专利名称：定量测定糖化蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及医药检测领域，具体的说涉及一种定量测定糖化蛋白质的方法。
背景技术：
一.临床意义 糖尿病是一组病因和发病机制尚未完全明了的内分泌代谢性疾病，目前发病率仅次于心脑血管疾病和肿瘤。在我国糖尿病发病率为2-3％，并以每千分之一的速度增长。目前临床已广泛开展检测患者血糖工作。但血糖测定只代表即刻的血糖水平，提示患者当时的身体状况，并不能作为评价疾病控制程度的指标。
糖尿病常会引起视网、肾、神经等病变及各种并发症。要彻底治愈是非常困难的，严格地控制血糖水平是治疗糖尿病及预防其各种并发症的有效手段。近年来糖化蛋白质指标正日益受到临床的高度重视，其中，糖化血红蛋白和糖化白蛋白尤其重要。糖化白蛋白、糖化血红蛋白、和糖化蛋白一样，被当作用于血糖控制的指标。糖化血红蛋白反映过去1个月～2个月的血糖水平，而糖化白蛋白与糖化蛋白反映过去2周～3周的血糖水平。糖化白蛋白的检测避免了血清白蛋白下降对测定结果的影响。因此在了解血糖短期水平时如妊娠、外伤、急性合并症时具有优势。
糖化血红蛋白是指血液中和葡萄糖结合了的那一部分血红蛋白。当血液中葡萄糖浓度较高时，人体所形成的糖化血红蛋白含量也会相对较高。人体内红细胞的寿命一般为120天，在细胞死亡前，血液中糖化血红蛋白含量也会保持相对不变。因些糖化血红蛋白水平反映的是在检测前120天内的平均血糖水平，而与抽血时间，病人是否空腹，是否使用胰岛素等因素无关。是判定糖尿病长期控制的良好指标。
白蛋白是血液中含量最高的蛋白质。糖化白蛋白形成于血糖及白蛋白之间的反应。反应是缓慢而持续的糖化白蛋白的升高，意味着前一时期血糖的持续升高。由于白蛋白在血液中的循环时间约两星期，所以糖化白蛋白提供了测定前10-20天的监测窗口。
糖化血红蛋白和糖化白蛋白的测定结果都是以百分率表示，指的是和葡萄糖结合的血红蛋白(白蛋白)占全部血红蛋白(白蛋白)的比例。
非糖尿病患者的糖化血红蛋白的水平为4-6％；许多研究发现糖尿病患者如能将糖化血红蛋白水平降低至8％以下，糖尿病的并发症将大大降低，如果糖化血红蛋白＞9％，说明患者待续性高血糖，会发生糖尿病性肾病，动脉硬化，白内障等并发症，并有可能出现酮症酸中毒等急性合并症。因此，有关专家建议，如果糖尿病患者血糖控制已达标准，并且血糖控制状态较为了平稳，每年至少应该接受2次糖化血红蛋白检测；对于那些需要改变资料方案，或者血糖控制状态不稳定的患者，及正在进行胰岛素治疗的患者，应该每三个月进行一次糖化血红蛋白测定。
非糖尿病患者的糖化白蛋白的水平为12-17％。但测定方法不同，会有不一样的结果，也有报导指出正常人的糖化白蛋白的水平在1.5％-15.0％之间。糖化白蛋白的结果能用于糖尿病的筛选，糖尿病患者糖化白蛋白水平明显高于正常对照组，并与空腹血糖呈正相关。糖化白蛋白的测定不受进食、胆红素、尿酸、肌酐、血红蛋白及维生素C的干扰，尤其是排除了肝肾疾病、溶血性贫血和蛋白质结构异常对血浆蛋白量的影响。糖化白蛋白变化早于糖化血红蛋白，对不稳定的血糖变化，糖化白蛋白能及时监测。糖化白蛋白可用作糖尿病妊娠与孕期高血糖的鉴别，糖尿病妊娠者糖化白蛋白高于孕期高血糖患者的水平。糖化白蛋白与糖化血红蛋白有较好的相关性，但糖化血红蛋白除糖尿病外其他疾病也可升高，如尿毒症、甲亢、肾衰等，但这些疾病时糖化白蛋白正常；溶血性贫血、血红蛋白异变体如HbS或HbC、高HbF血症时，由于红细胞寿命下降糖化血红蛋白变化较大而糖化白蛋白不受干扰；因此糖化白蛋白与糖化血红蛋白结合应用提高检测的准确性。当蛋白浓度发生变化时，对肾病综合征、肝硬化、异常蛋白血症或急性时相反应之后的患者，病时糖化蛋白结果不可靠，而糖化白蛋白的测定不受蛋白变化的影响。