一种光纤生物传感器探头及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：一种光纤生物传感器探头及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种光纤生物传感器探头及其制备方法，以及一种包含该光纤生物传感器探头的检测系统及其应用。
背景技术：
：免疫学分析方法的发展已有50多年的历史，继50年代的免疫荧光(IFA)和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，用酶来标记抗原或抗体的分析技术在70年代初期就已建立了起来。由于酶的高效生物催化作用，一个酶分子在数分钟内可以催化几十甚至几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，ELISA)，该方法自70年代初期由VANWEEMEN、SCHUARSENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视和使用。ELISA法作为免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行病学调查。ELISA法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。近些年来，生物传感器是一个非常活跃的研究领域，它与生物信息学、生物芯片、生物控制论、仿生学、生物计算机等学科一起，处在生命科学和信息科学的交叉区域。生物传感器是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是物质分子水平的快速、微量分析方法。它们的共同特征是探索和揭示出生命系统中信息的产生、存储、传输、加工、转换和控制等基本规律，探讨应用于人类经济活动的基本方法。光纤生物传感器(opticfiberbiosensor)是一种以光纤传导和收集光信号进行生物(抗原、抗体、酶、核酸、细胞等)检测的仪器。它通过检测生物反应所产生的光，包括光的强度、振幅、相位等参数确定被检物质的量。夹层光纤传感器的工作原理类似ELISA反应中的免疫夹心法。具体检测过程是将末端固定有抗体的光纤浸入待测溶液中，检测是否有能与之特异性结合的抗原；若待测溶液中含有抗原，就会与光纤末端的抗体特异性结合；再将结合了抗原的光纤浸入含有被酶标记的另一特异性抗体溶液中，酶标的抗体会与抗原特异性结合；最后把光纤端部浸在一个盛有化学发光底物或者荧光底物溶液的容器中，待测溶液中的抗原浓度越高，就有相应多的酶标记的抗体与其结合，光信号也就越强。光纤生物传感器生物敏感材料(如抗原、抗体等)的固定对于传感器检测的灵敏度、稳定性等起着至关重要的作用。目前用于光纤表面生物敏感材料固定的方法多种多样，主要有①通过三氨基丙基三乙基硅烷等硅烷类物质将光纤表面硅烷化，然后借助双功能交联剂戊二醛等，将抗原、抗体等敏感生物材料共价结合到光纤表面。②通过亲和素生物素系统放大作用固定。亲和素具有4个结合位点，可以和生物素特异性结合并起到放大作用，并且生物素亲和素系统不会影响到生物敏感材料的活性，可以有效地提高传感器的灵敏度。③溶胶凝胶法。应用硅酸盐、琼脂等形成的凝胶网格结构，可以将活的生物细胞固定在光纤表面，也能较长时间地保存细胞的活力。其它方法还包括吸附法，运用脂质双层膜等固定方法。现有的固定方法都存在一些不足或缺陷，还需要寻找更好的修饰方法，运用更佳的材料，进一步提高光纤生物传感器的性能。
发明内容本发明的目的是提供一种光纤生物传感器探头及其制备方法。本发明的另一目的是提供一种包含上述光纤生物传感器探头的检测系统及其在体外定量检测生物分子中的应用。为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种光纤生物传感器探头，其特征在于，它是由光纤、共价连接在所述光纤的一个端面上的第一葡聚糖高分子、与所述第一葡聚糖高分子共价连接的第二葡聚糖高分子、和与所述第二葡聚糖高分子共价连接的生物分子组成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范围内，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能与被检测分子特异性结合。—个优选的实施方案中，所述光纤是石英光纤。在另一个优选的实施方案中，所述生物分子选自抗原或者抗体。