专利名称：具有共价结合酶的cm传感器的制作方法
技术领域：
本申请涉及电化学传感器，它的制备方法以及利用该电化学传感器确定流 体介质中分析物的方法。
背景技术：
生化分析检测系统是临床相关分析方法的重要部分。这主要关心的是能够 借助于酶直接或间接确定的分析物的检测。生物传感器，也就是配有生物组分 的测量系统，已经被证明特别适合于分析物的测量，其允许对分析物进行连续 或间断地重复测量并能运用于体外(ex vivo)及体内(invivo)。体外生物传感 器典型地用于流通池中，而体内生物传感器优选植入皮下脂肪组织。人们就此 对经皮植入和全植入(foil implant)进行区分，前者只在短时期引入组织并直接 和定位于皮肤上的测量设备接触，后者利用外科手术连同观懂设备一起插入组 织。
电化学生物传感器允许通过两个或更多电极对分析物进行测量，其中至少 一个电极表现为工作电极，需要被检测的分析物在其上被转换。含有酶作为生 物学组分的电化学生物传感器将所述酶容纳在工作电极上或工作电极内，在这 种情况下，例如可以将分析物作为酶的底物，并且可以通过该酶使其发生物理 化学的改变(例如，氧化)。氧化还原介懒每分析物转化期间释放的电子迁移到 工作电极的导电组分上，并且由电子流动所产生的电测量信号与所测定分析物 的浓度相关。
天然产生的氧化还原对和合成的氧化还原对都考虑作为氧化还原介体。例 如那些Feldman等[Diabetes Technology & Therapeutics 5 (2003), 769-779]所描述
的合成的氧化还原介体，不太适合体内应用。这是因为如下事实当生物传感 器弓l入身体的时候，合成的氧化还原介体理论上来说总能弓胞身体的免疫反应。
然而，至少必须考虑这些物质的毒性，并且如果必要，对其进行检査，因为氧 化还原介体必须一直能够自由地扩散通过电极结构，通过该方式它们也可以从 电极逃逸出并进入周围的有机体。这点与体外应用无关，如果确保不会因为分 析物的潜在回流而使其迎入身体的话。
因此，采用天然产生的氧化还原介体的电化学传 #别适用于体内应用。 敦过氧化氢氧化还原对被证明在这点上有特殊的优势，因为最初成分(氧)一 直存在。在氧气存在的情况下通过氧化酶而在分析物的酶转化中产生的过氧化 氢被在电活性生物传 的工作电极上重新氧化，于是通过释放电子产生电信 号并且氧化还原介体也转化回其氧化形式。这种酶反应的动力学遵循所谓的乒
乓机制[Leskovac等，The International Journal of Biochemistry and Cell Biology 37 (2005), 731-750〗。
但是，在需要氧作为共底物的酶的帮助下对分析物进行检观附的一个重要 问题在于，在组织中会发生氧气浓度与起始浓度相比暂时减小，这会影响传统 的体内生物学传感器的功能。图1显示了在各种氧气浓度下，利用葡萄糖氧化 酶把葡萄糖酶解氧化为葡萄糖酸-5-内酯的反应动力学。该图表明一般而言在给 定氧气浓度下所转化的分析物的量随着葡萄糖浓度的增加而减少，由此，尽管 葡萄糖氧化酶对葡萄糖有高结合常数(大约250mM)，在生理相关范围中该曲 线处于非线性范围内。此外，图1表示，在较高的分析物浓度下，直到氧浓度大约为ImM时才得 到近似线性曲线。但是，体内水环壤特别是在皮下脂肪组织胞间液的溶解氧浓 度，是相当地低。然而，在37°C，水中氧浓度大约为0.21mM，皮下脂肪组织 的预期氧浓度仅为O.lmM或更少，这就是各种情况下所述曲线在生理性葡萄糖 浓度发生弯曲的原因。这种偏离线性路线导致了体内生物传感器中非期望的瞬 时功能特征。
