专利名称：一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素的方法
技术领域：
一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素的方法，属于免疫分析化学技 术领域。
背景技术：
随着经济的发展，含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库，使
水体富营养化，致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素(Algae Toxins)，威 胁人类的饮用水安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins， MCs)的分布广、危害大更应引起重视。其是由某些种属的淡水蓝藻，主要是铜 绿微囊藻产生的一个结构相似的环七肽家族，已知有60余种异构体。其结构如 下<formula>formula see original document page 5</formula>
(6) D-Glu (iso) (7) dehydroAla
O COOH (2) variable
(3) D-八sp (iso)
其含有五个固定成分的氨基酸，两个可变的氨基酸X、 Y。其中X和Y分别为Leu 和Arg的最为常见，毒性也最大。基于此，世界卫生组织(WHO)推荐的饮水中的 藻毒素标准为1.0)ig/L，我国现颁布执行的生活饮用水水质卫生规范(2001， 0.001mg/L)和地表水环境质量标准(GB3838-2002，微囊藻毒素-LR， 0.001mg/L)。
故对藻毒素准确有效监测尤为重要。
常用的检测藻毒素的方法主要有仪器分析方法、生物化学法及免疫检测法 等几大类。仪器分析方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、质谱、液质联用等， 这些方法虽然灵敏但其需要昂贵的仪器设备，专业的操作人员，对检材的要求 也比较高，并且需要进一步的样本前处理才能进行，这已经不能达到现代检测 对快速、方便、准确的要求。生物化学法主要是蛋白磷酸酶抑制试验法，优点
是快速，数小时即可实现对大量样品的检测，但其最大的不足之处在于特异性 蛋白磷酸酶等没有商品供应、特异性差。免疫分析化学方法具有快速，灵敏度
高，操作简单，专一性好等优点。与传统的ELISA方法相比，本发明利用拧檬酸
三钠还原合成的金纳米粒子分别与微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗体 相连，在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应形成二聚体， 寡聚体及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布来测定微囊藻 毒素的含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反 应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素的方法， 灵敏度高，操作方便，线性范围宽。
本发明的技术方案 一种运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，用合成 的金纳米粒子与微囊藻毒素的包被原偶联得金连包被原，金纳米粒子与抗微囊 藻毒素的抗体相连得金连抗体，用抗体和包被原的金纳米粒子进行免疫反应， 利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应 形成二聚体，寡聚体及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布 来测定微囊藻毒素的含量；包括免疫原，包被原，抗体的制备，纳米金的制备，抗
体和纳米金的偶联，包被原和纳米金的偶联，包被原和抗体蛋白浓度的选择，抑 制曲线的测定。
工艺步骤为
(1) 免疫原的制备
将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；
(2) 包被原的制备
将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；
(3) 用步骤(l)得到的免疫原免疫得到特异性兔多克隆抗体；
(4) 金纳米粒子的制备
(5) 将步骤(2)得到的包被原与步骤(4)得到金纳米粒子偶联；
(6) 将步骤(3)得到的抗体与步骤(4)得到金纳米粒子偶联；
(7) 对步骤(2)得到的包被原和步骤(3)得到的抗体蛋白浓度的选择；
(8) 利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素-LR和金连包被原同时加入 到一个离心管中，而后向离心管中加入金连抗体，混匀，通过微囊藻毒素和包 被原与抗体进行竞争偶联，通过微囊藻毒素浓度的不同会使形成的粒子形成不 同的粒径分布，通过纳米粒度仪检测粒径的变化从而检测微囊藻毒素-LR。
所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其免疫原的制备
① 取0.25mL溶解有MC-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水，加入 150pL的碳二亚胺，得A液；
② 用lmL 25%的乙醇溶液溶解2mg的BSA，得B液；