在一个较佳的实施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量选自1000001000000(即葡聚糖T-100T-1000)，所述第二葡聚糖高分子的分子量选自10000IOOOOO(即葡聚糖T-10T-100)。在一个更佳的实施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量为500000(即葡聚糖T-500)，所述第二葡聚糖高分子的分子量为40000(即葡聚糖T-40)。本发明第二方面提供了一种制备上述光纤生物传感器探头的方法，该方法的步骤如下a)将第一葡聚糖高分子与光纤的一个端面共价连接；b)将第二葡聚糖高分子与步骤a)中的共价连接到光纤端面上的第一葡聚糖高分子共价连接；c)将生物分子与步骤b)中的共价连接到第一葡聚糖高分子上的第二葡聚糖高分子共价连接；其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范围内，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能与被检测分子特异性结合。在一个优选的实施方案中，该方法的步骤如下a)对光纤的一个端面进行羟基化处理，所述光纤优选石英光纤；b)将步骤a)得到的光纤端面上的羟基(优选硅羟基)通过Y-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(GOPS)改性，与第一葡聚糖高分子共价连接(该第一葡聚糖高分子优选葡聚糖T-500);c)将步骤b)得到的光纤端面第一葡聚糖高分子上的醇羟基通过环氧氯丙烷(表氯醇)改性，与第二葡聚糖高分子共价连接(该第二葡聚糖高分子优选葡聚糖T-40);d)将步骤c)得到的光纤端面第二葡聚糖高分子上的醇羟基通过改性，与生物分子共价连接。本发明第三方面提供了一种光纤生物传感器检测系统，它包括至少一个上述光纤生物传感器探头、暗盒、以及光信号接收与处理装置，其中，所述光纤生物传感器探头固定有生物分子的一端与暗盒连接，另一端与光信号接收与处理装置连接。在一个优选的实施方案中，所述暗盒包含位置调节装置，其上设有试剂池。在一个更优选的实施方案中，所述试剂池包括待测样品池、酶标分子池、底物池、以及洗涤池。本发明第四方面涉及所述光纤生物传感器检测系统在体外定量检测中的应用。在一个实施方案中，通过本发明所述光纤生物传感器检测系统可以定量检测待测样品(如血清或血浆)中的被检测分子(如抗原或者抗体)。本发明光纤生物传感器探头使用了两层葡聚糖高分子修饰共价固定光纤端面的生物分子(例如抗原或者抗体)，其优点在于①检测灵敏度高；②葡聚糖保水性好，使得结合上去的生物分子(如抗体)不易失活变性；③经过两层葡聚糖高分子修饰的光纤端面亲水性好，可降低蛋白吸附，降低了检测背景值。图1显示了光纤生物传感器探头端面示意图。其中，DextranT-500代表第一葡聚糖高分子，DextranT-40代表第二葡聚糖高分子，Ab代表生物分子(抗体)。图2显示了光纤生物传感器检测系统示意图。其中，1为光纤，2为固定有生物分子(抗体)的光纤端面，3为光信号接收与处理装置，4为暗盒，5为位置调节装置，6为待测样品池，7、9为洗涤池，8为酶标分子池，10为底物池。图3显示了SCCA1抗原检测标准工作曲线(实施例2)。图4显示了SCCA1抗原检测标准工作曲线(实施例3)。图5显示了SCCA1抗原检测标准曲线(实施例4，ELISA双抗体夹心法)。具体实施方案具体而言，本发明提供了一种光纤生物传感器探头，它是由光纤、共价连接在所述光纤的一个端面上的第一葡聚糖高分子、与所述第一葡聚糖高分子共价连接的第二葡聚糖高分子、和与所述第二葡聚糖高分子共价连接的生物分子组成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范围内，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能与被检测分子特异性结合。术语"光纤"也可称之为"光导纤维"，是一种利用光在石英或塑料制成的纤维中的全反射原理而达成的光传导工具。所述光纤可以是单模光纤(纤芯直径812iim)，也可以是多模光纤(纤芯直径5062.5iim);可以是单芯光纤，也可以是多芯光纤(例如4芯、6芯、8芯、10芯、12芯或14芯等)。在一个优选的实施方案中，本发明所述光纤为石英光纤，更优选是多模石英光纤。在另一优选的实施方案中，所述光纤的一端或两端抛光。