凝胶化测定装置以及试样盒的制作方法

专利名称：凝胶化测定装置以及试样盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及凝胶化测定装置以及试样盒，通过检测凝胶化现象过
程来测定内毒素或(3-D葡聚糖等测定对象的试样中的浓度。
背景技术：
内毒素(细胞内毒素)是以构成革兰氏阴性菌的细胞壁的脂多糖 (磷脂质和多糖类的高分子复合体)，将称作脂质A的脂质和多糖锁通 过2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)结合的脂肪多糖(LPS)。由于细菌的死 亡等，细胞壁破裂内毒素才被释放。内毒素对生物产生各种作用，特 别是作为引起发热或致命的败血症或休克的有害物质，并且是DIC (弥 散性血管内凝固综合症)的起因之一。而且，医药物品(注射剂等) 或医疗用具(血管导管等)不被内毒素污染(无热原pyrogen free)是 非常重要的，在使用细菌制作的医药物品(在重组蛋白质、基因治疗 中使用的DNA等)中，完全除去内毒素是不可缺少的。
这种内毒素的除去确认或者急救医学中的计定测量，不仅能够对 应于多数的试样测定，而且还要求以救命治疗为目的的迅速性。
在1964年，莱文和班发现了鲎的血球提取成分由于内毒素而凝固 (凝胶凝固)的现象。利用该现象的内毒素检测法被称为鲎试验 (Limulustest)，此外，应用将作为鲎的血球提取成分的鲎试剂与含有 内毒素的样本溶液进行凝胶化。
已知有从凝胶凝固的样本溶液的稀释倍率测定内毒素浓度的凝胶 化法，或者通过伴随凝胶化反应的浓度变化来测定内毒素浓度的比浊 法(下述专利文献l)。而且，还已知有代替凝固过程中的凝固前驱物 质(基质)而加入发色合成基质(Boc-Leu-Bly-Arg-p-硝基苯胺)，由其 加水分解而使p-硝基苯胺游离，利用其黄色发色的比色测定内毒素浓 度的发色合成基质法等。并且，已知有使鲎试剂与样本的混合溶液在 圆形管构成的测定回路中循环，并使用激光散射进行凝胶化，来计测0.5mm以下的散乱粒子的数量(下述专利文献2)。
此外，利用同样的凝胶化反应的测定技术，不仅是内毒素，也可 以被利用于P-D葡聚糖(P-Dglucan)等的测定。
卩-D葡聚糖((3-D-glucan)为构成真菌特征的细胞膜的多糖(多糖 体)。通过测定P-D葡聚糖，不仅是假丝酵母或曲霉菌、隐球菌这样的 一般在临床上常见的真菌，而且在还含有稀有真菌的广大范围内对真 菌感染症的鉴别等有效。
虽然在(3-D葡聚糖的测定中利用的是通过p-D葡聚糖使鲎的血球 提取成分凝固(凝胶凝固)，但也可以与上述相同利用凝胶化法或比浊 法、发色合成基质法来测定。
内毒素和p-D葡聚糖的测定方法具有共同点，例如，使用大致相 同的测定硬件，通过从鲎的血球提取成分中除去G因子成分，能够对 内毒素选择性地测定凝胶化反应或发色反应，而且由于通过前处理使 试样中的内毒素不活化(钝化)，因此能够对p-D葡聚糖选择性地测定 凝胶化反应或发色反应。
专利文献1:日本特开2004-93536号公报
专利文献2:日本特开2003-322655号公报

发明内容
(发明要解决的问题)
在现有的各种鲎试验方法中，凝胶化法为，将试样加入到鲎试剂 液中并以一定温度静置，测定直到生成流动性较低的凝胶为止的时间。 而且，比浊法为同样将试样加入到鲎试剂液中并以一定温度静置，取 得伴随凝胶化反应的浊度变化作为透过光量的变化，测定透过光量从 反应开始直到变化一定的比例为止的时间作为凝胶化时间。
