专利名称：用于生物芯片修饰蛋白的修饰剂与其组合物、及其修饰蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片表面的化学修饰蛋白领域。具体地说，本发 明涉及一种用于经氨基改性的生物芯片表面修饰蛋白的修饰剂、与包 含该修饰剂的组合物、以及利用该组合物对生物芯片表面进行修饰蛋 白的方法。
背景技术：
生物芯片是近10年在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新 技术。是通过微加工和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学 分析系统，以实现对生命机体的组织、细胞、蛋白质、核酸、糖类以 及其他生物组分进行准确、快速、大信息量的检测。
目前制备芯片主要采用表面化学的方法或组合化学的方法来处 理固相基质如玻璃片或硅片，然后使DNA片段或蛋白质分子按特定 顺序排列在片基上。生物样品往往是非常复杂的生物分子混合体，除 少数特殊样品外， 一般不能直接与芯片进行反应。要将样品进行特定 的生物处理，获取其中的蛋白质或DNA、 RNA等信息分子并加以标 记，以提高检测的灵敏度。芯片上的生物分子之间的反应是芯片检测 的关键一步。通过选择合适的反应条件使生物分子间反应处于最佳状 况中，减少生物分子之间的错配比率，从而获取最能反映生物本质的 信号。蛋白芯片是芯片上固定的分子是蛋白质如抗原或抗体等。其二， 检测的原理是依据蛋白分子、蛋白与核酸、蛋白与其它分子的相互作 用。蛋白芯片技术出现得较晚，尚处于发展时期，最近也取得了重大 进展。蛋白质芯片还面临着诸多挑战，其中之一是改进基质材料的表 面处理技术以提高蛋白质在表面固定的质量以及减少蛋白质的非特 异性结合。
蛋白质主要通过两种方式被固定在基片上[Wilson D S ， Nock S. Functional protein microarrays[J ] . Curr Opin Chem Biol, 2002 , 6(1): 81 - 85] : (1)物理吸附作用，即通过范德华力、疏水作用、氢键等 吸附在玻片上，这种固定方式容易影响蛋白质的结构和活性，而且蛋 白质固定的不牢固；(2)化学键合作用，通过各种化学方法处理玻 片，从而在基片表面形成不同的活性基团，再与蛋白质上的相应基团 结合，这种方式固定蛋白质的量较大且较牢固。主要的化学修饰方法 有聚赖氨酸、氨基、醛基、环氧基、链霉亲和素修饰等，目前的研 究中，对几种方法进行对比[l、侯伟健等构建玻片蛋白质芯片的实验 研究《中国医科大学学报》2003年02期11-12; 2、张春秀、梅茵、 顾莹制备蛋白质芯片的玻璃表面修饰方法比较[J]，中华检验医学杂志， 2003， 26 (4)]，氨基玻片和环氧基玻片非特异性吸附较严重，较适合 DNA连接，巯基表面特异性好但适用于含双巯基的蛋白质(范围太 窄)，聚赖氨酸主要是静电吸附非共价结合，醛基特异性和与蛋白结 合能力与其它相比较佳[刑婉丽、程京著《生物芯片技术》清华大学 出版社]。文献中报道醛基与蛋白结合比较好，因此在玻璃片或硅片 表面通常首先将这些基片氨基化，然后加入戊二醛活化基片，再与蛋 白以席夫碱方式结合固定蛋白。由于戊二醛性质不稳定，容易聚合， 而且与蛋白结合的结构复杂，质量控制难度大，因此在实际大规模生产中很少使用该种方法固定蛋白。
发明内容
为了解决上述所述戊二醛不稳定、易聚合的缺点，我们开发了 一种用于经氨基改性的生物芯片表面修饰蛋白的修饰剂、与包含该修 饰剂的组合物、以及利用该组合物对生物芯片表面进行修饰蛋白的方 法。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的
根据本发明的一方面，本发明提供了一种用于经氨基改性的生物 芯片表面修饰蛋白的修饰剂，所述修饰剂是含有双活性官能团羧基和 醛基的小分子。
其中，所述醛基为芳香醛基或脂肪醛基；所述羧基为直链脂肪酸 基、或支链脂肪酸基、或芳香酸基。
最好，含羧基的主链长为『1 12，支链长1 =0 2。 最好，所述醛基与含羧基的主链为对位。