本发明所述葡聚糖高分子可以直接通过市售获得，常见的葡聚糖规格(种类)包括但不限于，葡聚糖T-3(DextranT_3，分子量3000)、葡聚糖T_5(DextranT-5，分子量5000)、葡聚糖T-10(DextranT_10，分子量10000)、葡聚糖T_20(DextranT_20，分子量20000)、葡聚糖T-40(DextranT_40，分子量40000)、葡聚糖T-70(DextranT-70，分子量70000)、葡聚糖T-100(DextranT-IOO，分子量100000)、葡聚糖T-110(DextranT-110，分子量110000)、葡聚糖T-200(DextranT_200，分子量200000)、葡聚糖T-500(DextranT_500，分子量500000)、葡聚糖T-700(DextranT_700，分子量700000)、葡聚糖T-1000(DextranT-IOOO，分子量1000000)葡聚糖T-2000(DextranT-2000，分子量2000000)等。适用于本发明的葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范围内，优选在100001000000(即葡聚糖T-10T-1000)范围内。本发明中的第一葡聚糖高分子(本文中也称为第一层葡聚糖高分子)的分子量应高于第二葡聚糖高分子(本文中也称为第二层葡聚糖高分子)的分子量。在一个优选的实施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量为所述第二葡聚糖高分子的分子量的2-20倍，更佳为5-15倍。在另一个优选的实施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量选自100000IOOOOOO(即葡聚糖T-100T-1000)，所述第二葡聚糖高分子的分子量选自10000100000(即葡聚糖T-10T-100)。在一个更优选的实施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量选自200000700000(即葡聚糖T-200T-700)，所述第二葡聚糖高分子的分子量选自2000070000(即葡聚糖T-20T-70)。在一个还要优选的实施方案中，所述第一葡聚糖高分子的分子量为500000(即葡聚糖T-500)，所述第二葡聚糖高分子的分子量为40000(即葡聚糖T-40)。本发明光纤生物传感器探头在光纤端面依次共价连接两层葡聚糖高分子，使得在单位面积共价连接的生物分子(优选抗原或者抗体)数量增加，传感器探头的灵敏度也相应提高；此外，葡聚糖保水性好，使得结合上去的生物分子(如抗体)不易失活变性；并且，由于经过两层葡聚糖高分子修饰的光纤端面亲水性好，可降低蛋白吸附，也降低了检测背景值。本发明另一方面提供了一种制备光纤生物传感器探头的方法，该方法的步骤如下a)将第一葡聚糖高分子与光纤的一个端面共价连接；b)将第二葡聚糖高分子与步骤a)中的共价连接到光纤端面上的第一葡聚糖高分子共价连接；c)将生物分子与步骤b)中的共价连接到第一葡聚糖高分子上的第二葡聚糖高分子共价连接；其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000(即葡聚糖T-3T-2000)范围内，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能与被检测分子特异性结合。具体而言，首先，对所述光纤(优选石英光纤)的一个端面进行羟基化处理，例如可以使用NaOH、HC1依次对光纤端面羟基化处理，或者也可以使用甲醇、甲醇与浓盐酸的混合溶液、^02与NH4OH的混合溶液依次对光纤端面羟基化处理。上述这些羟基化处理方法是本领域中熟知的，本领域技术人员能够根据具体情况选择合适的反应条件和试剂浓度来实现光纤端面的羟基化。本领域技术人员还可采用其他常规方法来对光纤的端面进行羟基化处理。在对光纤端面进行羟基化处理后，再将光纤端面上的羟基(优选硅羟基)通过诸如Y-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(GOPS)及其衍生物等硅烷偶联剂改性，共价连接第一葡聚糖高分子(优选葡聚糖T-500)，从而形成第一(层)葡聚糖高分子；然后，将光纤端面第一葡聚糖高分子上的醇羟基通过诸如表氯醇(环氧氯丙烷)、表溴醇等卤代环氧化合物改性，共价连接第二葡聚糖高分子(优选葡聚糖T-40)，从而形成第二(层)葡聚糖高分子；最后，将光纤端面第二葡聚糖高分子上的醇羟基通过改性(较佳的是通过丁二酸酐将醇羟基衍生化为羧基，羧基再衍生化为活性酯)，与生物分子(优选抗原或者抗体)共价连接。应当注意，上述步骤中实现共价连接的方式和试剂是本领域技术人员容易确定的。