专利名称：毛细管电泳电化学酶联免疫分析法检测遗忘性贝类毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及毛细管电泳电化学酶联免疫分析技术，具体地说是毛细管电泳电化学 酶联免疫分析法检测遗忘性贝类毒素。
背景技术：
不断加剧的环境污染导致海洋中赤潮毒素的种类和数量不断增加，这些赤潮毒素 通过食物链传递，威胁人类健康。世界各国对进口水产品中赤潮毒素的检查也越来越严格， 亟需研究一种快速、灵敏、可靠的方法检测海洋中的赤潮毒素。赤潮毒素又称为“贝类毒素”。根据人体的中毒症状，又分为麻痹性贝毒(PSP)Jl 泻性贝毒(DSP)、遗忘性贝类毒素(ASP)、神经性贝毒(NSP)、西加鱼毒(CFP)等许多种。近 年来，还不断有新的毒素及其成分被发现。贝类毒素是目前已知的最毒有机化合物。遗忘性贝类毒素主要来源于甲藻门和硅藻门，主要是软骨藻酸毒素。软骨藻酸及 其衍生物是一类海藻产生的水溶性毒素，主要是大亚湾拟菱形藻等微藻类生物。大亚湾拟 菱形藻水华会导致贝类等滤食性生物体内软骨藻酸的富集。软骨藻酸对H4细胞具有细胞 毒作用和氧化损害作用，并可能通过氧化损害间接诱导HO-I蛋白表达增多，是引起人类记 忆缺失性中毒的致病因子。摄入污染软骨藻酸毒素的贝类食物会产生ASP，影响中枢神经 系统，严重时会造成人及动物的死亡。软骨藻酸为一种谷氨酸和红藻酸的类似物，为不饱和 烃，极性化合物HLB ^ 17 ；水溶性，易溶于碱性溶液，酸性条件易分解。遗忘性贝类毒素的分析方法主要包括化学分离分析及生物分析两大类。化学分离 分析方法有免疫分析、气相色谱分析、高效液相色谱、色谱质谱联用、毛细管电泳法及胶束 毛细管电动色谱等。免疫分析法包括放射免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)两种， 该法具有选择性强、灵敏度高的特点。近20年来，人们着眼于从化学和药理学角度，对赤潮毒素进行了大量的研究，取 得了很大的进步。由于多数赤潮毒素的主链结构差异不大，而侧链及细微结构却千差万别， 到目前为止仍然没有可供推广的方便的监测分析手段。毛细管电泳由于其分离效率高、分 析速度快、样品用量少等优点，近几年被尝试用于海洋赤潮毒素的分离检测。毛细管电泳紫 外检测灵敏度较低，传统的监测方法一般是对被污染的鱼类、贝类器官进行检测，当发现海 洋生物被污染时，赤潮毒素对渔业及公众安全的损害也已经造成，往往达不到及早预报及 早防治的目的。毛细管电泳免疫分析法将毛细管电泳技术引入免疫分析中来，使其具有以下三个 方面的突出优点实现了极低的检测量的检测；由于扩散路径缩短，使得免疫反应孵化时 间大大减少；酶催化产物的稀释极大减小，可以大大缩短酶催化放大时间。几个方面改进的 综合结果，使得由原来几个小时的测定时间缩短到了十几分钟甚至更短。但目前为止，基于 毛细管电泳电化学酶联免疫分析的检测遗忘性贝类毒素的方法还未见报道。本发明将毛细管电泳电化学方法和酶联免疫分析相结合，以HRP为标记酶，选择 高灵敏度的供氢体为底物，酶催化反应产物经毛细管电泳分离后用微电极进行安培检测，可实现遗忘性贝类毒素的快速在线检测，检测时间由常规免疫分析Id以上缩短至几分钟， 操作简便，试剂消耗量少，可满足现场检测要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测遗忘性贝类毒素的方法，该方法简化了样品处理过 程、操作程序简单、选择性好、灵敏快速，特别适用于贝类样品中遗忘性贝类毒素含量的快 速检测。