优选地，含有醛基和羧基的双功能团小分子包括对醛基苯脂肪酸 和脂肪醛酸。所述对醛基苯脂肪酸包括对醛基苯甲酸、对醛基苯乙酸、 对醛基苯丙酸、对醛基苯丁酸，对醛基苯戊酸、对醛基苯已酸、对醛 基苯庚酸、对醛基苯辛酸、对醛基异苯壬酸、对醛基苯癸酸、对醛基 苯十一酸、对醛基苯十二酸、或者对醛基异苯丙酸；所述脂肪醛酸为 乙醛酸。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种包含所述修饰剂的组 合物，所述组合物包括修饰剂和选自DMF、乙醇、水中的一种，其 中乙醇最好使用无水乙醇。
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种利用所述的含有修饰剂的组合物对生物芯片表面进行修饰蛋白的方法，所述方法包括
(1) 在经氨基改性的芯片表面，先与含有修饰剂的组合物进行 羧基化反应以形成羧基功能团的芯片；
(2) 将上述芯片在含有EDC和NHS的磷酸缓冲溶液中进行活 化羧基以得到活化羧基的芯片；
(3) 将待测蛋白分子滴加到上述活化羧基的芯片上，以使蛋白 固定在芯片上。
其中，在4 60'C下，经氨基改性的芯片表面与含有修饰剂的组 合物进行羧基化反应。
其中，所述组合物包括所述修饰剂和选自DMF、乙醇中的一种。 其中乙醇最好使用无水乙醇。
最好，所述修饰剂包括对醛基苯脂肪酸。其中，所述对醛基苯脂 肪酸包括对醛基苯甲酸、对醛基苯乙酸、对醛基苯丙酸、对醛基苯丁 酸，对醛基苯戊酸、对醛基苯已酸、对醛基苯庚酸、对醛基苯辛酸、 对醛基异苯壬酸、对醛基苯癸酸、对醛基苯十一酸、对醛基苯十二酸、 或者对醛基异苯丙酸。
此外，所述组合物包括作为修饰剂的乙醛酸和水。
此外，本发明的所述芯片的基片材料为硅片、玻璃、金属、或塑料。
其中，所述硅片选自单晶硅、多晶硅、碳化硅、钛化硅、氮化硅、 或锗化硅。
最好，在所述基片材料的表面覆盖一层膜。所述膜包括二氧化硅 膜、碳化硅膜、钛化硅膜、氮化硅膜、锗化硅膜、金刚石膜、或类金 刚石膜。
在本发明如上所述的方法中，通常用常规方法在蛋白芯片表面先固定一层含有活性官能团氨基的小分子，再在氨基表面固定一层含有 活性官能团羧基的小分子，再用常规方法固定蛋白质分子。
所述的含有活性官能团羧基的小分子是双官能团分子， 一端含有 醛基， 一端含有羧基。醛基最好是芳香醛，因为芳香醛比脂肪醛与氨 基反应形成的席夫碱性质更稳定。羧基可以是脂肪酸包括直链和支
链，也可以是芳香酸。含羧基的主链长为n=l~12，支链长!11=0 2。 醛基与含羧基的主链最好是处于对位。上述分子如4-羧基苯甲醛(又 名对醛基苯甲酸或对羧基苯甲醛)，对醛基苯乙酸，对醛基苯丙酸， 对醛基苯丁酸，对醛基苯戊酸，对醛基苯已酸，对醛基苯庚酸，对醛 基苯辛酸，对醛基异苯壬酸，对醛基苯癸酸，对醛基苯十一酸，对醛 基苯十二酸，对醛基异苯丙酸等。
本发明提供的修饰蛋白芯片表面的方法，可以改善蛋白质芯片表 面的特性，其优点在于相对于常规使用的戊二醛而言，本发明建议
使用的芳香醛性质稳定，试剂本身易于保存，质量可靠，适合于批量
生产使用；而戊二醛是脂肪醛，性质不稳定，容易被氧化，试剂不易 长期保存，每次购买的试剂需要鉴定试剂的有效性才能使用，而且是 二醛试剂，自身容易聚合，难以保证表面修饰的质量，不适合大批量 生产使用。
此外，芳香醛与脂肪氨基结合形成的席夫碱性质也比脂肪醛与脂 肪氨形成的席夫碱性质稳定，不易分解，使芯片在经过芳香醛处理后 保存方便，能够简化加工和保存工艺。
再者，本发明揭示的双官能团小分子， 一端是醛基， 一端是羧基， 两个官能团反应活性有明显差异，因此，能够选择性地与芯片表面氨 基反应，而不会发生聚合。同时当羧基与蛋白结合时，能够形成稳定 的共价键，因此表面结合的蛋白量不会因为缓冲液或其他溶液冲洗而减少，经过该方法修饰的表面可以应用于点阵芯片，也能应用于微流 体芯片。
该方法是在修饰了氨基的基片上而固定蛋白的。该方法使用的修 饰剂为固体且稳定，与氨基结合更稳定，而且修饰剂本身不发生聚合， 与蛋白结合过程中也不发生聚合，表面修饰质量稳定、易于控制、成 本低，适合于大批量生产使用。而戊二醛是液体，且性质不稳定，容 易聚合，不适于工业化生产。
具体实施例方式
通过以下实施例来对本发明作进一步具体说明，但并不仅限于以 下实施例和实施例中的工艺参数范围。
实施例l
将表面生长有氮化硅的硅片表面经过乙醇、去离子水清洗后，在