合适的偶联剂可以选自，包括但不局限于多元醇化合物，如乙二醇、二乙二醇、丙二醇、三乙二醇、四乙二醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、二丙二醇、2，2，4-三甲基-1，3-丙二醇、聚丙二醇、甘油等；聚环氧化合物，如乙二醇二縮水甘油醚、聚乙二醇二縮水甘油醚、甘油多縮水甘油醚、二甘油多縮水甘油醚、多甘油多縮水甘油醚、丙二醇二縮水甘油醚、聚丙二醇二縮水甘油醚和縮水甘油醚；聚胺化合物，如乙二胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、五亚乙基六胺和聚乙烯亚胺，及其无机或有机盐；聚异氰酸酯化合物，如2，4_甲苯二异氰酸酯和己二异氰酸酯；卤代环氧化合物，如表氯醇、表溴醇等；硅烷偶联剂，如Y-氨基丙基三甲氧基硅烷、Y-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷及其衍生物等。因此，本发明的保护范围不局限于本文实施例中所采用的共价连接试剂和方式。在本发明光纤生物传感器探头中，所述通过第一葡聚糖高分子和第二葡聚糖高分子的共价连接固定在光纤端面的生物分子应能与被检测分子特异性结合。根据被检测分子的不同，所述生物分子例如可以是抗体或者抗原。其中，所述抗原包括但不限于天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原等。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，须经提取纯化才能使用；重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母为质粒体；而合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。所述抗体一般应具有高亲和力和高特异性，一般优选单克隆抗体。在一个具体的实施方案中，本发明还提供了一种制备所述光纤生物传感器探头的方法，它的方法如下a)用甲醇、甲醇与浓盐酸的混合溶液、11202与NH4OH的混合溶液依次对光纤(优选石英光纤)的一个端面羟基化处理；b)将步骤a)得到的光纤端面上的羟基(优选硅羟基)通过Y-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷(GOPS)改性(即生成环氧基团)，共价连接葡聚糖T-500(即环氧基团与葡聚糖T-500上的醇羟基反应，共价连接)，形成第一(层)葡聚糖高分子；c)将步骤b)得到的光纤端面第一葡聚糖高分子上的醇羟基通过环氧氯丙烷(表氯醇)改性(即生成环氧基团)，共价连接葡聚糖T-40(即环氧基团与葡聚糖T-40上的醇7羟基反应，共价连接)，形成第二(层)葡聚糖高分子；d)将步骤c)得到的光纤端面第二葡聚糖高分子上的醇羟基通过改性，然后与生物分子(优选抗原或者抗体)共价连接。在一个优选的实施方案中，当步骤d)中的生物分子为抗原或者抗体时，所述步骤d)的具体实施方案为将步骤c)得到的光纤端面第二葡聚糖高分子上的醇羟基通过改性(较佳的是通过丁二酸酐将醇羟基衍生化为羧基，羧基再衍生化为活性酯)，生成的活性酯与抗原或者抗体上的氨基之间反应，共价连接。当然，为了进一步降低检测时的背景干扰，还可以使用乙醇胺封闭未连接的活性酯，并将未固定的抗原或者抗体冲洗干净。在本发明中，光纤端面经过了两层葡聚糖高分子(优选第一层使用葡聚糖T-500,第二层使用葡聚糖T-40)的修饰，使得其上共价连接的生物分子(抗原或者抗体)密度达1.0士0.03pmol/cm、则其检测灵敏度较高。而如果只使用一层葡聚糖高分子(优选葡聚糖T-500)修饰光纤端面，其上共价连接的生物分子(抗原或者抗体)密度只有0.35±0.02pmol/cm2。本发明还提供了一种光纤生物传感器检测系统，它包括至少一个上述光纤生物传感器探头、暗盒、以及光信号接收与处理装置，其中，所述光纤生物传感器探头固定有生物分子的一端与暗盒连接，另一端与光信号接收与处理装置连接。在本发明光纤生物传感器检测系统中，可以包括一个所述光纤生物传感器探头，也可以包括多个所述光纤生物传感器探头。当多个所述光纤生物传感器探头上固定不同的生物分子(针对不同被检测分子)，就可实现对于同一待测样品的多个检测指标(被检测分子)同时进行检测。在本发明光纤生物传感器检测系统中，所述光信号接收与处理装置是将光信号经光电转换器件转变为相应的电信号。在一个优选的实施方案中，所述暗盒包含位置调节装置，其上可设有多个试剂池。根据待测样品的具体种类、数量、检测指标(被检测分子)等，试剂池包括但不限于待测样品池、酶标分子池、底物池、洗涤池等。