③ 将A液逐滴加入到B液中，再加入150(iL的EDC，混匀，4。C反应12h。 其包被原的制备
① 取O.lmg MC-LR溶于O.lmL的N,N-二甲基甲酰胺DMF中，冷却至4 。C，加入4.8iiL的三丁胺，混匀；
② 向上述溶液中加入氯甲酸异丁酯2.7pL，混匀，4'C搅拌反应20min,得 到A液；
③ 取卵清蛋白OVA0.5mg溶于900jiLpHN9.0、50mmol/L的硼酸盐缓冲液 中冷却至4"C，混匀得B液；
将A液缓慢滴加至B液中，在4。C反应4h维持pH值在9.0; ⑤用pH值7.4的磷酸盐缓冲液透析三天。
其金纳米粒子的合成所有的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备 用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01%的氯金酸溶液， 加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜 色从淡黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降；最后，溶液 冷却至室温，稀释到100mL， 4X:保藏。
其包被原和纳米金的偶联取13.4pL的蛋白浓度为3mg/mL的包被原在磁力 搅拌器轻轻搅拌的情况下逐滴加入到4mL权利要求4所述制备得到的金纳米溶液 中，后在37"反应30min，再加入80iaL 10。/。的BSA溶液，37""C反应30min， 10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀用碳酸钾调节pH为9.0的水溶液分散后用 10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀，重复两次，放入4。C的冰箱中备用。
其抗体和纳米金的偶联取12jiL的蛋白浓度为3 mg/mL的抗体在磁力搅拌 器轻轻搅拌的情况下逐滴加入到4mL权利要求4所述制备得到的金纳米溶液中， 后在37。C反应30min，再加入80iiL 10%的BSA溶液，37。C反应30min， 10000r/min 离心25min，弃上清，取沉淀用碳酸钾调节pH为9.0的水溶液分散后用 10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀，重复两次，放入4匸的冰箱中备用。
其包被原和抗体蛋白浓度的选择为了提高该法的灵敏度，故需要对金偶 联的抗体和包被原的浓度需要进行选择。最适宜的包被原和抗体蛋白的浓度是 在二者混合反应以后，稀释到适于动态光散射仪测定的浓度下测定后二者的粒 径分布峰最大的浓度配比。具体的步骤是①分别向离心管中加入50^iL的金连包被原后，再按照1:1、 3:1、 5:1、 1:3、 1:5、 1:8的比例分别加入50、 16.7、 10、 150、 250pL的金连抗体后，混匀，37 。C反应1小时；
②反应结束，取80^iL的反应液加入80(^L的用碳酸钾调节至pH9.0的水 溶液稀释，混匀，静置2分钟，用DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。
其抑制曲线的测定抑制曲线的建立是通过添加一系列的不同梯度的标准品 后标准品和包被原互相竞争抗体的结合部位，会导致不同金纳米粒子形成不同 的聚合体。通过测定金纳米粒子的粒径以建立抑制曲线，具体的步骤为
① 分别向离心管中加入50pL的金连包被原后，各离心管分别加入用PBST 稀释的l吗/mL、 100ng/mL、 10ng/mL、 lng/mL、 0.1ng/mL、 O.Olng/mL的微囊 藻毒素后混匀，按照与金连包被原的蛋白浓度与金连抗体的蛋白浓度比例为1:1 加入金连抗体混匀，放入37"C反应1小时；
② 反应结束，取80iaL的反应液加入800nL的用碳酸钾调节至pH9.0的水溶液 稀释，混匀，静置2分钟，用DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。
本发明的有益效果与传统的ELISA方法相比，本发明利用柠檬酸三钠还 原合成的金纳米粒子分别与微囊藻毒素的包被原和抗微囊藻毒素的抗体相连， 在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应形成二聚体，寡聚体 及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布来测定微囊藻毒素的 含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简 化了反应的条件，提高了检测的灵敏度。
图1包被原的紫外扫描图。
图2动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素结果。
具体实施例方式
实施例1
(1) 免疫原的制备
① 取0.25mL溶解有微囊藻毒素-LR(MC-LR)的乙醇溶液，加入0.75mL去 离子水，加入150nL的碳二亚胺(EDC)，得A液。
② 用lmL25。/。的乙醇溶液溶解2mg的牛血清蛋白(BSA)，得B液。
③ 将A液逐滴加入到B液中，再加入150(iL的碳二亚胺(EDC)，混匀，4。C反 应12h。
(2) 包被原的制备
①取O.lmgMC-LR的溶于O.lmL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，冷却至
4°C，加入4.8pL的三丁胺，混匀。