氧等离子体仪器内处理硅片表面2分钟，将该硅片放置在5Q^硅烷偶 联剂Y-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)的乙醇溶液中，在25匸下反应1 小时，取出使用无水乙醇清洗，用氮气流吹干备用，芯片表面修饰上 伯氨基。
实施例2
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在浓度为20mg/ml的对醛基苯 甲酸的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在4t:条件下反应120mins。 使用DMF清洗芯片，再用磷酸缓冲液(PBS,pH 6.5-7.4)冲洗芯片， 然后将该芯片放置在含有0.4M EDC和0.1M的NHS的磷酸缓冲溶液 (pH=7.4)中反应30分钟活化羧基。反应后的硅片使用PBS冲洗，然后向硅片上滴加抗体anti-IgG反应30分钟，用含有1%吐温20的 PBS缓冲溶液冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质芯片表面。
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在对醛基苯甲酸的N,N-二甲基 甲酰胺(DMF)溶液中，在6(TC条件下反应5分钟。使用磷酸缓冲 液冲洗芯片，然后将该芯片放置在含有EDC: NHS=3: 1 (摩尔比) 的磷酸缓冲溶液(PH=7.4)中反应5小时活化羧基。反应后的硅片使 用PBS冲洗，然后向硅片上滴加蛋白G反应60分钟，用含有0.5% 吐温20的PBS缓冲溶液冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质 芯片表面。
实施例4
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在对醛基异苯丙酸的乙醇溶液 中，在4"C条件下反应24小时。使用磷酸缓冲液冲洗芯片，然后将 该芯片放置在含有EDC: NHS=3: 1 (摩尔比)的磷酸缓冲溶液
(pH=7.4)中反应5小时活化羧基。反应后的硅片使用PBS冲洗， 然后向硅片上滴加牛血清蛋白反应60分钟，用含有0.5%吐温20的 PBS缓冲溶液冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质芯片表面。
实施例5
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在浓度为20mg/ml的对醛基异 苯丙酸的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，在25"C条件下反应 30mins。使用DMF清洗芯片，再用磷酸缓冲液(PBS， pH 6.5-7.4) 冲洗芯片，然后将该芯片放置在含有0.4MEDC和0.1M的NHS的磷酸缓冲溶液(PH=7.4)中反应30分钟活化羧基。反应后的硅片使用 PBS冲洗，然后向链片土滴加蛋白—A反应JO分钟，用含有1°/。—吐温 20的PBS缓冲溶液冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白A固定在蛋白质芯 片表面。
实施例6
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在对醛基苯十二酸的无水乙醇 溶液中，在6(TC条件下反应2小时。使用无水乙醇清洗芯片，再用 磷酸缓冲液(PBS，pH 6.5-7.4)冲洗芯片，然后将该芯片放置在含有 0.4MEDC和0.1M的NHS的磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中反应120分 钟活化羧基。反应后的硅片使用PBS冲洗，然后向硅片上滴加抗甲 胎蛋白(AFP)的抗体反应30分钟，用含有1%吐温20的PBS缓 冲溶液冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质芯片表面。
实施例7
