专利名称：：检测缺血修饰白蛋白的试剂盒及其制备方法
技术领域：
：-本发明涉及生物试剂。具体涉及一种检测缺血修饰性白蛋白试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：.-缺血修饰白蛋白是当缺血/再灌注发生时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列，而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白则称缺血修饰白蛋白(IMA)。近年来，心肌损伤标志物有了迅速的发展。肌钙蛋白(cTn)、肌红蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)质量的检测已在临床上得到广泛的应用，逐步取代原有的酶活性的检测。但对于急性冠状动脉综合症(AcuteCoronarySyndromes,ACS)的诊断问题尚未得到妥善解决。另外ECG(心电图)、CK(肌酸激酶)、CK-MB(肌酸激酶同工酶)、Myo(肌红蛋白)、cTnT(肌钙蛋白T)、cTnl(肌钙蛋白I)等也是检测指标，但它们有下列不足ECG:灵敏度一般低于50%CK、CK-MB、Myo:特异性差，在骨骼肌中也存在cTnT、cTnl:特异性高，但只有在心肌缺血6-12小时后才能检出，且仅在不可逆的细胞损害及细胞膜的完整性破坏之后才升高，即它是对心肌细胞损伤的特异性高。除上述之外，IMA(缺血修饰白蛋白)是心肌缺血的特异标志物，ACS(急性冠状动脉综合症)疑似患者就诊时单独测定的灵敏度为82%，与ECG和cTn联合测定的灵敏度可以达到95%，说明其具有很高的灵敏度和阴性预测值。缺血修饰白蛋白的测定对临床医师而言一个低危险度的患者，如果IMA结果正常(低于判断值)并伴ECG无明显异常和cTn正常，可以排除急性冠状动脉综合症？。这是一个非常好的让急诊患者早期出院的指征。但对于一个高危险度的患者，不能就此简单的将正常的IMA看成是早期可以出院的指征。因而，目前还不宜将IMA正常患者，都作为可以早期出院的指征。1999年Bar—or等"发现心肌缺血发作时，人血清白蛋白(Humanserurrlalbumin，(HSA)N—末端将发生改变。当其N—末端受损或铜占据的HAS称为缺血修饰白蛋白(ischemiamodifiedalbumin,IMA)。近年来众多研究显示IMA是急性心肌缺血的一种理想的生化标志物。ACB试验(钴结合实验)利用IMA结合过渡金属能力减弱的性质进行定量测定。正常对照的血清标本中白蛋白以活性形式存在，加入氯化钴溶液后，C即可与白蛋白N末端结合，溶液中存在的游离Co2浓度较低；而缺血个体的血清标本中含有较多IMA，加入同样浓度的氯化钴溶液，由于IMA与C结合的能力弱，溶液中存在较高浓度的游离。利用二硫苏糖醇(DTT)可以与游离C产生红色反应，IMA含量与颜色程度呈正比，在505rma处检测吸光度，可间接对IMA进行定量测定。但是以往的钴结合实验特异性不强，从而造成很多假阳性结果。DTT跟蛋白形成的化合物颜色稳定时间短。反应的时间也比较慢，在自动生化仪上有时候反应难以进行。试剂的稳定性也不强。DTT很容易被氧化从而容易分解
发明内容-本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种提高试剂稳定性和灵敏度的检测缺血修饰性白蛋白的试剂。本发明基于下列原理(1)选用有效的表面活性剂加速反应TricmX-lOO、(2)为了保证试剂的稳定性，添加了特殊的保护剂，TrionX—405;如谷胱甘肽、氯化钾等<本发明提供了一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，该试剂盒由下列试剂l和试剂2组成的试剂l:缓冲液C0C12Tritonx-100NaClMnCl2去离子水试剂2:Na2HP04NaH2P04KC1DTT谷胱甘肽去离子水proclin300(防腐剂)10—200腿ol/L10-100mmol/L0.01-20ml/L20國画麵ol/L20-100mmo!/L比10-200mmol/L10-200mmol/L10-500mmol/Ll-20g/L5-20g/L1L0.01-0.5ml/L所述试剂l中的缓冲液为柠檬酸钠一乳酸缓冲液、甘氨酸一盐酸缓冲液、乙酸一乙酸钠缓冲液或邻苯二甲酸一盐酸；试剂l和试剂2的混合比例为3-9:1;试齐IJ2中的谷胱甘肽的浓度为1-10g/L;试齐ij2中的KCl的浓度为20-200mmol/L。