并且，上述任一现有方法，都检测凝胶化反应本身，在现有方法 中，都没有考虑鲎试剂与样本混合后促进凝胶化反应的问题。因此， 有在试剂/样本溶液中生成凝胶需要约90分钟的较长时间的问题。
并且，反应溶液的凝胶化时间虽然与测定对象的物质的浓度成正 比，但是由于凝胶化法和比浊法都不能从灵敏度这点检测正确的凝胶 化开始时间，因此从直至凝胶化结束的时间算出反应量，得到凝胶化
4时间的基准，因此，凝胶化法和比浊法都不是适合于需要急救的情况 或者测定多个样本的方法。
另一方面，虽然发色合成基质法与凝胶化法和比浊法相比，测定 时间为30分钟较短的时间，但是存在产生伪阳性反应的情况，而且， 测定准备繁杂。
本发明解决了上述问题，能够在短时间内正确地测定通过内毒素
或P-D葡聚糖等、凝胶化反应测定的物质的浓度。
(解决问题所用的方法)
为了解决所述问题，本发明提供一种凝胶化反应测定装置，用于
通过凝胶化反应测定试样中的目的物质，其包括试样盒，收容含有 测定目的物质的试样和含有产生凝胶化的试剂的溶液；搅拌组件，搅 拌所述试样盒中的溶液；照射组件，将光照射在所述试样盒上；受光 组件，接受所述试样盒中生成的凝胶粒子通过所述照射组件的照射光 产生的透过光；以及运算组件，基于利用所述受光组件检测达到一定 以下的透过光量为止的延迟时间，测定所述溶液中的所述物质的浓度。 并且，使用于所述凝胶化反应测定装置中的所述试样盒，由预先 封入搅拌组件并通过密闭部件密闭的容器构成，其中所述搅拌组件用 于搅拌投入产生测定目的物质的凝胶化的试剂及试样后的试样、以及 所述试剂的溶液。
(发明的效果)
根据所述构成，通过搅拌含有测定目的物质的试样和含有产生凝 胶化的试剂的溶液，可以促进内毒素和(3-D葡聚糖等的测定目的物质 的凝胶化反应，因此凝胶化产生的粒子(凝胶粒子)在早期出现，与 现有的比浊法相比，能够以显著縮短的时间正确地测定利用凝胶化反 应测定的物质的浓度。
而且，由于试样盒由预先封入搅拌组件并通过密闭部件密闭的容 器构成，其中所述搅拌组件用于搅拌投入产生测定目的物质的凝胶化 的试剂及试样后的试样、以及所述试剂的溶液，因此能够降低搬运或 者操作过程中由于测定目的物质混入试样中而产生测定误差的可能 性，并能够进行所述高灵敏度的测定。


图1是表示本发明采用的测定装置构成的说明图； 图2A是表示利用图1的测定装置的内毒素的测定例的说明图； 图2B是表示利用图1的测定装置的内毒素的测定例的说明图； 图2C是表示利用图1的测定装置的内毒素的测定例的说明图； 图3是表示图1的测定装置的试样盒构成的说明图。 符号说明 12聚光透镜 13试样盒
14发光二极管(LED)
15磁力搅拌机
16试样溶液
17受光透镜i
20 AD变换器
21计算机
22光电二极管
23显示器
25搅棒(搅拌棒)
131容器
132密闭部件
133鲎试剂 _
具体实施例方式
以下，作为用于实施本发明的优选实施方式的一个例子，示出了 关于通过使用鲎试剂的凝胶化反应来检测内毒素的浓度的测定装置的 实施例。
实施例1
图1表示本发明采用的测定装置的构成。在图1中，将试样(样 本)添加入到试样盒13内的鲎试剂液中，从发光二极管14照射的光 通过聚光透镜被调整，并被照射于混合的试样溶液16。
试样盒13由例如玻璃等材质构成。在图1中，虽然以开放状态图示试样盒13，但是在后面还详细描述试样盒13的不同构造。
试样盒13内的试样溶液16为了生成凝胶粒子，通过未图示的保 温或加热装置，被保持在37'C的既定温度。
并且，在本实施例中，为了促进试样溶液16中产生的凝胶化反应， 通过搅棒(搅拌棒)25以及磁力搅拌机15以1000rpm程度的适当旋转 数进行旋转搅拌。