蛋白经糖化后可形成稳定和不可逆的晚期糖基化终未产物(AGE)，从而使这些蛋白质的结构和功能发生变化，影响许多配体的亲和力；低密度脂蛋白(LDL)糖化成LDL-AGE，经过机体的免疫反应，形成LDL-AGE免疫复合物，促进巨噬细胞的聚集、吞噬而积聚胆固醇脂，使其转化成泡沫细胞，经受体介导、激活、合成、释放具有广泛生物活性的细胞因子，最终使血管内膜损伤、粥样斑块形成动脉粥样硬化。同时体内VI胶原AGE形成后，使分子内共价健交联增加，螺旋结构减少，引起胶原弹性下降及变硬，在微血管基底膜上形成沉积造成底膜加厚，而IgG免疫复合物的自身免疫反应又加重了组织损伤，导致视网膜和肾小球产生微血管病。因此糖化白蛋白测定又可估计组织蛋白的糖基化作用，了解其并发症的发生、发展及并发症的预测、预防。
二.相关测定方法 糖化蛋白质检测的方法很多，测定方法主要有色谱法、电泳法、化学法和免疫法。
目前，以离子交换层析为原理的高效液相色谱法(HPLC)，即糖化蛋白分析仪，已被广泛用于测定血液中糖化蛋白％。虽然这种方法重复性非常好，但也存在着一些缺点，其中包括需要一个专门的高效液相色谱仪系统，测定容量有限，以及由不同形式血红蛋白引进的不准确的结果。此外，它需要高度的技术维护。
US专利#4,269,605 U.S专利#5,284,777，讲述了使用一种硼酸衍生物固定于琼脂糖珠子的亲和层析方法。
US专利#5,110,745介绍了将测定标本与过剩量的硼酸化合物反应，然后再用固化的糖化分子吸附剩余的硼酸化合物。最后测定没有结合硼酸化合物的糖化分子的量。此方法操作步骤很多，还必须严格控制硼酸化合物的量。
日本专利#6,058,936，和欧洲专利#455225讲述了将硼酸衍生物与一可探测标签偶联(如荧光化合物，化学发光复合，同位素，酶或其他标签)然后与另一抗体一起测定糖化蛋白质。
所有上述方法都是测定单一的糖化蛋白质，而糖化蛋白质通常是以与总蛋白质量的百分比来表达的。所以还必需用另一种方法来测定总蛋白质量。
WO#9840750推荐了一种方法用固化的硼酸与样本中的糖化蛋白质反应。他的设计可以不用测定非糖化蛋白质而得到糖化蛋白质与总蛋白质量的百分比的结果。但是由于硼酸和糖化蛋白质的亲和力有限，此方法的结果会受到温度和孵育时间的影响。
近年来，免疫试剂由于它对糖化蛋白质的高度特异性和亲和力已显示了它的特殊生命力。
欧洲专利#201187讲述了制备特异性抗糖化血红蛋白单克隆抗体的方法。
US专利#522392讲述了制备特异性抗糖化白蛋白单克隆抗体的方法。
US专利#5470759讲述了利用特异性抗糖化血红蛋白单克隆抗体，建立免疫凝集试验和免疫浊度试验测定糖化血红蛋白。
US专利#5206144讲述了制备特异性抗糖化血红蛋白单克隆抗体的方法以及用此抗体建立的酶免疫试验测定糖化血红蛋白。此方法必须净取标本红血球，溶血稀释后包被在微孔板上。然后在与特异性抗糖化血红蛋白单克隆抗体反应后，再用酶标第二抗体测定糖化血红蛋白。此方法步骤很多。
US专利#5932480介绍了一步法测定糖化血红蛋白百分比的方法。具体步骤是标本，未包被的固相，特异抗体酶缀合物在一起同时孵育40分钟，摄氏37度。洗净后，再加底物测定酶活性，结果与标准品比较得到标本糖化血红蛋白的百分比。此方法的缺点是在特异抗体酶缀合物和未包被的固相同时孵育的过程中，本底肯定会升高。
由于血液中的血红蛋白含量很高，很多测定糖化血红蛋白的免疫方法，包括上述两种，都把包被血红蛋白作为其测定步骤的一部分。为使血红蛋白包被效果更好，常常还必须加上一个变性处理步骤。其结果往往是测定时间延长，测定误差增加。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种定量测定糖化蛋白质的方法，以解决现有技术中的缺陷。