本方法所用仪器装置为实验采用柱端式安培检测毛细管电泳一电化学检测系 统购自西安瑞迈分析仪器有限公司，包括一台高压电源(MPI-A型)，一台电化学分析仪 (MPI-A型)，三维检测池；三电极系统钼工作电极，Ag-AgCl参比电极，钼对电极；数字式 恒温水浴箱(浙江余姚工业仪表二厂)。聚丙烯酰胺脂内涂层毛细管(50ymID，375ym 0D) 购自美国赛分科技有限公司有限公司。分离管长度为30cm，反应管长度为6cm。所用试剂为邻氨基酚、磷酸、硼酸、醋酸、氢氧化钠、辣根过氧化物酶(上海雪满 生物科技有限公司)，遗忘性贝类毒素诊断试剂盒(美国，Abraxis公司)，其他试剂为分析 纯，所有溶液均用二次蒸馏水配制，所有缓冲液及样品溶液在使用前均需用0. 22 μ m微孔 滤膜滤过，且在临用前进行超声脱气处理。本发明所述的溶液配制方法具体陈述如下=H2O2溶液取市售30%的11. 3 μ L，用 二次水稀释到lOOmL，浓度为1.0X10_3mol/L，用时现配；OAP溶液准确称取邻氨基酚(分 析纯)0. 109g，用IOmL乙醇溶解并用水定容至IOOmL,浓度为1. 0 X 10_2mol/L，使用时可用 二次蒸馏水再稀释；1. OX 10_2mol/LBR缓冲溶液。本发明采用的技术方案为1)、遗忘性贝类毒素标准品的检测采用非竞争模式，将一系列不同浓度的遗忘性贝类毒素标准品和HRP标记的遗 忘性贝类毒素抗体加入微富集管，于37°C水浴中孵育30min，取出后用缓冲溶液稀释到 200 μ L，压力进样，运行电泳并记录。2)、贝类样品处理将贝类去除贝壳，贝肉浸洗、勻浆后，用盐酸调ρΗ，离心，倾去 上清液，加入甲醇萃取，收集上层萃取液，减压蒸发萃取液至甲醇挥发完毕，用十二烷基 硫酸钠胶束溶液溶解析出物；在上述处理的贝类样品溶液中加入一定量的酶标抗体孵育 30min ；取出后用缓冲溶液稀释到200μ L，在最佳检测条件下运行电泳并记录。所述缓冲液为BR缓冲液，由磷酸、醋酸、硼酸加过氧化氢溶液配制而成。所述底物为邻氨基酚；所述酶为辣根过氧化物酶。本发明的优点1、本发明将毛细管电泳、电化学检测和免疫分析结合起来，既具有毛细管电泳的 高分离效率、电化学分析的高灵敏度，又具有免疫分析的高选择性和专一性，用于贝类样品 中遗忘性贝类毒素的检测，避免了贝类样品前处理中需要过离子交换柱的烦琐程序，简化 了操作步骤。2、将毛细管电泳电化学酶联免疫分析法应用于遗忘性贝类毒素的检测，检测时间 由常规免疫分析1天以上缩短至几分钟，操作简便快速，试剂消耗量少。3、遗忘性贝类毒素免疫混合物在分离过程中使用缓冲液压池和底物液压池确保分离毛细管两端压力平衡，整个分离过程只有电场驱动力，分离效率高，同时由于压力的作 用也确保底物进入反应毛细管。4、利用免疫反应的专一性，将遗忘性贝类毒素免疫复合物及游离的酶标物经毛细 管电泳分离后，可实现毛细管电泳电化学酶联免疫分析法测定遗忘性贝类毒素化合物。
图1为遗忘性贝类毒素的化学结构；图2为本发明检测遗忘性贝类毒素的毛细管电泳电化学免疫分析装置示意图；图3为本发明毛细管电泳电化学免疫分析酶催化体系的反应方程式及酶催化产 物在电极上发生反应的方程式；图4为本发明一个实施例中酶标遗忘性贝类毒素抗体的毛细管电泳谱图；图5为本发明一个实施例中标准样品中遗忘性贝类毒素-酶标抗体复合物及过量 酶标遗忘性贝类毒素抗体的毛细管电泳谱图，峰1为过量酶标遗忘性贝类毒素抗体催化底 物形成的电泳峰，峰2为遗忘性贝类毒素_酶标抗体复合物催化底物形成的电泳峰；图6为本发明一个实施例中贝类样品中的遗忘性贝类毒素与酶标抗体反应后的 毛细管电泳谱图，峰1为过量酶标遗忘性贝类毒素抗体催化底物形成的电泳峰，峰2为遗忘 性贝类毒素_酶标抗体复合物催化底物形成的电泳峰。