② 向上述溶液中加入氯甲酸异丁酯2.7^iL，混匀，4'C搅拌反应20min，得 到A液。
③ 取卵清蛋白(OVA)0.5mg溶于900pLpH=9.0、 50mmol/L的硼酸盐缓冲液 中冷却至4"C，混匀得B液。
④ 将A液缓慢滴加至B液中，在4'C反应4h维持pH值在9.0。
⑤ 用pH值7.4的磷酸盐缓冲液透析三天。
(3) 免疫原免疫得到特异性兔多克隆抗体。
(4) 抗体效价的测定
采用间接ELISA方法测定抗体效价，以吸光值达到1.0左右时判断为阳性， 结果最后抗体的效价为1.28X106。
(5) 金纳米粒子的合成
所有的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用。制备时，向洁净的 三角烧瓶中加入100mL浓度为0.01。/。的氯金酸，加热，煮沸，紧接着加入2.5mL 1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡黄色变成红色，反应持续 6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降。最后，溶液分别冷却至室温，稀释到100mL， 4。C保藏。
(6) 包被原和纳米金的偶联
取13.4^的包被原(蛋白浓度3mg/mL)在磁力搅拌器轻轻搅拌的情况下 逐滴加入到4mL上述处理过的金纳米溶液中，后在37'C反应30min后用10%的 BSA溶液加入80pL后37。C反应30min后10000r/min离心25min弃上清取沉淀 用(碳酸钾调节pH为9.0)水溶液分散后用10000r/min离心25min，弃上清取 沉淀，重复两次放入4'C的冰箱中备用。
(7) 抗体和纳米金的偶联
取12pL的抗体(蛋白浓度3mg/mL)在磁力搅拌器轻轻搅拌的情况下逐滴加 入到4mL上述处理过的金纳米溶液中，后在37。C反应30min后用10。/。的BSA溶液 加入80(iL后37。C反应30min后10000r/min离心25min弃上清取沉淀用碳酸钾调节 pH为9.0的水溶液分散后用10000r/min离心25min，弃上清取沉淀，重复两次放入 4"C的冰箱中备用。
(8) 包被原和抗体蛋白浓度的选择
为了提高该法的灵敏度，故需要对金偶联的抗体和包被原的浓度需要进行 选择。最适宜的包被原和抗体蛋白的浓度是在二者混合反应以后，稀释到适于 动态光散射仪测定的浓度下测定后二者的粒径分布峰最大的浓度配比。具体的
步骤是
①分别向离心管中加入50nL的金连包被原后，再按照1:1、 3:1、 5:1、 1:3、 1:5、 1:8的比例分别加入50、 16.7、 10、 150、 250pL的金连抗体后，混匀，放 入37'C反应1小时。
②反应结束，取80)iL的反应液加入800iiL的pH9.0用碳酸钾调节的水溶 液稀释，混匀。静置2分钟，用DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。
(9)抑制曲线的测定
抑制曲线的建立是通过添加一系列的不同梯度的标准品后标准品和包被原 互相竞争抗体的结合部位，会导致不同金纳米粒子形成不同的聚合体。通过测 定金纳米粒子的粒径以建立抑制曲线，具体的步骤为
① 分别向离心管中加入50pL的金连包被原后，各离心管分别加入用PBST 稀释的1)ig/mL、 100ng/mL、 10ng/mL、 lng/mL、 0.1ng/mL、 O.Olng/mL的微囊 藻毒素后混匀，按照与金连包被原的蛋白浓度与金连抗体的蛋白浓度比例为1:1 加入金连抗体混匀，放入37'C反应1小时。
② 反应结束，取80pL的反应液加入800|iL的pH 9.0用碳酸钾调节的水溶 液稀释，混匀。静置2分钟，用DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。
权利要求
1. 一种运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是用合成的金纳米粒子与微囊藻毒素的包被原偶联得金连包被原，金纳米粒子与抗微囊藻毒素的抗体相连得金连抗体，用抗体和包被原的金纳米粒子进行免疫反应，利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应形成二聚体，寡聚体及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布来测定微囊藻毒素的含量；包括免疫原、包被原、抗体的制备，纳米金的制备，抗体和纳米金的偶联，包被原和纳米金的偶联，包被原和抗体蛋白浓度的选择，抑制曲线的测定；(1)免疫原的制备将微囊藻毒素-LR与牛血清蛋白相偶联得到免疫原；(2)包被原的制备将微囊藻毒素-LR与卵清蛋白相偶联得到包被原；(3)用步骤(1)得到的免疫原免疫得到特异性兔多克隆抗体；(4)金纳米粒子的制备；(5)将步骤(2)得到的包被原与步骤(4)得到的金纳米粒子偶联；(6)将步骤(3)得到的抗体与步骤(4)得到的金纳米粒子偶联；(7)对步骤(2)得到的包被原和步骤(3)得到的抗体蛋白浓度的选择；(8)利用间接竞争免疫检测原理，将微囊藻毒素-LR和金连包被原同时加入到一个离心管中，而后向离心管中加入金连抗体，混匀，通过微囊藻毒素和包被原与抗体进行竞争偶联，通过微囊藻毒素浓度的不同会使形成的粒子形成不同的粒径分布，通过纳米粒度仪检测粒径的变化从而检测微囊藻毒素-LR。