因此，组织中氧气的有限可获得性是需要氧气作为共底物的许多酶生物传感 器中电化学传感器的功能曲线的线性度柳艮制因素。功能曲线的线性度在原则 上能够利用带有盖膜的工作电极来提高，所述盖膜抑制分析物的扩散比抑制共 底物的扩散更强。其中，图3尤其表示了带有由促进氧气扩散比皿葡萄糖扩
散强得多的聚亚安酯组成的盖膜的酶生物传感器的功能曲线(用正方形表示的 测量值)。这表明，通别顿合适的盖膜，传感器的测量信号育,基本保持线性 直至葡萄糖浓度约lOmM。在更高浓度下，曲线变得更为弯曲。
然而，电化学传感器中蒯莫的运用与某些问题相关。因而，用来检测不同分 析物的电化学传感器通常也必须包含不同的盖膜以便提供底物和共底物的不同 扩散。同时，其必须保证盖膜在体内应用时具有高度生物相容性，这牵涉到相 当量的技术要求并最终导致生产成本的增加。
为了降低电化学生物传感器的工作电极相对于参考电极的极化电压并且由 此减少干扰物质对工作电极上测量信号的影响， 一些电化学生物传感器额外利 用了促进电子从氧化还原介体到工作电极的导电部分上转移的电催化剂。这种
电催化剂的例子就是酞菁钴(cobalt phthalocyanine)，其催化过氧化氢氧化为氧 气[Crouch等，Biosensors and Bioelectronics 21 (2005), 712-718〗。这个过程中，酞
菁钴络合物的钴(n)阳离子最先被过氧化氢还原为钴(i )，然后fflii在阳极 释放电子转化为原来的二价状态。
另外来自文献的电催化剂例子是软锰矿形式的二氧化锰(manganese
dioxide) [Cui等，Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 1 (2005).
130-135; Luo等,Biosensors and Bioelectronics 19 (2004), 1295-1300]。虽然在二氧 化锰上过氧化氢的催化氧化机制尚未被详细解释，但是与没有二氧化锰的工作 电极相比，以二氧化锰为电催化齐啲工作电极的电势降低了数个励mV。因此， 显著减小了干扰物质例如抗坏血鹏舰素对测量信号的影响。
禾,电催化齐啲另一个原因是由过量过氧化氢引起的酶的破坏。假如在工作 电极皿种物质不充分ffi3Ii也懒牟，酶可能发生变性。为了解决这个问题，文 献建议合自过氧化氢有抵抗力的酶，例如ffl)l突变[US 2004/0137547Al]。然 而，对酶进行这种修饰而不对酶的其他特性例如酶的特异性产生不利影响是非 常困难的。因此，由于电催化剂大大提高了过氧化氢的氧化效率并且按照这种 方式防止电极基质或其环境中形成过量的过氧化物，在产生过氧化氢的转化中 使用电催化剂似乎比上述方法要好得多。
在分析物的酶确定中与过氧化氢形成相关的附加问题是过氧化氢能作为分
析物或共底物氧气的抑制剂。这种竞争性抑制依赖于过氧化氢的浓度并限制分
析物的转化。最终促iS31氧化氢向氧的重新氧化的电催化剂的使用对于分析物
的转化也具有积极的作用。
在设计电化学生物传感器时需要考虑许多因素。因此，生物传感器必须在工
作电极中有足够量的酶以防止测量过程中酶的限制[Abd等,Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 7 (1999), 93-100]。此外，在用生物传感器进行测量的旨 过程中，酶分子应当定位于工作电极的结构中，也就是说所述酶不应当在测量 介质到达的电极区域上发生分离或移位[Doretti等，Biosensors and Bioelectronics 11 (1996), 363-373]。最后，该酶也应该在生物传感器的工作电极里保持稳定。 导致电化学生物传感器中酶的热失活的因素以及保持其稳定的方法已经被研究 了多次[Sarath Babu等,Biosensors and Bioelectronics 19 (2004), 1337-1341]。生物 传感器制造后的酶P絲 最终导致了传感器的有限的寿命。
