专利名称：氨(离子)诊断/测定试剂盒及氨(离子)的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离子)浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术：
氨测定的方法有微量扩散法、离子交换法、酶法和氨电极法等。目前应用最多的方法是酶法和基于离子选择电极的血氨测定仪分析法。
扩散法是标本碱化后，释放出NH3，用酸滴定释放出的氨，或用Nessler反应形成棕黄色碘化双汞胺进行比色。这些方法需要碱化，内源性的氨形成造成影响，使其准确性和精密度受到影响，目前已很少应用；离子交换法比扩散法更准确，CV为8M 13X;离子选择电极法是利用NH3扩散到电极表面，引起电极的PH发生变化进行测定，该方法的CV为3.5X 4.8X，回收率高。结合具体实际，应以酶法测定为实用。
检索中国专利，仅査出87105593.7专利申请公开了一种血氨测定速冻杯，却未发现比较理想的血氨测定方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定氨(离子)浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的氨(离子)诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行氨(离子)浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。本发明氨(离子)浓度测定方法原理如下
氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸谷氨酰胺合成酶谷氨酰胺+
腺苷二磷酸+磷酸根腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+
丙酮酸
丙酮酸+ 二氧化碳+还原型辅酶苹果酸脱氢酶(脱羧化)
L-苹果酸+辅酶
这种方法应用谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase; EC 6.3丄2)酶(偶)联丙酮酸激酶(pyruvic kinase; EC 2.7丄40)、苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase ;EC1丄1.38; ECU.1.39; EC 1.1.1.40; EC 1.1.1.83)酶促反应终点比色法。谷氨酰胺合成酶酶解氨(离子)反应产生腺苷二磷酸，再通过(偶)联合丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nrn处吸光度下降的程度，通过测量340nm处吸光度下降的程度，可以测算氨(离子)的浓度大小。其中，二氧化碳可以用碳酸氢钠或其他碳酸氢盐取代。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明氨(离子)诊断/测定试剂盒较为理想
缓冲液 10Ommol/L稳定剂 50Ommol/L还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
丙酮酸激酶 8000 U/L苹果酸脱氢酶 10000 U/L
谷氨酸 10mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸 5 mmol/L
碳酸氢钠 3 mmol/L
本发明的氨(离子)诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，
直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶。试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶。
还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定氨(离子)浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100讓ol/L稳定剂 500 mmol/L
还原型辅酶 0.25 mmol/L
谷氨酰胺合成酶 6000 U/L
丙酮酸激酶 8000 U/L
苹果酸脱氢酶 10000 U/L
谷氨酸 1Ommol/L腺苷三磷酸 3 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸 5 mmol/L
3 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm,测试副波长405nm，被测氨(离子)样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
实施例二
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为双试剂，包括
试剂1
(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 10Ommol/L
稳定剂还原型辅酶
腺苷三磷酸磷酸烯醇式丙酮酸
碳酸氢钠
50 mmol/L0.25 mmol/L
10 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L3 mmol/L
试剂2
(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
歸mmol/L500 mmol/L谷氨酰胺合成f
6000 U/L
丙酮酸激酶 8000 U/L
苹果酸脱氢酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间IO分钟，起始吸光度1.8
±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm,被测氨(离子)样品与试剂1、
试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间0分钟，
检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
实施例三
本实施例的氨(离子)诊断/测定试剂为三试剂，包括
试剂l
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
稳定剂
还原型辅酶
腺苷三磷酸磷酸烯醇式丙酮酸
100 mmol/L50 mmol/L0.25 mmol/L10 mmol/L3 mmol/L5 mmol/L3 mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液稳定剂
100 mmol/L500 mmol/L丙酮酸》
■0 U/L
苹果酸脱氢酶
10000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液
100mmol/L
稳定剂
500 mmol/L
谷氨酰胺合成
6000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
领淀氨(离子)浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时
间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被 测氨(离子)样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向 为负反应(下降反应)，延迟时间O分钟，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器 得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.0015;吸光度时 间反应曲线应呈下降曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达2 mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过土5 %;试剂测试的精密度 (重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.66 ± 0.2AA/mmol /L——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，足以便于推广应用。
权利要求
1. 一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(离子)浓度测定方法，其方法原理如下氨离子+谷氨酸+腺苷三磷酸 <u>谷氨酰胺合成酶</u> 谷氨酰胺+ 腺苷二磷酸+磷酸根腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸丙酮酸+二氧化碳+还原型辅酶 <u>苹果酸脱氢酶(脱羧化)</u> L-苹果酸+辅酶其中，二氧化碳可以用碳酸氢钠或其他碳酸氢盐取代。将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度，测算出氨(离子)的浓度大小测定结果。
2. —种氨(离子)诊断/测定试剂盒，主要成分包括:缓冲液20--500 mmol/L稳定剂1--4000 mmol/L还原型辅酶0.1--0.35 mmol/L谷氨酰胺合成f1000-8000 U/L丙酮酸激酶1000--80000 U/L苹果酸脱氢酶1000--80000 U/L谷氨酸1-50 mmol/L腺苷三磷酸1-50 mmol/L 磷酸烯醇式丙酮酸1-50 mmol/L碳酸氢钠1-50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱 氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱 氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠组成双剂试剂； 试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇 式丙酮酸、碳酸氢钠组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶、 丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶组成。还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激 酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠在 试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱 氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠组成多剂试剂； 试剂l，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇 式丙酮酸、碳酸氢钠组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙酮酸激酶、苹果 酸脱氢酶组成;试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酰胺合成酶组成。还原型 辅酶、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述氨(离子)诊断/测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂1~4000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的氨(离子)诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定氨(离子)浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、还原型辅酶、谷氨酸、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、碳酸氢钠、谷氨酰胺合成酶、丙酮酸激酶、苹果酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度，从而测算出氨(离子)的浓度大小。
文档编号G01N21/31GK101464343SQ20071019213
公开日2009年6月24日 申请日期2007年12月19日 优先权日2007年12月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司