具体实施例方式以下为实施本发明的具体示例，其作用在于进一步阐明本发明的内容，使阅读者 更容易理解，但不构成对本发明要求的保护范围的限定或限制。实施例一毛细管电泳电化学酶联免疫分析法检测标准样品中的遗忘性贝类毒素所用仪器及试剂如前所述。采用非竞争模式，将一系列不同浓度的遗忘性贝类毒素标准品和HRP标记的遗 忘性贝类毒素抗体加入微富集管，于37°C水浴中孵育30min，取出后用缓冲溶液稀释到 200yL，压力进样(9cm，20s)，运行电泳并记录。采用非竞争模式，HRP标记的遗忘性贝类毒 素抗体(Ab*)过量，样品溶液在孵育后既含有HRP标记的遗忘性贝类毒素抗体-抗原结合 物(Ag-Ab*)，又含有未反应的遗忘性贝类毒素抗体(Ab*)，混合液中的遗忘性贝类毒素-酶 标抗体复合物和剩余酶标遗忘性贝类毒素抗体根据迁移速率不同在分离毛细管中分成不 同的区带并顺次进入反应毛细管中，经毛细管电泳分离后，分别在反应毛细管中催化缓冲 液中的过氧化氢氧化底物邻氨基酚，生成具有电化学活性的物质3-氨基吩噁嗪，进入电化 学检测池进行检测，可检测到两个电泳峰。遗忘性贝类毒素的浓度不同，形成的遗忘性贝类 毒素抗原抗体结合物的量不同，催化过氧化氢氧化邻氨基酚生成氧化产物3-氨基吩噁嗪 的浓度就不同，产生不同的电化学信号，由此可对酶标遗忘性贝类毒素-抗体复合物以及 贝类样品中的遗忘性贝类毒素进行定量分析。考察了运行缓冲溶液浓度和pH值、分离电压、检测电势、进样时间和电压对遗忘 性贝类毒素检测的影响，确定最佳检测条件是1.0X10_2mOl/L BR缓冲溶液(pH 5.0)；分 离电压15kV ；检测电势-350mV ；压力进样(9cm, 20s)。在最佳检测条件下，遗忘性贝类毒素标准品溶液检测的线性范围为0. 5-50ng/mL,检测限为0. 2ng/mL。工作曲线的线性回归方程为y = 0. 02279x+0. 52558 (其中χ为遗忘性 贝类毒素浓度，ng/mL, y为峰面积，μ C，η = 5)，其相关系数γ= 0. 9962。实施例二使用毛细管电泳电化学酶联免疫分析方法检测贝类样品中的遗忘性贝
类毒素将贝类(扇贝或牡蛎)去除贝壳，贝肉用蒸馏水浸洗3次，勻浆lOmin，冰水浴超声 IOmin,用6mol/L盐酸调至pH 3. 4 4. 0，离心5min，倾去上层清液，加入甲醇搅勻，超声萃 取5min，离心5min，收集上层萃取液，在35 50°C水浴下减压蒸发萃取液至甲醇挥发完毕， 用十二烷基硫酸钠胶束溶液溶解析出物；在上述处理的贝类样品溶液中加入过量酶标遗忘性贝类毒素抗体，在37°C孵化反 应30min，贝类样品中的遗忘性贝类毒素和酶标抗体反应，进行电泳分离检测。实验采用非竞争模式，HRP标记的遗忘性贝类毒素抗体(Ab*)过量，样品溶液在孵 育后既含有HRP标记的遗忘性贝类毒素抗原抗体结合物(Ag-Ab*)，又含有未反应的遗忘性 贝类毒素抗体(Ab*)，经毛细管电泳分离后，分别在反应毛细管中催化底物溶液反应，可检 测到两个电泳峰。遗忘性贝类毒素的浓度不同，形成的遗忘性贝类毒素抗原抗体结合物的 量不同，催化过氧化氢氧化邻氨基酚生成氧化产物3-氨基吩噁嗪的浓度就不同，产生不同 的电化学信号，由此可对酶标遗忘性贝类毒素-抗体复合物以及贝类样品中的遗忘性贝类 毒素进行定量分析。其实验结果如图4所示，HRP标记的遗忘性贝类毒素抗体从毛细管入口端进样，在14kV高压 电场下向阴极迁移，进入电化学检测池进行检测，电泳峰出现在IOOs附近。