本发明的另一目的是提供了上述一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒制备方法该方法包括下列步骤一、配方试剂l:缓冲液10—200mmol/LC0C1210-100mmol/LTritonx-歸0.01-20ml/LNaCl20-100mmol/LMnCI220-100mmol/L去离子水1L试剂2:Na2HP0410-200mmol/LNaH2P0410-200讓ol/LKC110-500mmol/LDTT1-20g/L谷胱甘肽5-20g/Lproclin300(防腐剂)0.01-0.5ml/L去离子水1L;二、方法(1)在容器一中加入试剂1配方总量80%的去离子水；(2)向已加了去离子水的容器一中依次加入的缓冲液、C0C12、Tritonx-100、NaCl和MnCl2;(3)在容器二中加入试剂2配方总量80%的去离子水；(4)向已加了去离子水的容器二中依次加入Na2HP04、NaH2P04、KC1、DTT、谷胱甘肽和proclin300;(5)调节容器二中混合液的pH值至7.4;(6)分别向容器一和容器二中加入试剂1和试剂2配方总量剩余20%的去离子水即制得试剂1和试剂2;(7)将容器一和容器二中的溶液搅拌至完全溶解，制得试剂1和试剂2;(8)将容器密封后保存。表面活性剂(激活剂)对反应的影响浓度未加激活剂达到反应终点所需时间加复合激活剂达到反应终点所需要时间20g/L5min1.8min40g/L13min2.1min60g/L24min3.2min80g/L30min3.9min(2)不同保护剂对缺血修饰性白蛋白检测试剂的影响加入10g/L的谷胱甘肽氯化钾对DTT的保护作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>上述检测结果表明本发明的试剂盒对试剂有很强的保护作用，随着时间的推移，对酶的保护作用会更明显，12个月后加保护剂的试剂跟没加保护剂的试剂相比，DTT升高57。/0。本发明通过加入表面活性剂，加速了缺血修饰性白蛋白的反应，提高了灵敏度；选用保护剂，确保了试剂的稳定性，本发明的试剂盒有较好的临床应用前景。具体实施例方式实例1配方试剂l柠檬酸钠300mmol/L乳酸50mmol/LC。C1240mmol/LTritonx-1005ml/LNaCI40mmol/LMnCl230mmol/L去离子水1L试剂2Na2HP0450mmol/LNaH2P0420mmol/LKC180mmol/LDTT6g/L谷胱甘肽8g/Lproclin3000.5ml/L去离子水1L方法(1)在容器一中加入0.8L的去离子水；(2)向已加了去离子水的容器一中依次加入300mmol柠檬酸钠、50mmol的乳酸、10mmolCoCl2、10ml的Tritonx-100、20mmolNaCl和20mmolMnCl2;(3)在容器二中加入0.8L的去离子水；(4)向已加了去离子水的容器二中依次加入10mmolNa2HP04、lOmmolNaH2P04、20mmolKCl、15gDTT、10g谷胱甘肽禾口0.3mlprodin300;(5)调节容器二中混合液的pH值至7.4;(6)分别向容器一和容器二中加入0.2L的去离子水即制得试剂1和试剂2;(7)将容器一和容器二中的溶液搅拌至完全溶解，即制得试剂1和试剂2;(8)将容器密封杜绝外界的氧气与试剂接触，保存。实例2试剂l甘氨酸盐酸HgC12C0C12Tritonx-100NaClMnCl2去离子水试剂2Na2HP04NaH2P04KC1DTT谷胱甘肽proclin300100mmol/L50mmol/L50mmol/L50mmol/L2ml/L40mmol/L30mmol/L50mmol/L50mmol/L80mmol/L10g/L8g/L0.5ml/L去离子水1L。制备方法同实例l。实例3试剂l邻苯二甲酸10Ommol/L盐酸50mmol/LC0C1250醒ol/LTritonx-10010ml/LNaCl30mmol/LMnCl250mmol/L去离子水1L试剂2Na2HP0460腿ol/LNaH2P0440讓ol/LKC140mmol/LDTT10g/L谷胱甘肽10g/Lproclin3000.5ml/L去离子水1L制备方法同实例l。实例4试剂l乙酸10Ommol/L乙酸钠C。