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在对醛基苯已酸的无水乙醇溶 液中，在3(TC条件下反应24小时。使用无水乙醇清洗芯片，再用磷 酸缓冲液(PBS, pH 6.5-7.4)冲洗芯片，然后将该芯片放置在含有0.4M EDC和0.1M的NHS的磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中反应240分钟活 化羧基。反应后的硅片使用PBS冲洗，然后向硅片上滴加抗癌胚抗 原(CEA)的抗体反应60分钟，用含有0.5%吐温20的PBS缓冲溶液 冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质芯片表面。
实施例8
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在对醛基苯戊酸的无水乙醇溶
ii液中，在3(TC条件下反应24小时。使用无水乙醇清洗芯片，再用磷 酸缓沖液-^H先芯片，然后将该芯片放置在,—有EDC: NHS—=3: 1 (摩 尔比)的磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中反应5小时活化羧基。反应后的 硅片使用PBS冲洗，然后向硅片上滴加转铁蛋白的抗体反应60分钟， 用含有0.5。/o吐温20的PBS缓冲溶液冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白 固定在蛋白质芯片表面。
实施例9
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在对醛基苯辛酸的无水乙醇溶 液中，在40'C条件下反应IO小时。使用无水乙醇清洗芯片，再用磷 酸缓冲液冲洗芯片，然后将该芯片放置在含有EDC: NHS=3: 1 (摩 尔比)的磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中反应5小时活化羧基。反应后的 硅片使用PBS冲洗，然后向硅片上滴加转铁蛋白的抗体反应60分钟， 用含有0.5%吐温20的PBS缓冲溶液冲洗，再用PBS冲洗，使蛋白 固定在蛋白质芯片表面。
实施例10
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在5%乙醛酸的水溶液中，在 1(TC条件下反应6小时。使用磷酸缓冲液冲洗芯片，然后将该芯片放 置在含有EDC: NHS=3: 1 (摩尔比)的磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中 反应5小时活化羧基。反应后的硅片使用PBS冲洗，然后向硅片上 滴加蛋白G反应60分钟，用含有0.5%吐温20的PBS缓冲溶液冲洗， 再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质芯片表面。
实施例11将实施例1中修饰有氨基的芯片放在2%乙醛酸的水溶液中，在
6-『€条件下反应ro分钟。使滑磷酸缓71^f冲洗芯片，然后将该芯片 放置在含有EDC: NHS=3: 1 (摩尔比)的磷酸缓冲溶液(pH=7.4) 中反应5小时活化羧基。反应后的硅片使用PBS冲洗，然后向硅片 上滴加胰岛素反应60分钟，用含有0.5%吐温20的PBS缓冲溶液冲 洗，再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质芯片表面。
实施例12
将实施例1中修饰有氨基的芯片放在5%乙醛酸的水溶液中，在 4"C条件下反应24小时。使用磷酸缓冲液冲洗芯片，然后将该芯片放 置在含有EDC: NHS-3: 1 (摩尔比)的磷酸缓冲溶液(pH=7.4) 中反应5小时活化羧基。反应后的硅片使用PBS冲洗，然后向硅片 上滴加蛋白G反应60分钟，用含有1%吐温20的PBS缓冲溶液冲洗， 再用PBS冲洗，使蛋白固定在蛋白质芯片表面。
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，本发明并不限于 这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施 方案的目的在于帮助本领域中的技术人员时间本发明。任何本领域中 的技术人员很容易在不脱离分发明精神和范围的情况下进行进一步 的改进和完善，因此分发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限 制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范 围内的备选方案和等同方案。