如图5所示，遗忘性贝类毒素与过量的酶标抗体溶液在37°C孵化反应30min，形成 遗忘性贝类毒素抗原抗体结合物，将混合溶液14kV电动进样5s后进行电泳分离检测，峰1 为过量酶标遗忘性贝类毒素抗体催化底物形成的电泳峰，峰2 (出峰时间约200s)为遗忘性 贝类毒素抗原抗体结合物催化底物形成的电泳峰，两个电泳峰峰形较好，可以达到基线分 离。随着遗忘性贝类毒素抗原浓度的增大，峰1逐渐变小，峰2逐渐变大，根据非竞争免疫 分析的原理，峰1和峰2分别代表酶标遗忘性贝类毒素抗体和遗忘性贝类毒素抗原抗体结 合物。如图6所示，在酶标遗忘性贝类毒素抗体溶液中加入扇贝样品，扇贝样品中的遗 忘性贝类毒素同酶标抗体反应，生成遗忘性贝类毒素抗原抗体(峰2)，说明扇贝样品中含 有遗忘性贝类毒素。
权利要求
毛细管电泳电化学酶联免疫分析法检测遗忘性贝类毒素，其特征在于将毛细管电泳 电化学检测技术引入免疫分析中，利用酶标遗忘性贝类毒素抗体，将酶催化过氧化氢(H202)氧化底物的酶促反应与其氧化产物的电极还原相偶合，利用毛细管电泳电化学技术检测所生成的氧化产物，用此方法间接检测标准样品及贝类样品中的遗忘性贝类毒素。
2.按照权利要求1所述检测遗忘性贝类毒素的方法，其特征在于贝类样品处理将贝 类样品去除贝壳，贝肉用蒸馏水浸洗，勻浆，用盐酸调至PH 3. 4 4. 0，离心，倾去上层清 液，加入甲醇萃取，收集上层萃取液，在热水浴下减压蒸发萃取液至甲醇挥发完毕，用十二 烷基硫酸钠胶束溶液溶解析出物。
3.按照权利要求1所述检测遗忘性贝类毒素的方法，其特征在于采用非竞争免疫分析 法遗忘性贝类毒素标准品或权利要求2中所述处理的贝类样品与过量的酶标遗忘性贝类 毒素抗体进行孵化反应，酶标遗忘性贝类毒素抗体过量，样品溶液在孵育后既含有酶标遗 忘性贝类毒素抗体_抗原结合物，又含有未反应的酶标遗忘性贝类毒素抗体。
4.按照权利要求1所述检测遗忘性贝类毒素的方法，其特征在于采用毛细管电泳_电 化学酶联免疫分析法检测将权利要求3中的混合液进样，酶标遗忘性贝类毒素抗体-抗原 结合物和剩余酶标遗忘性贝类毒素抗体根据迁移速率不同在分离毛细管中分成不同的区 带并顺次进入反应毛细管中，催化缓冲液中的过氧化氢氧化底物，生成具有电化学活性的 物质，进入电化学检测池进行检测。
5.按照权利要求1所述检测遗忘性贝类毒素的方法，其特征在于所述缓冲液为BR缓 冲液，其配制方法为取磷酸、醋酸、硼酸溶解稀释，用氢氧化钠调PH后加入过氧化氢溶液 定容。
6.按照权利要求1或4所述检测遗忘性贝类毒素的方法，其特征在于所述底物为邻氨基酚。
7.按照权利要求1或4所述检测遗忘性贝类毒素的方法，其特征在于所述酶为辣根 过氧化物酶(HRP)。
全文摘要
本发明描述了一种测定遗忘性贝类毒素的新型毛细管电泳电化学酶联免疫方法，属于分析检测技术领域。将毛细管电泳和电化学酶联免疫分析技术相结合，对遗忘性贝类毒素的标准品溶液及贝类样品进行了分析。采用非竞争模式，样品溶液与HRP标记的遗忘性贝类毒素抗体反应，混合液中的遗忘性贝类毒素-酶标抗体复合物和剩余HRP标记的遗忘性贝类毒素抗体经毛细管电泳分离后，催化过氧化氢氧化底物邻氨基酚，生成具有电化学活性的物质3-氨基吩嗪，电化学进行检测。该方法简化了样品处理过程，选择性好，准确度高。对遗忘性贝类毒素标准品溶液检测的线性范围为0.5-50ng/mL，检测限为0.2ng/mL。是检测贝类样品中遗忘性贝类毒素的理想方法。
文档编号G01N27/447GK101949931SQ20101028046
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月3日 优先权日2010年9月3日
发明者张书圣, 张召香, 李晓琳, 李雪梅, 梅振华, 葛安青 申请人:青岛科技大学