本发明所提供的定量测定糖化蛋白质的方法，具体的包括如下步骤 ①A-B组合吸取5-50微升溶血稀释液到抗体A包被的固相中，然后加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体B，充分摇匀后静置室温5-30分钟； ②A-C组合吸取5-50微升溶血稀释液到另一抗体A包被的固相中，然后加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体C，充分摇匀后静置室温5-30分钟； ③A-B标准品组合分别吸取5-50微升糖化蛋白质和非糖化蛋白质的标准品到不同的抗体A包被的固相中，然后分别加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体B，充分摇匀后静置室温5-30分钟； ④A-C标准品组合分别吸取5-50微升糖化蛋白质和非糖化蛋白质的标准品到不同的抗体A包被的固相中，然后分别加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体C，充分摇匀后静置室温5-30分钟； ⑤倾去所有固相中的反应液，然后用洗涤液300微升洗五次；拍干残陈液滴； ⑥在每个固相微孔中加100微升标记酶底物，静置室温5-30分钟； ⑦在每个固相微孔中加100微升中止液，充分摇匀后在读数仪上读数； ⑧在A-B组合中得到的标本数据，与A-B标准品组合比较，计算出糖化蛋白质浓度； ⑨在A-C组合中得到的标本数据，与A-C标准品组合比较，计算出总蛋白质浓度； ⑩把糖化蛋白质浓度除以总蛋白质浓度即得到糖化蛋白质百分比浓度； 其中所述的糖化蛋白质为糖化白蛋白或糖化血红蛋白； 其中抗体A对总蛋白质特异；抗体B对糖化蛋白质特异；抗体C对总蛋白质特异。
抗体A-糖化蛋白质-抗体B可形成夹心式的免疫复合物。
特异抗体A-总蛋白质-抗体C可形成夹心式的免疫复合物。
其中所述的抗体A包被的固相为普通微孔板、发光微孔板、荧光微孔板、普通微颗粒或磁颗粒。
其中所述的用于标记抗体B、C的探测标签为标记酶、同位素、荧光化合物或化学发光复合物；优选的为过氧化氢酶、碱性磷酸酶或半乳糖苷酶。
其中步骤⑥中所述的标记酶底物是3，3’5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液、化学发光底物溶液或荧光底物溶液；其中优选的为3，3’5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液(TMB溶液)。当标记酶底物为化学发光底物溶液或荧光底物溶液时，步骤⑦中不需要加中止液。
其中步骤⑦中所述的读数仪是酶标读数仪、化学发光读数仪、荧光读数仪或同位素计数仪 抗体A、B、C均为市售产品， 其中用于检测糖化血红蛋白的抗体A、B、C来自于美国Abcam公司； 抗体A鼠抗人血红蛋白单克隆抗体 型号AB401 抗体B鼠抗人糖化血红蛋白单克隆抗体 型号AB47149 抗体C鼠抗人血红蛋白单克隆抗体 型号AB402 也可以是具有相同特性的其他来源的抗体。
其中用于检测血清白蛋白的抗体A、B、C来自于美国Abcam公司和美国USBiologicai公司； 抗体A美国Abcam公司，名称羊抗人血清白蛋白多克隆抗体，亲和层析纯，型号AB19180 抗体B美国USBiologicai公司，名称鼠抗人血清糖化白蛋白单克隆抗体，型号A1327-55 抗体C美国Abcam公司，名称鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，型号AB7793 也可以是具有相同特性的其他来源的抗体。
糖化蛋白质和非糖化蛋白质的标准品来源USBiological公司。
其中溶血标本是按照如下方法制备的采取1-2微升毛细血管全血，加到10毫升溶血缓冲液中，充分摇匀后静置室温20分钟。
溶血缓冲液的制备0.1M琥珀酸缓冲液(pH 5.0)含0.1％Triton X-100，0.05％叠氮纳。
其中标本稀释液为20mM TRIS-HCl缓冲液，pH 7.20。