其中，待测样品池中含有待测样品(其中可能含有被检测分子，例如抗原或者抗体)，所述酶标分子池中含有酶标记的能与被检测分子特异性结合的生物分子(如抗体或者抗原)，所述底物池中含有酶的化学发光底物，所述洗涤池中含有洗涤液。用于本发明的酶应符合以下要求能够催化化学发光反应，纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，制备成酶标生物分子后仍继续保留它的活性部分和催化能力。优选的酶包括优选辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等。酶标记抗体或抗原的方法(酶标生物分子的制备方法)是本领域技术人员所熟知的，例如戊二醛交联法、过碘酸盐氧化法等。或者也可以通过市售直接获得酶标记抗体或抗原。本发明所述酶的化学发光底物是指在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，本领域技术人员也是熟知的。其中，氨基苯二酰肼类(主要是鲁米诺、异鲁米诺、及其衍生物)是最常用的一类化学发光底物。鲁米诺(luminol，5-氨基-2，3-二氢-l，4-酞嗪二酮)可用作过氧化物酶(例如HRP)的底物。在本发明的一个实施方案中，选用了HRP标记的SCCA1的单抗，酶的化学发光底物选用了H202与鲁米诺的混合物。此外，本发明所述洗涤液是本领域技术人员根据具体情况所能确定的，例如常用的ELISA洗涤液，优选的洗涤液为PBS-T缓冲液(即含0.05%(v/v)吐温20(Tween-20)磷酸缓冲盐水(PBS)，pH7.4)。设置在所述位置调节装置上的试剂池的种类、个数本领域技术人员可以根据实际待测样品的需要来确定。例如，如附图2所示，当只使用一个所述光纤生物传感器探头检测待测样品中的一种检测指标(被检测分子)时，在所述暗盒中的位置调节装置上可设有一个待测样品池6、一个酶标分子池8、一个底物池10、以及两个洗涤池7、9(或者也可只设置一个洗涤池，并在操作间隙更换洗涤液)。需要说明的是，本发明所述光纤生物传感器检测系统的工作原理可以类似ELISA反应中的多种类型，包括但不限于，双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等，优选夹心法、间接法或竞争法。所不同的是通过光信号接收与处理装置最终输出是电信号，再根据标准工作曲线(或者曲线方程)得到被检测分子的浓度。一般在本发明所述光纤生物传感器检测系统中有三个必需的试剂(l)固定在基质上的抗体或抗原，即通过两层葡聚糖高分子层共价连接在所述光纤端面的生物分子；(2)酶标记的抗体或抗原，即置于所述酶标分子池中的酶标生物分子；(3)酶反应的底物，即置于所述底物池中的酶的化学发光底物。本发明还涉及所述光纤生物传感器检测系统在体外定量检测中的应用。以上述双抗体夹心法测抗原为例，其具体的检测步骤为1)将所述光纤生物传感器探头固定有生物分子(如抗体)的一端浸入待测样品池中，使所述生物分子(如抗体)与待测样品中的被检测分子(如抗原)发生特异性结合反应(优选37°C，反应10分钟2小时)，拔出；2)将所述光纤生物传感器探头浸入洗涤池中清洗，拔出；3)将所述光纤生物传感器探头浸入酶标分子池中，使步骤1)结合上的被检测分子(如抗原)与酶标生物分子(如酶标记的另一特异性抗体)发生特异性结合反应，(优选37t:，反应10分钟2小时)拔出；4)将所述光纤生物传感器探头浸入另一洗涤池中清洗，拔出；5)将所述光纤生物传感器探头浸入底物池中，化学发光；6)光信号的接收与处理(通过光信号接收与处理装置)，输出电信号；7)根据输出的电信号、以及标准工作曲线(或者曲线方程)，得到被检测分子(如抗原)的浓度。其中，步骤7)的标准工作曲线(或者曲线方程)获得的方法如下首先确定所要输出的电信号(如电流等)；其次，将若干个已知不同浓度的标准样品分别放入待测样品池中，操作上述步骤l)—6)，得到与其对应的电信号(如电流等)；最后在二维坐标系中建立标准工作曲线(或者曲线方程)。当然，根据需要可以将多个固定有不同生物分子(优选抗原或者抗体)的所述光纤生物传感器探头集成在一起，就可实现对于同一待测样品的多个检测指标(被检测分子)同时进行检测。本领域技术人员能够理解，本发明上述的各实施方案、优选实施方案以及更优选的实施方案可以以任意方式组合，所有这些组合后构成的技术方案均属于本发明明确记载的内容。下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。实施例1光纤生物传感器探头的制备(—)两层葡聚糖高分子修饰的光纤生物传感器。