透过试样溶液中的凝胶粒子的光，经由受光透镜17，通过用于透 过光强度测定的光电二极管22被测定。
由光电二极管22得到的测定结果作为电信号被输出，通过未图示 的增幅器被电流电压变换、增幅之后，通过AD变换器20被AD变换， 并被输入至作为运算组件的计算机21。
变换为数字信号的透过光测定信号由使用例如个人计算机的硬件 等构成的计算机;21进行信号处理。
计算机21包括键盘、鼠标等操作装置、测定结果显示用的显示 器23、或者打印机等输出装置、其他装置、以及输入/输出与测定结果 或测定相关信息的网络接口等(除了显示器23以外未图示)。
并且，搅棒25的旋转数管理以及前述的试样盒13或者其内部的 试样溶液16的温度管理，也可以通过计算机21来进行。因此，检测 搅棒25的旋转数、试样盒13或者其内部的试样溶液16的温度等的未 图示的编码传感器、探测器等连接于计算机21。并且，通过计算机21 进行的反馈控制，能够对搅棒25的旋转数、试样盒13或者其内部的 试样溶液16的温度进行所需的控制。
在上述构成的测定中，将含有测定目的物质的样本和含有产生凝 胶化的试剂的溶液放入试样盒，测定开始后，根据计测达到一定以下 的透过光量的时间TL (延迟时间)、以及与该TL和试样溶液中的测定 对象物质(下述例子中为内毒素)的量(浓度)相互关联，通过计算 机运算测定对象物质的浓度，并由显示器23显示。
计测达到一定以下的透过光量为止的延迟时间TL、以及测定对象 物质的浓度的相关数据(或者函数关系数据)，如下述的测定例所示预 先测定，关联延迟时间TL与测定对象物质的浓度的表格数据储存在计 算机21的存储装置(HDD或ROM等)中。
7并且，利用计算机21，通过参照该表格数据，能够从实测的延迟
时间TL求出测定对象物质的浓度。下述其他相关的数据可备于计算机 21中作为表格数据。
例如，由下述的测定例(图2A以及图2C)得出的结果，可作为 延迟时间TL与测定对象物质(下述例子中为内毒素)的浓度的相关数 据，以表格的形式储存在计算机21的存储装置中。
并且，根据在凝胶化反应生成的凝胶粒子的生成速度V( V=dXt/dt) 的最大值Vmax、以及与该Vmax与试样溶液中的测定对象物质的量(浓 度)的相互关联，通过计算机21运算目的物质的浓度，并由显示器23 显示。
并且，根据在凝胶化反应生成的凝胶粒子的最大生成量Xmax、以 及与试样溶液中的测定对象物质的量(浓度)的相互关联，通过计算 机21运算目的物质的浓度，并由显示器23显示。
以下，表示使用本发明采用的测定装置的内毒素的测定例。
这里，使用分别含有0.1pg/ml、 lpg/ml 、 10pg/ml 、 100pg/ml已 知浓度的预先准备的内毒素的试样，对伴随本发明的搅棒25的搅拌的 透过光量测定与将现有的试样进行静置的透过光量测定(相当于比浊 法)进行比较对照(图2A以及图2B)。
此外，由各个透过光量测定(图2A以及图2B)示出，能够用于 实际样本测定并作为上述延迟时间TL与测定对象物质的浓度相关联 的表格数据使用的，计测达到一定以下的透过光量为止的延迟时间TL 与测定对象物质的浓度的相互关联(或者函数关系)(图2C)。
首先，图2A中示出，在图1的装置，对分别含有0.1pg/ml、 1 pg/ml 、 10pg/ml 、 100pg/ml各浓度(图表中并排写出的没有单位的数值)的 内毒素的试样进行测定的透过光量变化的测定结果。
在该测定结果中，将含有上述各浓度的内毒素的试样与鲎试剂投 入到图1的装置的试样盒中，用搅棒25开始搅拌，同时，在这期间通 过光电二极管22、 AD变换器20、计算机21进行透过光量测定。