C12Tritonx-100NaClMnCl2去离子水试剂2Na2HP04NaH2P04KC1DTT谷胱甘肽proclin300去离子水制备方法同实例l实例5试剂l乙酸乙酸钠C0C12Tritonx掘NaClMnCl2去离子水0Ommol/L5Ommol/L10ml/L50mmol/L80mmol/L化60mmol/L70mmol/L80mmol/L10g/L5g/L0.5ml/L20O腿ol/L150mmol/L3Ommol/L20ml/L5Ommol/L20mmol/L试剂2:Na2HP04NaH2P04KC1DTT谷胱甘肽proclin300去离子水制备方法同实例l20mmol/L30mmol/L80mmol/L10g/L5g/L0.5ml/L1L权利要求1、一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，其特征在于该试剂盒由下列试剂1和试剂2组成试剂1缓冲液10—200mmol/LCoCl210-100mmol/LTritonx-1000.01-20ml/LNaCl20-100mmol/LMnCl220-100mmol/L去离子水1L试剂2Na2HP0410-200mmol/LNaH2PO410-200mmol/LKCl10-500mmol/LDTT1-20g/L谷胱甘肽5-20g/Lproclin3000.01-0.5ml/L去离子水1L。2、根据权利要求l所述的一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，其特征在于所述试剂l中的缓冲液为柠檬酸钠一乳酸缓冲液、甘氨酸一盐酸缓冲液、乙酸一乙酸钠缓冲液或邻苯二甲酸一盐酸。3、根据权利要求l所述的一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，其特征在于所述的试剂l和试剂2的混合比例为3-9:1。4、根据权利要求l所述的一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，其特征在于所述试齐U2中的谷胱甘肽的浓度为l-10g/L。5、根据权利要求l所述的一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，其特征在于所述试齐U2中的KC1的浓度为20-200mmol/L。6、根据权利要求l所述的一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒，其特征在于试剂2的pH值为7.4。7、一种权利要求l所述一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤一、配方试剂l:缓冲液C0C12Tritonx陽訓NaClMnCl2去离子水试剂2:Na2HP04NaH2P04KC110—200mmol/L10-100mmol/L0.01-20ml/L20-100mmol/L20-100mmol/L1L10-200mmol/L10-200mmol/L10-500mmol/LDTT1-20g/L谷胱甘肽5-20g/L去离子水1Lproclin3000.01-0.5ml/L二、方法(1)在容器一中加入试剂1配方总量80%的去离子水;(2)向已加了去离子水的容器一中依次加入的缓冲液、C0C12、Tritonx-lOO、NaCl和MnCl2;(3)在容器二中加入试剂2配方总量80%的去离子水；(4)向已加了去离子水的容器二中依次加入Na2HP04、NaH2P04、KC1、DTT、谷胱甘肽和proclin300;(5)调节容器二中混合液的pH值至7.4;(6)分别向容器一和容器二中加入试剂1和试剂2配方总量剩余20%的去离子水即制得试剂1和试剂2;(7)将容器一和容器二中2的溶液搅拌至完全溶解，制得试剂1和试剂2;(8)将容器密封后保存。全文摘要本发明公开了一种检测缺血修饰性白蛋白的试剂盒。本发明的试剂盒由试剂1和试剂2组成。通过加入表面活性剂，加速了缺血修饰性白蛋白的反应；选用保护剂，确保了试剂的稳定性，本发明的试剂盒有较好的临床应用前景。本发明提供了制备方法。文档编号G01N33/68GK101458257SQ20071017209公开日2009年6月17日申请日期2007年12月12日优先权日2007年12月12日发明者晟景申请人:上海复星医药(集团)股份有限公司;上海复星长征医学科学有限公司