a)光纤端面羟基化处理。先将光纤(PCS石英光纤，购自南京飞帝斯光纤机械电子工程制作中心)端面在甲醇中浸泡30分钟，然后将其置于甲醇与浓盐酸的混合溶液中，IO(TC处理25小时；然后再将光纤端面置于H202与NH40H的混合溶液中，8(TC处理28小时；将处理过的光纤端面用蒸馏水多次洗涤，并用氮气吹干。b)光纤端面上的硅羟基通过G0PS改性，共价连接葡聚糖T-500，形成第一层葡聚糖高分子。将干燥的光纤端面置于10%(v/v)GOPS的丙酮溶液中，室温反应过夜，反应结束后采用丙酮浸泡洗涤，并干燥；将上述处理过的光纤端面再置于0.3%(w/v)的T-500溶液中，反应812小时；反应结束后将光纤用0.1MNaOH多次洗涤，然后采用去离子水洗涤，并干燥。c)光纤端面第一层葡聚糖高分子上的醇羟基通过环氧氯丙烷改性，共价连接葡聚糖T-40，形成第二层葡聚糖高分子。将形成第一层葡聚糖高分子的光纤端面置于10%(v/v)环氧氯丙烷的NaOH溶液(2M)中，反应期间另添加50%(v/v)环氧氯丙烷的NaOH溶液(2M)，反应816小时，反应结束后先使用乙醇洗涤，再用去离子水洗涤，并干燥；将上述处理过的光纤端面再置于0.3%(w/v)的T-40中反应1218小时；反应结束将光纤用0.1MNaOH多次洗涤，然后采用去离子水洗涤，并干燥。d)光纤端面第二层葡聚糖高分子上的醇羟基通过改性与抗体共价连接。将形成第二层葡聚糖高分子的光纤端面与丁二酸酐在室温下反应1836小时，反应结束多次用丙酮、水洗涤；然后置于10mg/ml1_(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC*HCl)，5mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS(50mM，pH7.4)溶液中，室温反应30分钟，反应结束用PBS快速洗涤；再置于30iig/ml的SCCA1(鳞状细胞癌抗原)的单克隆抗体(scc01，B080811购自中资汉脉(北京)生物技术有限公司)中，4t:反应3小时；将上述固定有抗体(scc01)的光纤端面用乙醇胺封闭45分钟，再用PBS-T洗涤2次，每次10分钟。(二)一层葡聚糖高分子修饰的光纤生物传感器。a)光纤端面羟基化处理。先将光纤(PCS石英光纤，购自南京飞帝斯光纤机械电子工程制作中心)端面在甲醇中浸泡30分钟，然后将其置于甲醇与浓盐酸的混合溶液中，IO(TC处理25小时；然后再将光纤端面置于H202与NH40H的混合溶液中，8(TC处理28小时；将处理过的光纤端面用蒸馏水多次洗涤，并用氮气吹干。b)光纤端面上的硅羟基通过GOPS改性，共价连接葡聚糖T-500，形成一层葡聚糖高分子。将干燥的光纤端面置于10%(v/v)G0PS的丙酮溶液中，室温反应过夜，反应结束后采用丙酮浸泡洗涤，并干燥；将上述处理过的光纤端面再置于0.3%(w/v)的T-500溶液中，反应812小时；反应结束将光纤用0.1MNaOH多次洗涤，然后采用去离子水洗涤，并干燥。c)光纤端面葡聚糖高分子上的醇羟基通过改性与抗体共价连接。将形成一层葡聚糖高分子的光纤端面与丁二酸酐在室温下反应1836小时，反应结束多次用丙酮、水洗涤；然后置于10mg/ml1_(3-二甲基氨基丙基)_3_乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDC*HCl)，5mg/mlN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS(50mM，pH7.4)溶液中，室温反应30分钟，反应结束用PBS快速洗涤；再置于30iig/ml的SCCA1(鳞状细胞癌抗原)的单克隆抗体(scc01，B080811购自中资汉脉(北京)生物技术有限公司)中，fC反应3小时；将上述固定有抗体(scc01)的光纤端面用乙醇胺封闭45分钟，再用PBS-T洗涤2次，每次10分钟。实施例2检测样品中SCCA1(鳞状细胞癌抗原)的浓度(使用实施例1(一)中制得的光纤生物传感器探头检测)(1)待测样品电流信号的测定。将实施例1(一)中制得的光纤生物传感器探头装入如图2所示的光纤生物传感器检测系统中，该光纤生物传感器探头首先浸入待测样品池中(待测样品池中含有待测样品l)，37°C，10min;清洗池中清洗后，再浸入酶标分子池中(酶标分子池中含有1:8000稀释的HRP标记的SCCA1的另一个单抗，scc02，B080812购自中资汉脉(北京)生物技术有限公司)，37°C，10min;清洗池中清洗后，最后浸入底物池中(底物池中含有HRP的化学发光底物，SuperSignalELISAPicoChemiluminescentSubstrate37070，购自PIERCE公司)，化学发光，经过光信号接收与处理装置(光电转换器PC008)，输出电信号(电流值)。