其中洗涤液为10mM PBS，pH 7.40，0.05％ Tween-20。
其中TMB溶液3，3’5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液(Sigma-Aldrich，T0440) 其中中止液为2N HCl溶液。
所有化学品的来源都是Sigma-Aldrich公司。
本发明的测定方法具有如下几个特点 1.可以用同一方法，同时定量测定糖化蛋白质和相应的总蛋白质。由此算出的糖化蛋白质百分比更为客观，准确。可避免由不同方法，不同仪器，不同环境，不同操作人员而带来的误差干扰。
2.方法采用两组抗体对子，一组对糖化蛋白质特异，另一组对总蛋白质特异。抗体组的高度特异保证了试验的准确度，抗体组的高亲和力可以缩短试验时间。
3.由于测定结果是以糖化蛋白质和相应的总蛋白质的比例来表达的，所以在一定范围内，取样多少不会影响测定结果。
4.发明可用于多种模式，如传统的酶联免疫试验，化学发光免疫试验，荧光免疫试验，磁颗粒免疫试验等。
5.本发明还可用于免疫浊度试验，制备两种不同的抗体微球，一对糖化蛋白质特异，一对总蛋白质特异。分别试验，然后算出的糖化蛋白质百分比结果。
6.试验可采用毛细血管血，方便采样，减少病人痛苦。
7.本发明的方法可以同时定量测定糖化蛋白质和相应的总蛋白质，不需包被血红蛋白，不需作变性处理，快速，简便，准确。
图1、抗体A包被固相 图2、标记酶标记的抗体B 图3、标记酶标记的抗体C 图4、标记酶底物 图5、A-B组合 图6、A-C组合 图7、血红蛋白的标准品曲线，其中X轴为血红蛋白浓度；Y轴为吸光度 图8、糖化血红蛋白的标准品曲线，其中X轴为糖化血红蛋白浓度；Y轴为吸光度 图9、白蛋白的标准品曲线，其中X轴为白蛋白浓度；Y轴为吸光度 图10、糖化白蛋白的标准品曲线，其中X轴为糖化白蛋白浓度；Y轴为吸光度
具体实施例方式 下列实施例仅用于说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1，糖化血红蛋白的测定。
·固相抗体的制备 抗体A，鼠抗人血红蛋白单克隆抗体，美国Abcam公司，型号AB401抗体A需包被在微孔板(Sigma-Aldrich，M0156)上，抗体浓度，在1.0微克/毫升到10.0微克/毫升之间，包被缓冲液，0.1M碳酸碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6.包被量200微升/微孔，室温过夜。然后用封闭缓冲液(Sigma-Aldrich，C9483)300微升/微孔，室温封闭过夜。甩干后，干燥保存备用。
·抗体-标记酶缀合物的制备 抗体B，鼠抗人糖化血红蛋白单克隆抗体，美国Abcam公司，型号AB47149，抗体C，鼠抗人血红蛋白单克隆抗体，美国Abcam公司，型号AB402 抗体B和抗体C分别与辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich，P8415)缀合。成为抗体-标记酶缀合物。缀合方法根据美国专利4,256,833，简述如下辣根过氧化物酶溶解于0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH值8.5，5毫克酶每毫升。一滴一滴加入1％异硫氰酸苯酯(体积/体积无水乙醇)，同时在室温下，不断轻轻地搅拌酶溶液，直到有轻微混浊的出现。轻轻地在室温下搅拌2小时。然后，一滴一滴加入0.06M过碘酸钠溶液直至终浓度约0.03M。此时，酶的糖类成分中的氧化剂的邻二羟基团被氧化生成自由醛基。此基团可与抗体中的自由氨基在0.1M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH值9.5环境下，轻轻地在室温下搅拌1小时形成希夫氏基团，然后加入硼氢化钠还原稳定(通常，5毫克辣根过氧化物酶和7.5毫克抗体，大约需要0.8毫克硼氢化钠)，进一步纯化去除未反应的抗体和酶即成为抗体-标记酶缀合物成品。抗体-标记酶缀合物成品可根据需要用BioStab酶稳定剂(Sigma-Aldrich，95576)稀释成缀合物应用液。