为了考虑以上因素，尝试M:将酶固定在工作电极的电极基质上从而来稳定 酶，但这需要大力寻找合适的固定方法来将酶固定在电化学生物传感器上。吸 附和化学固定一样都被用于实际应用中。然而，由于各种原因吸附固定是不利 的。 一方面，它需要工作电极被不能被酶透过的膜包住，这增加了制造生物传 感器的劳动并对膜有非常多的要求。另一方面，在吸附固定的情况下无法防止
—M在电极中的酶分子的位移，其导致传感器功能的改变。US 5,368,707公开了 包含具有吸附结合酶的工作电极并适用于观淀液体中微摩尔量的铅离子的生物 传感器。为了制造该生物传感器，由导电材料构成的工作电极的表面上覆有胶 体金，合适的酶吸附在 粒上，其进而能与氧化还原介体共价结合。
配有为支撑酶吸附固定的盖膜的电极的另一缺点(这在体内应用时尤其不能 轻视)在于必须对盖膜的完整性进行非侵入性检查。由于即使是膜最小的瑕疵 也足以导致酶从电极流到环境中，因而必须进行大量的检查，特别是在体内生 物传感器的情况下。因此考虑到吸附固定的缺点，从而存在通过电极基质中的 或与之键合的共价健而将酶固定在电化学生物传感器上的实际需求。
JP 10-68651描述了用来测定分析物例如葡萄糖的包含带有共价结合酶的电 极的传感器。为了达到这个目的，涂敷有作为导电物质的Sn02的电极表面经强
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酸#^舌，用偶联试剂功能化并最后与,触。
EP0 247 850A1公开了用于分析物的电流检测的生物传繊。这些传繊包 括带有固定或吸附在导电支柱表面上的固定酶的电极，其中该支柱由树脂结合 (resin-bound)碳或石墨颗粒的镀鉑多孑L层构成或包含这样的层。为了这个目的， 先准备好用镀铂石墨和聚合物粘合剂构成的电极，随后与,触。在这种情况 下，该酶ffiil吸附到电极表面或利用合适试剂偶联到聚合物粘合剂上而固定。
带有包含固定或吸附在导电的、多孔电极材料上面或内部的酶的电极的电流 生物传感器在EP0 603 154A2中也有描述。为了制造酶电极，第四周期的过渡 金属的氧化物或氢氧化物，例如二氧化锰，作为催化剂和石墨以及不导电的聚 和物粘合剂一起被制成糊，并且所述糊干后得到的多孔电极材料在第二步与酶 接触。酶能够利用戊二醛通过交联而被固定在多孔电极材料上或多孔电极材料 内。
JP10-68651 ， EP0 247 850 Al和EP0 603 154 A2中所述的电化学生物传感 器的主要缺点是酶先被固定在预制的无酶电极上。结果，有个问题就是酶不能 通过可控制方法被偶联到电极成分上。因此，当戊二醛被用来作为交联剂时， 酶不仅仅以不可控制的方式结合于电极材料的任何活性成分，也相互交联。此 外，该过程用使用过的试剂污染了电极，由此，必须再次彻底地清洁电极，特 别是在用于体内生物传感器之前，这增加了生产的复杂性以及由此所导致的成 本。
US4,938,860公幵了了合适的用于电化学传感器的电极，其包含涂覆铂的薄 膜状阳极以及粘合在阳极上的酶层。优选通过利用氨基硅烷和合适的交联剂例 如戊二醛将酶层结合于镀鄉日极上。然而，US4,938,860所描述电极的缺点为由 于阳极的薄膜状结构只有很小的表面用于分析物的酶转化，并且用作催化剂的 铂是相对昂贵的材料。
发明内容
因而，本发明的目的在于提供用于确定分析物的酶电化学传感器，其中至少 部分地消除了现有技术的缺点。特别地，该传感器应当确保酶的特异性且持久