权利要求
1、一种用于经氨基改性的生物芯片表面修饰蛋白的修饰剂，其特征在于，所述修饰剂是含有双活性官能团羧基和醛基的小分子。
2、 如权利要求1所述的修饰剂，其特征在于，所述醛基为芳香醛基或脂肪醛基；所述羧基为直链脂肪酸基、或支链脂肪酸基、或芳 香酸基。
3、 如权利要求1或2所述的修饰剂，其特征在于，含羧基的主 链长为n-l 12，支链长m-0 2。
4、 如权利要求1或2所述的修饰剂，其特征在于，所述醛基与 含羧基的主链为对位。
5、 如权利要求1或2所述的修饰剂，其特征在于，含有醛基和 羧基的双功能团小分子包括对醛基苯脂肪酸和脂肪醛酸。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述对醛基苯脂肪 酸包括对醛基苯甲酸、对醛基苯乙酸、对醛基苯丙酸、对醛基苯丁酸， 对醛基苯戊酸、对醛基苯己酸、对醛基苯庚酸、对醛基苯辛酸、对醛 基异苯壬酸、对醛基苯癸酸、对醛基苯十一酸、对醛基苯十二酸、或 者对醛基异苯丙酸；所述脂肪醛酸为乙醛酸。
7、 一种包含如权利要求1 6所述的修饰剂的组合物，其特征在 于，所述组合物包括修饰剂和选自DMF、乙醇、水中的一种。
8、 一种利用如权利要求7所述的含有修饰剂的组合物对生物芯 片表面进行修饰蛋白的方法，所述方法包括(1) 在经氨基改性的芯片表面，先与含有修饰剂的组合物进行 羧基化反应以形成羧基功能团的芯片；(2) 将上述芯片在含有EDC和NHS的磷酸缓冲溶液中进行活化羧基以得到活化羧基的芯片；(3)将待测蛋白分子滴加到上述活化羧基的芯片上，以使蛋白固 定在芯片上。
9、 如权利要求8所述的方法，其特征在于，在4 6(TC下，经氨 基改性的芯片表面与含有修饰剂的组合物进行羧基化反应。
10、 如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述组合物包 括所述修饰剂和选自DMF、乙醇中的一种。
11、 如权利要求IO所述的方法，其特征在于，所述修饰剂包括 对醛基苯脂肪酸。
12、 如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述对醛基苯脂 肪酸包括对醛基苯甲酸、对醛基苯乙酸、对醛基苯丙酸、对醛基苯丁 酸，对醛基苯戊酸、对醛基苯已酸、对醛基苯庚酸、对醛基苯辛酸、 对醛基异苯壬酸、对醛基苯癸酸、对醛基苯十一酸、对醛基苯十二酸、 或者对醛基异苯丙酸。
13、 如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述组合物包 括作为修饰剂的乙醛酸和水。
14、 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述芯片的基片材 料为硅片、玻璃、金属、或塑料。
15、 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述硅片选自单晶硅、多晶硅、碳化硅、钛化硅、氮化硅、或锗化硅。
16、 如权利要求14所述的方法，其特征在于，在所述基片材料 的表面覆盖一层膜。
17、 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述膜包括二氧 化硅膜、碳化硅膜、钛化硅膜、氮化硅膜、锗化硅膜、金刚石膜、或 类金刚石膜。
全文摘要
本发明涉及生物芯片表面的化学修饰蛋白领域，具体地说，本发明涉及一种用于经氨基改性的生物芯片表面修饰蛋白的修饰剂、与包含该修饰剂的组合物、以及利用该组合物对生物芯片表面进行修饰蛋白的方法；其中，所述修饰剂是含有活性官能团羧基的小分子。本发明的方法使用的修饰剂为固体且稳定，与氨基结合更稳定，而且试剂本身不发生聚合，与蛋白结合过程中也不发生聚合，表面修饰质量稳定、易于控制、成本低，适合于大批量生产使用。
文档编号G01N33/553GK101441214SQ200710187299
公开日2009年5月27日 申请日期2007年11月19日 优先权日2007年11月19日
发明者芳 李, 陈志锋, 高云华 申请人:中国科学院理化技术研究所