专利名称：：利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法
技术领域：
：本发明涉及一种制备方蛋白质分子量标准的方法，可用于生物科学和生物方法等领域。
背景技术：
：1、内含肽介导的反式剪接原理蛋白质内含肽(intein)是寄生在其它蛋白质中的一段多肽链。其编码DM序列与正常蛋白的外显子一起转录和翻译，产生一条多肽链。然后从中切除与内含肽对应的序列，再把被寄生蛋白质的序列连接起来，成为有功能的蛋白质。这是一种蛋白质的自我剪接机制。一般来说，蛋白质内含肽有10个模体(motif),顺序依次为N口AN2B化CDEHFGC口，其中A、N2、B、N"F、G属于自我剪接域的模体，而C、D、E、H属于归位核酸内切酶域的模体(PerlerFB,OlsenGJ，AdamE.Compilationandanalysisofinteinsequences.NucleicAcidsRes.1997,25(6):1087;PerlerFB.InBase:theInteinDatabase.NucleicAcidsRes.2002，30(1):383)。对于内含肽行使剪接功能来说，归位核酸内切酶结构域并不是必须的。蓝藻S7"ec力0c7W/ssp.PCC6803的DM聚合酶III的a亚基(DnaE),分成两段，dnaE-n基因编码前774个氨基酸，dnaE-c基因编码后423个氨基酸，这两段间隔745kb。它们分别表达后，通过内含肽的相互识别，反式剪接到一起形成完整功能蛋白(见图U。(SvmW,YangJ,LiuXQ.Synthetictwo-pieceandthree-piecesplitinteinsforproteintrans-splicing.JBiolChem.2004，279(34):35281)。2、蛋白质分子量标准的重要性蛋白质研究是生命科学中重要的组成部分，其中蛋白质分子量标准作为蛋白质的定性甚至定量研究的重要工具，可用于蛋白质电泳、蛋白质定量以及蛋白质印迹等。目前，蛋白质分子标准的来源较窄，尤其是高分子量蛋白质标准。目前市面上的众多蛋白质分子量标准多是釆用的已知天然蛋白，分子量数值关系不是等比例(见表1)，实验观察时不是很明了。如果待检测蛋白分子量恰好在两个跨度较大的蛋白之间，那么检测不出来。有些大型生物公司通过直接表达特定的重组蛋白来获得整数大小分子量标准，但这种方法导致生产成本极高，如Invitrogen公司的BenchMarkProteinLadder,每毫升价格为2600元。利用内含肽的反式剪接方法，可以将不同分子量的蛋白质连接在一起，制作间隔均匀的蛋白质分子量标准。
发明内容本发明目的是:利用内含肽的反式剪接方法，将不同分子量的蛋白质连接在一起，制作间隔均匀的蛋白质分子量标准。利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法，选择一段在一定分子量间蛋白X,另选择两种互不兼容的内含肽A和B,将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Be;然后将它们组成五个重组蛋白，即起点(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)、中段2(Bc-X-An)、终点1(Ac-X)、终点2(Be-X);通过上面五个蛋白的相互组合叠加，获得多种分子量分布范围的蛋白质分子量标准；该核酸分子编码的蛋白包含已知蛋白和断裂内含肽A的氨基末端部分。这一段特定分子量蛋白X(如10kD),两种互不兼容的内含肽A和B(如蓝藻分"ec力oc/W/ssp.PCC6803的DnaE和DnaB)，将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后将它们组成五个重组蛋白，即起点(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)、中段2(Be-X-An)、终点l(Ac-X)、终点2(Bc-X)。经研究发现，几乎所有的内含肽基因都可以在归位核酸内切酶编码区被分割成两部分，这两个部分分别表达，再通过内含肽相互识别，重新组装激活剪接活性，使两端的蛋白连接起来。一定分子量间的蛋白X,如10kD,也可以在几十至上百kD。具体定义如下起点已知分子量的蛋白和断裂内含肽A的氨基部分(N端)相连的蛋白；中段l:已知分子量的蛋白一端连接断裂内含肽A的羧基部分(C端)，另一端连接断裂内含肽B的氨基部分(N端);中段2:已知分子量的蛋白一端连接断裂内含肽B的羧基部分(C端)，另一端连接断裂内含肽A的氨基部分(N端)；终点l-.已知分子量蛋白和断裂内含肽B的羧基部分(C端)相连的蛋白；终点2:已知分子量蛋白和断裂内含肽A的羧基部分(C端)相连的蛋白。具体实施例方式如蓝藻5y/ec/7oc"/ssp.PCC6803的DnaE和DnaB,将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后将它们组成五个重组蛋白，即起点(X-An)、中段l(Ac-X-Bn)、中段2(Be-X-An)、终点1(Ac-X)、终点2(Be-X)。首先让"起点"蛋白和"终点2"蛋白反应，可以得到分子量为已知蛋白两倍的蛋白；要是让"起点"蛋白、"中段2"蛋白反应，然后再加入"终点l"蛋白反应，这样就可以得到分子量为已知蛋白3倍的蛋白；要是让"起点"蛋白、"中段l，'蛋白反应，然后再加入"中段2"蛋白反应，最后加入"终点2"蛋白，可以得到分子量为已知蛋白4倍的蛋白；依次循环重复，便可以得到分子量为已知蛋白任意整数倍的蛋白。然后利用这些不同分子量的蛋白制作蛋白质分子量标准(见图2)。