的固定，具有高效性并由此实现产生高信号产率。此外，应该能够以简单和低 成本的方式制造所述传感器。
根据本发明利用确定流体介质中分析物的电化学传感器实现了所述目标，所 述传感器至少包括一个工作电极和至少一个参考电极，其中至少工作电极在电 极基质中包含电催化剂颗粒，且其中适合于确定分析物的酶共价结合于电催化 剂颗粒。
金属氧化物^it用作至少存在于工作电极的电极基质中的电催化剂。金属氧 化物可以是任何能够催化用于确定分析物的氧化还原介体的转化的金属氧化 物。在更{雌的实施方案中，所采用的电催化剂魏自如下物质所构成的组的
金属氧化物Mn02， FeOOH， Fe304, Fe203 ， &203和^05，而癒02是特别 优选的。此外，合意的是该电催化剂对氧有高亲和力。
根据发明的电催化齐似颗粒形式提供，其中颗粒的尺寸可以因各自的需要而 改变。在本发明范围中，90%的电催化齐噘茅爐常具有0.1拜到20网的直径， 直径为0.5拜到5拜被证明是特别 的。无论如何，电催化齐噘粒的大小应 当总是比工作电极的层厚度要小，工作电极的层厚度范围为1,到50拜，优 选的范围是从5拜到20,。
il^粒尺寸来控制电催化剂有效表面的能力是至关重要的，特别是对于其 通过酶的功能化而言。由此，电催化剂较高有效的表面同样增加了它的酶负载 量，并由此导致了较高的通常由工作电极里的电催化剂的数量、孔隙率以及面 积而确定的酶活性，酶活性以单7^/毫克电催化剂计。在本申请的使用范围内， 词语"单元"代表的是标准状况下每射中转化l,ol底物需要的酶的量。用于本 发明目的的涂敷酶的电催化剂颗粒通常具有的酶活性大约为0.01U/mg至伏约 10U/mg，而酶活性大约0.1U/mg到大约10U/mg被证明是特别有利的。
根据本发明的电化学传感器中，酶选择性地与电催化剂颗粒共价结合，最优 选的酶是与电极基质的其它组分没有共价结合。酶与电催化剂的共价结合，具 有氧化还原介体到电极催化活性部位的扩散途径肖^多保持很小的优点，这样使 工作电极具有高效率，从而电化学传 产生高的信号产率。
此外，电催化剂再生后，氧化还原介体也吸附结合在电催化剂上，作为这样
的结果，例如在敦过氧化氢系统中的情况下，在电催化剂表面区域产生局部的 高氧活性，其朝着周围测量介质的方向减小。另一方面，酶共价结合到电催化 剂上导致了在酶上的再生的氧化还原介体的局部高活性，^M过所产生的与分 析物浓度相关的观懂信号的较高统性和稳定性来反映，例如图3 (用三角表示的 测量值)所示。在这种情况下，即使环境中氧化还原介体的浓度瞬间降低，例 如由于组织的血液循环受限引起的，也不会导致测量信号的瞬间改变。
最后，因为在典型的测量条件下(生理电解浓度，生理PH值，体温)可以 排除齢子的脱离，因此酶共价偶联到电催化剂上保证了功能的稳定性。由此， 根据本发明的电化学传感器在一段长时间内保持操作并且实际上不会漂移地进 行操作。
为了将酶共价结合到电催化剂颗粒上，本发明在优选实施方案中设想电催 化齐噘粒具有功能化的表面，并且特别是具有用与酶结合的氨基基团南和羧基 基团功能化的表面。该表面例如通过用合适的试齐臉覆所述电催化齐噘粒以在 电催化剂颗粒表面形成官能团进行功能化，通过这种方式所述酶育^I多与电催化 颗粒共价结合。
在本发明范围内使用的涂覆试剂是这样的物质:其一方面M:例如电催化剂
的羟基与电催化剂共价结合，而在另一方面，其包含至少一个可用于与酶共价 结合的官能团。这意味着，涂覆试剂至少是双官能的，也就是说，包含至少两 个官能团。被用来与电催化齐哄价结合以及与酶共价结合的涂覆试齐啲官能团 可以是一样的也可以是不一样的，但是 是不一样的。伏选的涂覆试剂是硅 烷，它携带有至少一个适合的官能团，酶通过盖官能团共价结合到涂覆试剂上。 电催化齐噘粒表面更^^用氨基硅烷官能化，所述氨基硅烷结合到电催化 剂颗粒的表面上形成硅一氧键，而且同时为酶共价结合到电催化剂颗粒表面提