重复以上步骤，检测待测样品2，同样输出一个与其对应的电信号(电流值)。(2)标准工作曲线(方程)的建立。将实施例1(一)中制得的光纤生物传感器探头分别浸入含有不同浓度SCCA1抗原标准品(sccAg，A080626购自中资汉脉(北京)生物技术有限公司)的待测样品池中，重复(1)的步骤，得到一组电流信号值。实验结果如表1所示表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>样品<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>标准工作曲线如图3所示，曲线方程为y=0.0059x2+0.8305x_0.3472(R2=0.9998)，其中，y代表SCCAl抗原浓度(纳克/毫升)，x代表电流值(XIO—1QA)。经检测，待测样品l输出的电流值为4.2X10—"A，待测样品2输出的电流值为14.0X10—"A，则根据标准工作曲线方程得到待测样品1中SCCA1抗原浓度为3.2纳克/毫升，待测样品2中SCCA1抗原浓度为12.4纳克/毫升。实施例3检测样品中SCCA1(鳞状细胞癌抗原)的浓度[ono](使用实施例1(二)中制得的光纤生物传感器探头检测)将实施例l(二)中制得的光纤生物传感器探头装入如图2所示的光纤生物传感器检测系统中，按照实施例2(2)的方法建立标准工作曲线(方程)，并检测相同的两个待测样品(待测样品1、待测样品2)。实验结果如表2所示表2样<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>标准工作曲线如图4所示，曲线方程为y=0.0269x2+3.9789x+3.0187(R2=0.9973)，其中，y代表SCCA1抗原浓度(纳克/毫升)，x代表电流值(X10—1QA)。经检测，待测样品1输出的电流值为0.4X10—1QA，待测样品2输出的电流值为2.3X10—1QA，则根据标准工作曲线方程得到待测样品1中SCCA1抗原浓度为4.6纳克/毫升，待测样品2中SCCA1抗原浓度为12.3纳克/毫升。从检测得到的数据及标准工作曲线分析，标准品5ng/ml时的电流输出值仅为0.5X10—、，与空白对照(背景)电流输出值0.3X10—"A区别很小，而待测样品1的电流输出值为0.4X10—"A，根据标准工作曲线方程计算出的浓度值极有可能不准确。实施例4使用ELISA法(双抗体夹心)检测样品中SCCA1的浓度1.包被用包被液(pH9.6的50mM碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液)将单抗scc01(B080811购自中资汉脉(北京)生物技术有限公司)稀释成0.5yg/ml，100y1/孔加至酶标板，4t:过夜。2.从4°C中取出包被好的酶标板，室温平衡15分钟。用pH7.4的PBS-0.05%(v/v)Tween20(PBS-T)洗涤液洗酶标板3次，200y1/次。3.封闭用PBS-T溶解的3%(w/v)BSA，每孔200iil，37t:温育2小时。4.用PBS-T洗涤液洗板3次，200y1/次，拍干。5.加入不同浓度SCCA1抗原标准品(sccAg，A080626购自中资汉脉(北京)生物技术有限公司)以及待测样品1、待测样品2，100iU/孔，均做复孔，37t:温育1小时。6.用PBS-T洗涤液洗板3次，200y1/次，拍干。7.加入l:8000稀释的HRP标记的二抗scc02(B080812购自中资汉脉(北京)生物技术有限公司)，100iU/孔，37。C温育1小时。8.用PBS-T洗涤液洗板3次，200y1/次，拍干。9.加底物TMB:A液+B液(体积比1:1)，即用即配，100y1/孔，37。C温育23分钟。10.终止加2M的硫酸，100ii1/孔。11.终止反应后，应在5分钟内用酶标仪测定各孔在波长450nm处的吸收值(0D450nm)。具体数据见表3，标准曲线如图5所示。曲线方程为y=14.368x2-0.2516x+0.1336(R2=0.9981)，其中，y代表SCCA1抗原浓度(纳克/毫升)，x代表0045。值。经检测，待测样品1平均0D45。值为0.4750，待测样品2平均0045。值为0.9335，则根据曲线方程得到待测样品1中SCCA1抗原浓度为3.256纳克/毫升，待测样品2中SCCA1抗原浓度为12.419纳克/毫升。