·血红蛋白和糖化血红蛋白标准品的制备 血红蛋白(USBiological公司，H1850-18)用一生物分子储存液(Sigma-Aldrich，92889)稀释成一系列浓度0，20，100，200毫克/毫升。并分装在小瓶子里备用。试验前吸取1微升到10毫升溶血缓冲液中，充分混匀。(正常人全血血红蛋白的含量在110毫克/毫升到160毫克/毫升之间，此血红蛋白的系列标准品涵盖了这个邻域)。
糖化血红蛋白(USBiological公司，H1850-15)，用一生物分子储存液(Sigma-Aldrich，92889)稀释成一系列浓度0，2，20，50毫克/毫升。并分装在小瓶子里备用。试验前吸取1微升到10毫升溶血缓冲液中，充分混匀。
·溶血缓冲液的制备0.1M琥珀酸缓冲液(pH 5.0)含0.1％Triton X-100，4mM EDTA，0.05％叠氮纳。
·标本稀释液的制备20mM TRIS-HCl缓冲液，pH 7.20。
·血标本的制备采取1微升毛细血管全血，加到10毫升溶血缓冲液中，充分摇匀后静置室温20分钟。
·试验以下列方法进行 1.为血红蛋白的系列标准品准备4个抗体A包被的微孔。分别吸取20微升不同浓度的标准品到各个抗体A包被的微孔中去。然后加100微升标本稀释液、100微升过氧化物酶标记的抗体C缀合物应用液，充分摇匀后静置室温20分钟； 2.为糖化血红蛋白的系列标准品准备4个抗体A包被的微孔。分别吸取20微升不同浓度的标准品到各个抗体A包被的微孔中去。然后加100微升标本稀释液、100微升过氧化物酶标记的抗体B，充分摇匀后静置室温20分钟； 3.为每个标本准备2个抗体A包被的微孔。吸取20微升标本到其中一个微孔中，然后加100微升标本稀释液、100微升过氧化物酶标记的抗体B，充分摇匀后静置室温20分钟；吸取20微升溶血标本到另一抗体A包被的微孔中，然后加100微升标本稀释液、100微升过氧化物酶标记的抗体C，充分摇匀后静置室温20分钟。
4.倾去所有微孔中的反应液，然后用洗涤液300微升洗五次；拍干残陈液滴。
5.在每个微孔中加100微升3，3’5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液，(TMB溶液，Sigma-Aldrich，T0440)，静置室温10分钟。
6.在每个微孔中加100微升中止液，充分摇匀后在酶标读数仪上读数。
7.下面的表1是实际操作中各标准品和标本在微孔板上的位置以及在酶标读数仪上读数的结果 表1
微孔A1血红蛋白标准品0毫克/毫升，A-C组合 微孔B1血红蛋白标准品20毫克/毫升，A-C组合 微孔C1血红蛋白标准品100毫克/毫升，A-C组合 微孔D1血红蛋白标准品200毫克/毫升，A-C组合 微孔E1正常标本N1，A-C组合 微孔F1正常标本N2，A-C组合 微孔G1糖尿病标本D1，A-C组合 微孔H1糖尿病标本D2，A-C组合 微孔A2糖化血红蛋白标准品0毫克/毫升，A-B组合 微孔B2糖化血红蛋白标准品2毫克/毫升，A-B组合 微孔C2糖化血红蛋白标准品20毫克/毫升，A-B组合 微孔D2糖化血红蛋白标准品50毫克/毫升，A-B组合 微孔E2正常标本N1，A-B组合 微孔F2正常标本N2，A-B组合 微孔G2糖尿病标本D1，A-B组合 微孔H2糖尿病标本D2，A-B组合 微孔A3，B3，C3，D3，试剂空白 8.在A-C组合中得到的标本数据，与A-C标准品组合比较，计算出总血红蛋白浓度；在A-B组合中得到的标本数据，与A-B标准品组合比较，计算出糖化血红蛋白浓度。