供了自由氨基基团。合适的氨基硿烷包括例如3-氨丙基三甲氧基硅烷和3-氨丙 基三乙氧基硅烷，3-氨丙基三乙氧基麟尤其fM。
可替换地，电催化剂颗粒的表面可以用羧基硅烷官能化，羧基硅烷结合到 电催化剂颗粒的表面形成硅-氧健，并且任选地在水解后为酶共价结合到电催化 剂颗粒提供自由的羧基基团。就此而言，可商业购买的称为Geniosif GF20
(Wacker Company)的3-(三乙氧基甲硅烷基)-丙基琥珀酸酐被证明是特别合 适的硅烷。
所述酶可以通过直接或者交联剂共价结合到电催化剂颗粒的官能化表面。 在优选实施方案中，所述酶是直接结合到电催化齐噘粒的官能化表面上的。所 述酶可以以任何方式偶联到电催化剂颗粒的官能化表面上，并且育的多包括在电 催化剂颗粒的官能化表面上的^和酶的官能团在先活化。例如，官能团可以通 过合适的活化试剂与官能化电催化剂或者酶进行反应而被活化。优选的活化试 剂包括碳二亚胺，例如二环己基碳二亚胺(DCC)、 二异丙基碳二亚胺或者1-乙基-3-(3-二甲氨基丙萄碳二亚胺(EDC)，以及碳二亚胺和琥珀酰亚胺的组合。 用于本发明目的的特别适合的活化试剂，包括l-乙基-3-(3-二甲氨基丙萄碳二亚 胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺的组合。
在另一优选实施方案中，所述酶通过交联剂结合到电催化剂颗粒的官能化 表面上，所述交联剂具有能够与电催化齐噘粒官能化表面上的官能团以及酶的 官能团产生共价反应的活性基团。存在特别优选的活性基团，其肖^I多使酶和电 催化剂颗粒表面上的官能团发生交联反应。任何能够满足上述官能的试剂都可 以被考虑作为交联剂，例如多官能醛，特别是二醛，例如戊二醛、苯醌、溴化 氰、肼类、琥珀酰亚胺类、2，4,6-三氯-1， 3， 5-三嗪或者它们的组合。4腿琥珀 酰亚胺，更优选二琥珀酰亚胺(disuccinimide)，最优选辛二酸二琥珀酰亚氨酯 (disuccinimidyl suberate) pSS)作为交联剂。
通过将共价涂覆有酶的电催化剂颗粒与电极基质的其它成分例如导电电极 材料混合，随后将混合物干燥，可以得到工作电极的电极基质，所述电极基质 通常含有重量比大约为1%到大约50%的电催化剂， 的量是重量比大约5% 到大约20%。
在另一优选实施方案中，电极基质以多孔的形式存在。所述电极基质的孔 隙率尤其能够通过电催化剂和其它组分的颗粒尺寸进行调节，其中高孔隙率与 电极的更大有效表面相关，并因此与对测量介质的更大接触面积相关。肖^多例 如以糊的形式提供用于生产电极基质的导电材料，包含导电固体颗粒，例如 石墨敏和富勒烯，与不导电的粘合剂，特别是不导电的聚和物粘合剂例如全氟
化聚合物如Nafion，的组合。
固定在电催化剂颗粒上的酶f，是氧化酶，特别是醇氧化酶(1丄3.13)、芳 醇氧化酶(EC 1丄3.7X儿茶,化酶(EC 1丄3.14)、胆固醇氧化酶(EC 1丄3.6)、 胆,化酶(l丄3.n)、半乳糖氧化酶(EC 1丄3.9)、葡萄糖氧化酶(EC 1丄3.4)、 甘油一3—磷酸酯氧化酶(EC 1丄3.2D、己糖氧化酶(EC 1丄3.5X苹果酸盐(酯) 氧化酶(EC 1.1.3.3)、吡喃糖氧化酶(EC 1.1.3.10)、吡眵醇4-氧化酶(EC 1丄3.12) 或者硫胺素氧化酶(EC1丄3.23)。所述酶特别优选是葡萄糖氧化酶。