在测定期间中，通过计算机21在显示器上显示伴随凝胶化反应的 透过光强度的时间系列的变化。此时的测定格式，可以是与例如图2A 相同的线图(图表)形式。并且，通过计算机21，运算计测达到一定以下的透过光量为止的 时间TL、凝胶粒子的生成速度的最大值Vmax、以及凝胶化反应生成 的凝胶粒子的最大生成量Xmax，并显示在显示器23上。
此外，为了比较对照，图2B中示出不用搅棒25进行搅拌，对分 别含有与图2A的情况相同的0.1pg/ml、 1 pg/ml 、 10pg/ml 、 100pg/ml 各浓度(图表中并排写出的没有单位的数值)的内毒素的试样进行测 定的透过光量变化的测定结果。
在该测定中，将含有上述各浓度的内毒素的试样与鲎试剂投入到 图l的装置的试样盒中，不用搅棒25进行搅拌，在这期间通过光电二 极管22、 AD变换器20、计算机21进行透过光量测定。
艮P，该图2B的测定实质上相当于不进行搅拌而测定透过光量的现 有的比浊法。
从图2A与图2B的比较可以看出，与不用搅棒25进行搅拌而进 行测定的情况(图2B)相比， 一边用搅棒25进行搅拌一边进行测定 的情况(图2A)的透过光量低于100%的延迟时间较短。
此外，图2C示出图2A以及图2B的各测定中所测定的内毒素浓 度(pg/ml)与计测达到一定以下的透过光量为止的延迟时间TL的结 果。
这里，采用透过光量(透过率)打破100%的时间作为延迟时间 TL。并且，白圈画出的曲线为本发明进行搅拌的情况(图2A)的延迟 时间TL、黑圈画出的曲线为现有的不进行搅拌的情况(图2B)的延 迟时间TL。
从图2C可以看出，在现有技术的不搅拌试样溶液中的比浊法中， 内毒素的测定需要较长时间。
例如，在测定0.1pg/ml浓度的内毒素的情况，比浊法的延迟时间 为约100分钟，而本发明的测定装置测定的延迟时间为35分钟，通过 本测定装置进行搅拌同时进行内毒素测定，如果是该浓度水平的样本， 可以縮短一小时的测定时间。
并且，图2C中画出的曲线，特别是本发明进行搅拌的同时测定(图 2A)的白圈画出的曲线上的各个数据(延迟时间TL:对照物质浓度)， 可作为与延迟时间TL和测定对象物质的浓度关联的表格数据，储存在计算机21的存储装置中。
如果将这样的数据(延迟时间TL:对照物质浓度)备于数据表格 中，对于对照物质的浓度是未知的样本进行测定，求出计测达到一定
以下的透过光量为止的延迟时间TL，通过以该延迟时间TL参照该数 据表格，可以测定样本的对象物质的浓度。
如以上所示，利用图1的构成，即搅拌含有测定目的物质的试样 溶液的同时测定透过光量的构成，可以促进内毒素和卩-D葡聚糖等的 凝胶化反应，因此凝胶化产生的粒子(凝胶粒子)在早期出现，与现 有的比浊法相比，能够以显著縮短的时间正确地测定利用凝胶化反应 测定的物质的浓度。
并且，在上述实施例中，主要说明了将鲎试剂与试样分别投入到 试样盒13中。
但是，为了更正确地测定内毒素，需要考虑设计试样盒周围的构 造来提高无内毒素的程度。
艮口，内毒素在通常环境中多量存在，决不否认在试剂制造工序中 或者测定操作中存在少许内毒素混入试样盒内的可能性。
因此，例如在以试样盒13的一端被打开或可开闭以便能够分别投 入鲎试剂和试样的现有技术设定的无内毒素程度中，本发明的测定装 置对不含有内毒素的样本，也可能由于混入的内毒素影响，而检测出 内毒素阳性。
因此，如图3所示，考虑如下构成试样盒13，在树脂或玻璃等制 成的容器131中收容搅棒(搅拌棒)25和必要量的鲎试剂133，上部 用密闭部件132密闭。
虽然密闭部件132的样式是任意的，但当然要使用在搬运或操作 的过程中不会混入内毒素的部件。
