品采集后清洗外壳的附着物，将贝肉与壳分离，分别挑出消化腺与其它软组织，经溶浆机溶浆后溶于0.lmol/LHC1中，用NaOH调pH值至3_4，水浴加热5分钟，冷却后取上清液离心，离心的上清即为样品原液，原液用0.9%生理盐水稀释得到样品检测液。2小鼠暴露选择健康的ICR(InstituteofCancerResearcch，美国癌症研究所)品系成年小鼠，体重25g-30g，用体重剂量为1ug/kg和lOwg/kg检测液对小鼠进行腹腔注射。暴露15rnin后股动脉取血处死，在冰盘内迅速除去小鼠的脑颅骨，剥离硬脑膜，取出完整的脑组织。每组5只小鼠。3脑匀浆制作称取Tris1.21g(0.Olmol)，EDTA-2Na37.23mg(0.OOOlmol)以及蔗糖3.42g(0.Olmol)。将Tris1.21g及EDTA-2Na37.23mg加水500ml溶解，再用20O鹏ol/LHC1进行滴定至pH7.4，然后加3.42g蔗糖，再加水定容至1000ml。放入盐水瓶中。以微波进行消毒3min-5min，冷却后放入冰箱备用。取小鼠脑组织块(0.21.0g)，在冰冻的生理盐水中漂洗，除去其上粘附的血液和血块，滤纸拭干，称重，然后放入510ml的小烧杯中。匀桨介质的重量为组织块重的9倍。用移液枪取总量为2/3的匀浆介质于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织。将剪碎的组织迅速倒入玻璃匀浆管，再倒入剩余的1/3匀浆介质，冲洗后一起倒入管中。左手持匀浆管将下端插入盛冰水混和物的烧杯或其它器皿中，右手将捣碎杆垂直插入套管中上下转动研磨数十次(35min)，使组织充分研碎匀浆化。匀浆以3000r/min4000r/min离心3min5min，取适量上清液进行神经递质指标测定。4乙酰胆碱测定(Ach)取组织匀浆0.8mL，加入1.4mL双蒸水混合。加入0.2mL硫酸毒扁豆碱，缓慢滴加三氯乙酸0.8mL，充分混匀后离心(3000转/min，2min)。分别取上清lmL于测定管和对照管中。另设标准管与空白管，标准管加乙酰胆碱标准溶液O.lmL、双蒸水0.65mL、三氯乙酸0.25mL;空白管加入双蒸水0.75mL、三氯乙酸0.25mL。测定、标准、空白三管。显色步骤操作相同加入碱性羟胺1.0mL，混匀，静置5min;加入HC10.5mL，加入三氯化铁0.5mL。对照管显色步骤与上面顺序相反。反应15min，于600nm，lcm光径比色，读取吸光度值。组织匀浆中Ach含量计n^/t、测定管OD值-对照管OD值^j誕&非a旦^/,、AChW/m,t)=标准管。D值—空白管。D值x50x4+样种蛋白曰里Ong/mD5—氧化氮合酶(NOS)测定测定步骤测定步骤见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>样本(ml)A*试剂一底物缓冲液"2002001)试剂二促进剂(u1)1010试剂三显色剂(u1)100100混匀，37'C水浴反应10min试剂四透明剂U1)100100试剂五终止液(ul)20002000最后，混匀，530nm处，lcm光径，蒸馏水调零，测各管的吸光度值。计算公式區(U/ml)=测定管OD—空白管OD反应液总体积1Mnnn呈色物纳摩尔消光系数取样量比色光径x反应时间'6结果判断所测结果采用公开软件一SPSSll.0软件进行分析，均值间比较采用t检验，偏方差分析，不同变量间的相关性分析采用偏相关分析。依据乙酰胆碱(Ach)含量和NOS活力水平，分析麻痹性贝毒含量，从而早期检测其毒性。结果显示乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力均随检测液浓度的增加而上升，而且具有显著性差异。当麻痹性贝毒毒素含量在小鼠半数致死量浓度10yg/kg的1/10即1ug/kg时，乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力也均表现出明显的改变，而在此浓度暴露下15min时，小鼠没有表现任何症状，与空白组相比从宏观个体上没有出现任何的差异，但脑中脑乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力均表现出显著变化，所以利用该生物标志物能够早期检测麻痹性贝毒毒素含量，整个检测时间从得到贝类到最后结果不会超过2个小时，所以可以利用本发明对麻痹性贝毒毒素进行现场快速检测。权利要求1、一种早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，其特征在于，将现场贝类样品制作成检测液，然后用检测液腹腔注射小鼠，检测小鼠脑中乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力的变化，由乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力水平得到麻痹性贝毒含量，从而早期检测麻痹性贝毒毒性。2、根据权利要求1所述的早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，其特征是，包括以下步骤(1)制备样品检测液贝类样品采集处理后，溶于HC1中得样品原液，原液用生理盐水稀释得到样品检测液；(2)小鼠暴露选择健康的美国癌症研究所品系成年小鼠，用检测液对小鼠进行腹腔注射，取材；(3)脑匀浆制备取注射后小鼠的脑组织碎块放入匀浆介质中进行匀浆；(4)测定乙酰胆碱含量乙酰胆碱和碱性盐酸羟胺反应生成乙酰羟胺酸，产物在酸性条件下与三氯化铁形成棕黄色化合物，于波长540nm处测其吸光度；(5)测定一氧化氮合酶活力一氧化氮合酶催化左旋精氨酸和分子氧反应生成一氧化氮，一氧化氮与亲核性物质生成有色化合物，在波长530nm处测定其吸光度，根据吸光度计算出一氧化氮合酶活力；(6)结果判断依据乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力水平，得到麻痹性贝毒含量，从而早期检测其毒性。3、根据权利要求2所述的早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，其特征是，步骤(1)中，所述的HC1，其浓度为0.lmol/L。4、根据权利要求2所述的早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，其特征是，步骤(2)中，所述小鼠暴露，其时间为15min。5、根据权利要求2所述的早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，其特征是，步骤(3)中，所述的匀浆介质是由三羟甲基胺基甲垸、乙二胺四乙酸二钠、蔗糖配置而成，三羟甲基胺基甲垸、乙二胺四乙酸二钠、蔗糖摩尔比为100:1:100。6、根据权利要求2所述的早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，其特征是，所述的匀浆介质，其配置方法为将三羟甲基胺基甲烷、乙二胺四乙酸二钠用水溶解，再用20Ommol/LHC1进行滴定至pH偏弱碱性，然后加蔗糖，以微波进行消毒，冷却后放入冰箱备用。全文摘要本发明公开了一种生物工程
技术领域：
的早期检测麻痹性贝毒毒性的方法，将现场贝类样品制作成检测液，然后用检测液腹腔注射小鼠，检测小鼠脑中乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力的变化，由乙酰胆碱含量和一氧化氮合酶活力水平得到麻痹性贝毒含量，从而早期检测麻痹性贝毒毒性。本发明解决麻痹性贝毒现场、快速、大批量样品的检测分析及毒性早期检测问题，比目前国内常用的小鼠法相比时间提前2-10倍，且个体没有出现任何症状，适于现场快速、大批量样品的检测分析及毒性早期检测。本发明仅需检测普通生化指标的改变，操作简单方便，适合现场和基层检测部门推广使用。文档编号G01N33/50GK101196517SQ20071017215公开日2008年6月11日申请日期2007年12月13日优先权日2007年12月13日发明者仵彦卿,刘元嫄,宋玉玲,张鉴达,王文华,程金平申请人:上海交通大学