发明具体表述；1核酸分子的构建1)"起点"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的3'口端侧接编码断裂内含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；2)"中段l"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端側接编码断裂内含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列，3口端侧接编码断裂内含肽B的氨基末端部分的核苷酸序列；3)"中段2"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端侧接编码断裂内含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列，3口端侧接编码断裂内含肽A的氯基末端部分的核苷酸序列；4)"终点1"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端侧接编码断裂内含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列；5)"终点2"蛋白的核苦酸序列，该核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'口端侧接编码断裂内含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列.2蛋白的表达抅建一宿主系统，让上述5个核酸分子表达，得到我们所需要的蛋白3蛋白的连接根据不同的需求，让上述产生的5种不同的蛋白在一定条件下反应，得到不同.分子量的蛋白。反应之后，进行纯化。4蛋白分子量标准的制备利用步骤3产生的蛋白，制作蛋白质分子量标准。图l.是内含肽介导的反式剪接示意图。N表示DnaE的N端及其编码基因的5'端，In表示内合肽的N端及其编码部分的5'端，C表示DnaE的C端及其编码基因的3'端，Ic表示内含肽的C端及其编码部分的3'端图2.是反应流程图。A)图示；B)起始反应与终止反应；C)延伸反应。具体实施例方式下面通过实施例，对本发明的方法方案作进一步具体的说明。实施实例l:生产起点、中段l、中段2、终点l、终点2。选择大肠杆菌EscherichiacoliK12的gusA基因的1—85氨基酸，加上一个天冬氨酸(密码子为GAU)，得到分子量为10000.23Da的蛋白序列，具体序列如下MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQR鼎ESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQKEVFIPKGWAGQRIVD。选择蓝藻Synechocystissp.PCC6803的DnaE内含肽和DnaB内含肽(http:〃www.neb-cora/neb/inteins.html)oDnaE内含肽氨基端序列如下CLSFGTEILTVEYGPLPIGKIVSEEINCSVYSVDPEGRVYTQAIAQ冊DRGEQEVLEYELEDGSVIRATSDHRFLTTDYQLLAIEEIFARQLDLLTLENIKQTEEALDNHRLPFPLLDAGTIK。DnaE内含肽羧基端序列如下MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIMN。DnaB内含肽序列如下CISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCERAAKIATITQSPEIEKLSQSDIYTOSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHN。根据文献报道(SunW,YangJ,UuXQ.Synthetictwo-pieceandthree-piecesplitinteinsforproteintrans-splicing.JBiolChem.2004,279(34):35281)，将DnaB内含肽两端序列切下，氨基端序列如下CISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQ。羧基端序列如下LSPEIEKLSQSDIYW将上面这些序列组合，得到起点，MLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIKNYAGNVWYQREVFIPKGMGQRIVDCLSFGTEILTVEYGPLPIGKIVSEEINCSVYSVDPEGRVYTQAIAQ冊DRGEQEVLEYELEDGSVIRATSDHRFLTTDYQLLAIEEIFARQLDLLTLENIKQTEEALDNHRLPFPLLDAGTIK;中段1，MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIAANMLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVDCISGDSLISLASTGKRVSIKDLLDEKDFEIWAINEQTMKLESAKVSRVFCTGKKLVYILKTRLGRTIKATANHRFLTIDGWKRLDELSLKEHIALPRKLESSSLQ;中殺2，1SPEIEKJLSQSWW^IVSI-拓TGW现V冊LWPCPHNFV娜I寸WNiRPVfTPHEIKKLDGLWALTLENIKQTEEALDNHRLPFPLLDAGTIK;终点1，MVKVIGRRSLGVQRIFDIGLPQDHNFLLANGAIMNMLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFNDQFADADIRNYAGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVD;终点2，LSPEIEKLSQSDIYWDSIVSITETGVEEVFDLTVPGPHNFVANDIIVHNMLRPVETPTREIKKLDGLWAFSLDRENCGIDQRWWESALQESRAIAVPGSFN叫FADADIR附AGNVWYQREVFIPKGWAGQRIVD。实施实例2:使用起点、中段l、中段2、终点1和终点2，生产蛋白质分子量标准。按"