考虑测定试样(样本)向试样盒13内的导入为，例如用注射针等 穿孔密闭部件132来注入等的方式。或者为了使测定试样(样本)的 导入更容易，也可以用在试样盒13内相对于大气压保持一定的负压程 度的方式确定密闭部件132的密闭方法。
当然，图3所示的试样盒13在实现一定的无内毒素程度的制造环 境下组装。如图3所示构成的试样盒13可以作为构成图1表示的测定装置的 附属品或同族产品的一部分例如测定工具这样的产品提供给使用者， 在这种情况下，能够容易地形成满足既定无内毒素程度的测定环境， 并能够稳定达成高精度的测定结果。
并且，在图3中，虽然表示仅一个样本(试样)的试样盒的构成， 但是将多个同样的构成一体化，构成能够同时测定多个样本(试样) 这样的产品也容易。在这种情况下，如图1所示的测定装置侧的构成 也需要与多个试样盒对应的数量。
而且，在以上的实施例中，虽然考虑测定对象的物质为内毒素， 但也可将相同的测定硬件应用于使用同样或类似的鲎试剂的p-D葡聚 糖测定等、检测凝胶化现象过程的相同的测定处理。
产业利用可能性
本发明能够在各种测定装置中实施，通过检测凝胶化现象过程来 测定在使用鲎试剂的内毒素或(3-D葡聚糖等测定对象的试样中的浓度。
权利要求
1、一种凝胶化测定装置，是通过凝胶化反应测定试样中的目的物质的凝胶化反应测定装置，其特征在于，包括试样盒，收容含有测定目的物质的试样和含有产生凝胶化的试剂的溶液；搅拌组件，搅拌所述试样盒中的溶液；照射组件，将光照射于所述试样盒；受光组件，接受所述试样盒中生成的凝胶粒子通过所述照射组件的照射光产生的透过光；以及运算组件，基于利用所述受光组件检测达到一定以下的透过光量为止的延迟时间，测定所述溶液中的所述物质的浓度。
2、 根据权利要求1所述的凝胶化测定装置，其特征在于，在所述运算组件的存储装置中，预先备存有延迟时间与浓度的函数关系数据的数据表格，该函数关系是通过将含有各个不同已知浓度的所述测定目的物质的试样溶液与试剂投入到所述试样盒中，并且分别测定利用所述受光组件检测达到一定以下的透过光量为止的延迟时间而得到的，在对对象物质的浓度是未知的试样进行测定时，所述运算组件通过利用所述受光组件检测达到一定以下的透过光量为止的延迟时间，并参照所述数据表格来测定所述溶液中的所述物质的浓度。
3、 一种试样盒，使用在权利要求1或2中记载的凝胶化反应测定装置中，其特征在于，所述试样盒由预先封入搅拌组件并通过密闭部件密闭的容器构成，其中所述搅拌组件用于搅拌投入产生测定目的物质的凝胶化的试剂及试样后的试样、以及所述试剂的溶液。
4、 根据权利要求3所述的试样盒，其特征在于，在测定目的物质的含有水平为既定程度以下的环境中，进行所述试剂和所述搅拌组件的封入。
全文摘要
本发明提供一种凝胶化测定装置以及试样盒。凝胶化测定装置能够在短时间内正确地测定通过内毒素或β-D葡聚糖等、凝胶化反应测定的物质的浓度。在通过凝胶化反应测定试样中的目的物质的测定装置中，对收容含有测定目的物质的样本和含有产生凝胶化的试剂的溶液的试样盒(13)照射来自发光二极管(14)的照射光。试样盒(13)中的溶液被搅拌棒(25)搅拌，使其生成微小且均匀的凝胶粒子，并从所述照射光中通过。试样盒(13)中生成的凝胶粒子的透过光被光电二极管(22)检测，基于其透过光检测输出，并基于利用计算机(21)检测达到一定以下的透过光量为止的延迟时间，测定所述溶液中的所述物质的浓度。
文档编号G01N33/579GK101680842SQ200780052778
公开日2010年3月24日 申请日期2007年5月1日 优先权日2007年5月1日
发明者白泽义章 申请人:兴和株式会社