总血红蛋白的计算结果见表2(A-C组合) 将上述数据进行二次曲线拟合，得到图7的标准品曲线。
糖化血红蛋白的计算结果见表3(A-B组合) 将上述数据进行二次曲线拟合，得到图8的糖化血红蛋白的标准品曲线。
把糖化血红蛋白浓度除以总血红蛋白浓度即得到糖化血红蛋白百分比浓度；实施例1测试了4个标本，其中，2个正常人，(N1，N2)2个糖尿病患者。(D1，D2)计算结果见表4 表4正常人和糖尿病人的糖化血红蛋白的检测结果 实施例2，糖化白蛋白的测定。
·固相抗体的制备 抗体A，羊抗人血清白蛋白多克隆抗体，美国Abcam公司，型号AB19180，抗体A包被在微孔板(Sigma-Aldrich，MO156)上，制备方法与实施例1相同。
·抗体-标记酶缀合物的制备 抗体B，鼠抗人血清糖化白蛋白单克隆抗体，美国USBiological公司，型号A1327-55；抗体C鼠抗人血清白蛋白单克隆抗体，美国Abcam公司，型号AB7793 抗体B和抗体C需分别与辣根过氧化物酶(Sigma-Aldrich，P8415)缀合。成为抗体-标记酶缀合物。缀合方法制备方法与实施例1相同。
·人血清白蛋白和人血清糖化白蛋白标准品的制备 人血清白蛋白(USBiological公司，A1327-31)用一生物分子储存液(Sigma-Aldrich，92889)稀释成一系列浓度0，20，50，100毫克/毫升。并分装在小瓶子里备用。试验前吸取2微升到10毫升血浆缓冲液中，充分混匀。(正常人血清白蛋白的含量在35毫克/毫升到50毫克/毫升之间，此人血清白蛋白的系列标准品涵盖了这个邻域)。
人血清糖化白蛋白(USBiological公司，A1327-53)，用一生物分子储存液(Sigma-Aldrich，92889)稀释成一系列浓度0，2，10，50毫克/毫升。并分装在小瓶子里备用。试验前吸取2微升到10毫升血浆缓冲液中，充分混匀。
·血浆缓冲液的制备0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，4mM EDTA，0.05％叠氮纳。
·标本稀释液的制备20mM TRIS-HCl缓冲液，pH 7.20。
·血标本的制备采取2微升毛细血管全血，加到10毫升血浆缓冲液中，充分摇匀后静置备用。
·试验顺序，方法和结果试验顺序，方法和实施例1相同。结果如下 各标准品和标本在微孔板上的位置以及在酶标读数仪上读数见表5
微孔A1人血清白蛋白标准品0毫克/毫升，A-C组合 微孔B1人血清白蛋白标准品20毫克/毫升，A-C组合 微孔C1人血清白蛋白标准品50毫克/毫升，A-C组合 微孔D1人血清白蛋白标准品100毫克/毫升，A-C组合 微孔E1正常标本N1，A-C组合 微孔F1正常标本N2，A-C组合 微孔G1正常标本N3，A-C组合 微孔H1糖尿病标本D1，A-C组合 微孔A2人血清糖化白蛋白标准品0毫克/毫升，A-B组合 微孔B2人血清糖化白蛋白标准品2毫克/毫升，A-B组合 微孔C2人血清糖化白蛋白标准品10毫克/毫升，A-B组合 微孔D2人血清糖化白蛋白标准品50毫克/毫升，A-B组合 微孔E2正常标本N1，A-B组合 微孔F2正常标本N2，A-B组合 微孔G2正常标本N3，A-B组合 微孔H2糖尿病标本D1，A-B组合 微孔A3，B3，C3，D3，试剂空白 ·在A-C组合中得到的标本数据，与A-C标准品组合比较，计算出总人血清白蛋白浓度；在A-B组合中得到的标本数据，与A-B标准品组合比较，计算出人血清糖化白蛋白浓度。
总人血清白蛋白的计算结果见表6(A-C组合) 将上述数据进行二次曲线拟合得到图9的人血清白蛋白的标准品曲线。
人血清糖化白蛋白的计算结果见表7(A-B组合) 将上述数据进行二次曲线拟合得到图10的人血清糖化白蛋白的标准品曲线。
把人血清糖化白蛋白浓度除以总人血清白蛋白浓度即得到人血清糖化白蛋白百分比浓度；实施例2测试了4个标本，其中，3个正常人，(N1，N2，N3)1个糖尿病患者(D1)。计算结果见表8