发明内容"部分的"发明概述"一节的流程操作。表l.常用蛋白质分子量标准参照物<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>权利要求1.利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法，其特征是选择一段一定分子量的已知蛋白X，另选择两种互不兼容的内含肽A和B，将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc；然后将它们组成五个重组蛋白，即起点蛋白(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)蛋白、中段2蛋白(Bc-X-An)、终点1蛋白(Ac-X)、终点2蛋白(Bc-X)；通过上面五个蛋白的相互组合连接叠加，获得多种分子量分布范围的蛋白质分子量标准。2、根据权利要求1所述的利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法，其特征是五种非天然形成的蛋白分子构成1)一种蛋白包含一定分子量的已知蛋白和断裂内含肽A的氨基末端部分；2)—种蛋白包含断裂内.含肽A的羧基末端部分，一定分子量的已知蛋白和断裂内含肽B的氨基末端部分；3)—种蛋白包含断裂内含肽B的羧基末端部分，一定分子量的已知蛋白和断裂内含肽A的氨基末端部分；4)一种蛋白包含断裂.内含肽A的羧基末端部分和一定分子量的已知蛋白；5)—种蛋白包含断裂内含肽B的羧基末端部分和一定分子量的已知蛋白。3、根据权利要求l所述的利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法，其特征是1)编码"起点"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的3'端侧接编码断裂内含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；2)编码"中段l"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'端侧接编码断裂内含肽A的羧基末端部分的核苦酸序列，3'端侧接编码断裂内含肽B的氨基末端部分的核苷酸序列；3)编码"中段2"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子由已知蛋白的核苷酸序列的5'端侧接编码断裂内含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列，3'端侧接编码断裂内含肽A的氨基末端部分的核苷酸序列；4)编码"终点l"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'端侧接编码断裂内含肽B的羧基末端部分的核苷酸序列；5)编码"终点2"蛋白的核苷酸序列，该核酸分子的由已知蛋白的核苷酸序列的5'端侧接编码断裂内含肽A的羧基末端部分的核苷酸序列。4、根据权利要求1所述的利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法，其特征是选择大肠杆菌EscherichiacoliK12的gusA基因的1-85氨基酸，加上一个天冬氨酸(密码子为GAU),得到分子量为10000.23Da的蛋白序列，作为蛋白X;另选择蓝藻J/加c力oc/W/、sp.PCC6803的DnaE和DnaB分别作为内含肽A和B。将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc。然后将它们组成五个重组蛋白，即起点(X-An)、中段l(Ac-X-Bn)、中段2(Be-X-An)、终点1(Ac-X)、终点2(Bc-X);首先让"起点"蛋白和"终点2"蛋白反应，得到分子量为已知蛋白两倍的蛋白；让"起点"蛋白、"中段2"蛋白反应，然后再加入"终点r蛋白反应，得到分子量为已知蛋白3倍的蛋白；让"起点"蛋白、"中段l"蛋白反应，然后再加入"中段2"蛋白反应，最后加入"终点2"蛋白，得到分子量为已知蛋白4倍的蛋白；依次循环重复，便可以得到分子量为已知蛋白任意整数倍的蛋白。全文摘要本发明公开了一种利用内含肽反式剪接制作蛋白质分子量标准的方法，选择一段一定分子量的已知蛋白X，另选择两种互不兼容的内含肽A和B，将内含肽A和B分别分解为氨基末端(N端)与羧基末端(C端)，即An、Ac、Bn、Bc；然后将它们组成五个重组蛋白，即起点蛋白(X-An)、中段1(Ac-X-Bn)蛋白、中段2蛋白(Bc-X-An)、终点1蛋白(Ac-X)、终点2蛋白(Bc-X)；通过上面五个蛋白的相互组合连接叠加，获得多种分子量分布范围的蛋白质分子量标准。可用于蛋白质电泳、蛋白质定量以及蛋白质印迹等。文档编号G01N1/28GK101281201SQ20081002484公开日2008年10月8日申请日期2008年5月7日优先权日2008年5月7日发明者静刘,张云华,张鹏飞,宕李,凯王,强王,王海燕,陈建群申请人:南京大学