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果分析与讨论本发明使用了三种方法检测两个待测样品(待测样品1、待测样品2)，其结果汇总见表4。从该结果可知，使用实施例l(一)中制得的光纤生物传感器探头检测的结果与ELISA双抗体夹心法的检测结果一致；而使用实施例1(二)中制得的光纤生物传感器探头检测待测样品1的结果严重偏离ELISA双抗体夹心法的检测结果，这可能是由于待测样品1的实际浓度低于实施例l(二)中制得的光纤生物传感器探头的最低检测浓度。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>从以上结果分析可以看出，实施例l(一)中制得的光纤生物传感器探头的检测灵敏度高，结果准确可靠，操作方便快速。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。权利要求一种光纤生物传感器探头，其特征在于，它是由光纤、共价连接在所述光纤的一个端面上的第一葡聚糖高分子、与所述第一葡聚糖高分子共价连接的第二葡聚糖高分子、和与所述第二葡聚糖高分子共价连接的生物分子组成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在3000～2000000范围内，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能与被检测分子特异性结合。2.根据权利要求1所述的光纤生物传感器探头，其特征在于，所述生物分子选自抗原或者抗体。3.根据权利要求1所述的光纤生物传感器探头，其特征在于，所述光纤是石英光纤。4.根据权利要求1所述的光纤生物传感器探头，其特征在于，所述第一葡聚糖高分子的分子量选自1000001000000，所述第二葡聚糖高分子的分子量选自10000100000。5.根据权利要求4所述的光纤生物传感器探头，其特征在于，所述第一葡聚糖高分子的分子量为500000，所述第二葡聚糖高分子的分子量为40000。6.—种制备权利要求1所述光纤生物传感器探头的方法，其特征在于，该方法的步骤如下a)将第一葡聚糖高分子与光纤的一个端面共价连接；b)将第二葡聚糖高分子与步骤a)中的共价连接到光纤端面上的第一葡聚糖高分子共价连接；c)将生物分子与步骤b)中的共价连接到第一葡聚糖高分子上的第二葡聚糖高分子共价连接；其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在30002000000范围内，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能与被检测分子特异性结合。7.根据权利要求6所述的制备光纤生物传感器探头的方法，其特征在于，该方法的步骤如下a)对光纤的一个端面进行羟基化处理；b)将步骤a)得到的光纤端面上的羟基通过Y-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧基硅烷改性，与第一葡聚糖高分子共价连接；c)将步骤b)得到的光纤端面第一葡聚糖高分子上的醇羟基通过环氧氯丙烷改性，与第二葡聚糖高分子共价连接；d)将步骤c)得到的光纤端面第二葡聚糖高分子上的醇羟基通过改性，与生物分子共价连接。8.—种光纤生物传感器检测系统，其特征在于，它包括至少一个权利要求1-5任一项所述的光纤生物传感器探头、暗盒、以及光信号接收与处理装置，其中，所述光纤生物传感器探头固定有生物分子的一端与暗盒连接，另一端与光信号接收与处理装置连接。9.根据权利要求8所述的光纤生物传感器检测系统，其特征在于，所述暗盒包含位置调节装置，其上设有试剂池。10.权利要求8或9所述的光纤生物传感器检测系统在体外定量检测中的应用。全文摘要本发明公开了一种光纤生物传感器探头，它是由光纤、共价连接在所述光纤的一个端面上的第一葡聚糖高分子、与所述第一葡聚糖高分子共价连接的第二葡聚糖高分子、和与所述第二葡聚糖高分子共价连接的生物分子组成，其中所述第一葡聚糖高分子和所述第二葡聚糖高分子的分子量在3000～2000000范围内，且所述第一葡聚糖高分子的分子量大于所述第二葡聚糖高分子的分子量，所述生物分子能与被检测分子特异性结合。本发明还提供了制备该光纤生物传感器探头的方法和光纤生物传感器检测系统，以及该光纤生物传感器检测系统在体外定量检测中的应用。文档编号G01N21/17GK101750483SQ20081020383公开日2010年6月23日申请日期2008年12月2日优先权日2008年12月2日发明者刘艳平申请人:浙江我武生物科技有限公司