权利要求
1.一种定量测定糖化蛋白质的方法，其特征在于该方法包括如下步骤
①A-B组合吸取5-50微升溶血稀释液到抗体A包被的固相中，然后加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体B，充分摇匀后静置室温5-30分钟；
②A-C组合吸取5-50微升溶血稀释液到另一抗体A包被的固相中，然后加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体C，充分摇匀后静置室温5-30分钟；
③A-B标准品组合分别吸取5-50微升糖化蛋白质和非糖化蛋白质的标准品到不同的抗体A包被的固相中，然后分别加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体B，充分摇匀后静置室温5-30分钟；
④A-C标准品组合分别吸取5-50微升糖化蛋白质和非糖化蛋白质的标准品到不同的抗体A包被的固相中，然后分别加100微升标本稀释液、100微升探测标签标记的抗体C，充分摇匀后静置室温5-30分钟；
⑤倾去所有固相中的反应液，然后用洗涤液300微升洗五次；拍干残陈液滴；
⑥在每个固相微孔中加100微升标记酶底物，静置室温5-30分钟；
⑦在每个固相微孔中加100微升中止液，充分摇匀后在读数仪上读数；
⑧在A-B组合中得到的标本数据，与A-B标准品组合比较，计算出糖化蛋白质浓度；
⑨在A-C组合中得到的标本数据，与A-C标准品组合比较，计算出总蛋白质浓度；
⑩把糖化蛋白质浓度除以总蛋白质浓度即得到糖化蛋白质百分比浓度；
其中所述的糖化蛋白质为糖化白蛋白或糖化血红蛋白；
其中抗体A对总蛋白质特异；抗体B对糖化蛋白质特异；抗体C对总蛋白质特异。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的抗体A包被的固相为普通微孔板、发光微孔板、荧光微孔板、普通微颗粒或磁颗粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的标记抗体B、C的探测标签为标记酶、同位素、荧光化合物或化学发光复合物。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑥中所述的标记酶底物是3，3’5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液、化学发光底物溶液或荧光底物溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤⑦中所述的读数仪是酶标读数仪、化学发光读数仪、荧光读数仪或同位素计数仪。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的标记酶为过氧化氢酶、碱性磷酸酶或半乳糖苷酶。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的标记酶底物为3，3’5，5-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的标记酶底物为化学发光底物溶液或荧光底物溶液时，不需要加中止液。
全文摘要
本发明提供一种测定糖化特定蛋白质的方法，该方法采用两组抗体对子，一组对糖化蛋白质特异，另一组对总蛋白质特异，可以同时测定糖化特定蛋白质和非糖化特定蛋白质，由此算出他们的比例。抗体组的高度特异性和亲和力保证了试验的准确度，缩短了试验时间。
文档编号G01N33/68GK101493467SQ20081003307
公开日2009年7月29日 申请日期2008年1月25日 优先权日2008年1月25日
发明者尤少方 申请人:上海伊思柏生物科技有限公司