2. 根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是免疫原的制备① 取0.25mL溶解有MC-LR的乙醇溶液，加入0.75mL去离子水，加入 150pL的碳二亚胺，得A液；② 用lmL25。/。的乙醇溶液溶解2mg的BSA，得B液；③ 将A液逐滴加入到B液中，再加入150(iL的碳二亚胺，混匀，4。C反应12h。
3. 根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是 包被原的制备①取O.lmg MC-LR溶于O.lmL的N，N-二甲基甲酰胺DMF中，冷却至4 °C，加入4.8(iL的三丁胺，混匀； ② 向上述溶液中加入氯甲酸异丁酯2.7pL，混匀，4'C搅拌反应20min，得到A液；③ 取卵清蛋白OVA 0.5mg溶于900|iL pH=9.0、 50 mmol/L的硼酸盐缓冲液 中冷却至4r，混匀得B液；④ 将A液缓慢滴加至B液中，在4T:反应4h维持pH值在9.0; 用pH值7.4的磷酸盐缓冲液透析三天。
4. 根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是 金纳米粒子的合成所有的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，晾干备用；制 备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01%的氯金酸溶液，加热， 煮沸，紧接着加入2.5mL 1%的柠檬酸三钠溶液，边加热边搅拌，溶液颜色从淡 黄色变成红色，反应持续6-8分钟以使柠檬酸三钠完全沉降；最后，溶液冷却至 室温，稀释至Ul00mL， 4"C保藏。
5. 根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是 包被原和纳米金的偶联取13.4pL的蛋白浓度为3 mg/mL的包被原在磁力搅拌器 轻轻搅拌的情况下逐滴加入到4mL权利要求4所述制备得到的金纳米溶液中，后 在37。C反应30min，再加入80pL 10。/。的BSA溶液，37。C反应30min， 10000r/min 离心25min，弃上清，取沉淀用碳酸钾调节pH为9.0的水溶液分散后用10000r/min 离心25min，弃上清，取沉淀，重复两次，放入4。C的冰箱中备用。
6. 根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征是 抗体和纳米金的偶联取12pL的蛋白浓度为3 mg/mL的抗体在磁力搅拌器轻轻 搅拌的情况下逐滴加入到4mL权利要求4所述制备得到的金纳米溶液中，后在 37。C反应30min，再加入80jjL 10。/。的bsa溶液，37。C反应30min， 10000r/min 离心25min，弃上清，取沉淀用碳酸钾调节pH为9.0的水溶液分散后用 10000r/min离心25min，弃上清，取沉淀，重复两次，放入4。C的冰箱中备用。
7. 根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征 是包被原和抗体蛋白浓度的选择为了提高该法的灵敏度，故需要对金偶联的 抗体和包被原的浓度需要进行选择；最适宜的包被原和抗体蛋白的浓度是在二 者混合反应以后，稀释到适于动态光散射仪测定的浓度下测定后二者的粒径分 布峰最大的浓度配比；步骤是①分别向离心管中加入50^iL的金连包被原后，再按照1:1、 3:1、 5:1、 1:3、 1:5、 1:8的比例分别加入50、 16.7、 10、 150、 250(iL的金连抗体后，混匀，37 。C反应1小时；②反应结束，取80pL的反应液加入800^L的用碳酸钾调节至pH 9.0的水 溶液稀释，混匀，静置2分钟，用DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。 8.根据权利要求1所述的运用动态光散射检测微囊藻毒素的方法，其特征 是抑制曲线的测定抑制曲线的建立是通过添加一系列的不同梯度的标准品后 标准品和包被原互相竞争抗体的结合部位，会导致不同金纳米粒子形成不同的 聚合体；通过测定金纳米粒子的粒径以建立抑制曲线，步骤为① 分别向离心管中加入50pL的金连包被原后，各离心管分别加入用PBST 稀释的l|ig/mL、 100ng/mL、 10ng/mL、 lng/mL、 0.1ng/mL、 O.Olng/mL的微囊 藻毒素后混匀，按照与金连包被原的蛋白浓度与金连抗体的蛋白浓度比例为1:1 加入金连抗体混匀，放入37"C反应1小时；② 反应结束，取80nL的反应液加入800^iL的用碳酸钾调节至pH9.0的水溶液 稀释，混匀，静置2分钟，用DLS测定该反应液的粒子的粒径，重复两次。
全文摘要
一种运用动态光散射高灵敏检测微囊藻毒素-LR的方法，属于免疫分析化学技术领域。本发明合成的金纳米粒子与微囊藻毒素的包被原偶联得金连包被原，金纳米粒子与抗微囊藻毒素的抗体相连得金连抗体，用抗体和包被原的金纳米粒子进行免疫反应，利用柠檬酸三钠还原在液体的环境下金连抗体和金连包被原及微囊藻毒素反应形成二聚体，寡聚体及产生聚沉，通过动态光散射测定液体环境中的粒径分布来测定微囊藻毒素的含量。本发明只在液体环境中反应，不需要清洗的步骤，只需要一步反应，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，达到国际领先水平。
文档编号G01N21/47GK101393209SQ200810155548
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者徐丽广, 李灼坤, 胥传来, 伟 马 申请人:江南大学