根据本发明的电化学传感器的参考电极用来调整工作电极的极化电位并且 能由适合于本发明目的的任何材料组成。ttiMOT傲氯化银电极作为参考电极。
此外，本发明的电化学传感器能够除了所述至少一个工作电极和所述至少一 个参考电极以外还包含有至少一个反电极，所述反电极优选是贵金属电极形式 特别是金电极形式。贵金属电极形式的反电极iM涂敷有适合的导电材料，例 如包含有导电性固体颗粒的糊，特别是碳糊。
根据本发明，电化学传感器优选包含两个部分。能够接触到含有分析物的 流体介质的第一个部分包括电极，即工作电极、参考电极和任选的反电极。这 个部分优选具有生物相容涂层。所述生物相皿层允许分析物穿M入电极基 质，但应当阻挡电极组分漏到周围的介质中。考虑到由于酶共价结合到电催化 剂所以所述酶不会从工作电极或者电化学传感器漏出的事实，在很多应用中生 物相容涂层并不是绝对必须的。从而，当生物相，层不是到酶的障碍的时候， 根据本发明的电化学传感器也能够被特别应用到体内生物传感器中。相反地， 能够据此来挑选生物相，层，其提供与周围组织或者血液或者血清最佳的相 互作用。
生物相容涂层能以各种方式产生。优选的方法是采用施加于电化学传感器 的预制膜。这种膜能够通过多种技术固定在传感器上，而胶粘或者激光焊接被 认为是优选的。就此而论，预制的透析膜被证明是有利的，并且由聚醚砜制成 的透析膜，例如那些在EP1710011 Al中所披露的可以通过商标Ultrason 6020(BASF Company)商业购买得到的是特别优选的。
可替换地，生物相容涂层能够通过将合适的聚合物溶液施加到电化学传感
器上并随后对其进行"B喿而被原位生成。将聚合物施加到生物传感器上优选是 通过喷雾、浸涂或者分散该聚合物的稀释液来实现，但并不仅仅局限于这些方 法。优选使用有机溶剂作为溶剂，特别是沸点30(TC的有机溶剂，例如乙醇，
该溶剂含有大约从0.1%重量到约30%重量，，约0.5%到约15%重量的聚合
物。适合该目的的聚合物特别包括具有两性离子结构和模拟细胞表面的聚合物，
例如2-甲基丙烯酰氧基乙基一磷酰基胆碱-共-甲基丙烯酸正丁酯 (MPC-co-BMA)。所获得的生物相繊层通常具有大约l拜到大约100拜的厚 度，雌是大约3,到大约25,的厚度。
电化学传感器的第二部分存在于不能接触到流体测量介质的区域，并且优: 选包含用于记录测量值的装置。在另一优选实施方案中，第二部分额外地包含 电压源，例如电池或者蓄电池，和从无线数据传输體中以及显示观糧值的显 示器赵隨的體。可替换地，第二部分能够包含与电化学传感器分离的用于测 量值记录装置的接口。
根据本发明的电化学传感器优选设计成用于多种测量，也就是说，传感器
能够对待确定分析物进行重复测量。这在如下应用中尤其是合意的其中，恒
定地，也即连续的或间断地，控制分析物的存在南和量是在较长时间里例如一 天或者更长，特别是一周或者更长的发生，例如在透析病人的情况下。在优选 实施方案中，本发明因此提供的电化学传感器被设计作为含有分析物的流体流 过的流通池。可替换地，然而，本发明的电化学传感器也能够被设计成为全部 或者部分可植入的装置，例如可以被植入到脂肪组织或者血管中。
根据本发明的电化学传感器育^多被用来确定能够来自任何来源的流体介质 中的分析物。在优选实施方案中，该电化学传感器被用来确定体液中的分析物， 所述術夜包含但不限于全血、血浆、血清、淋巴液、胆汁、脑脊液、细胞外组 织液、尿液以及腺体分泌物，比如唾液或汗液，其中全血、血浆、血清以及细
胞外组织液被看作是特别雌的。分析所需的样本量通常从大约0.01^1至伏约 IOOmJ，，是从大约0.1^d到大约2nl。
待定性鲂和定量确定的分析物可以是任何育,氧化还原反应的方式被测
定的生物或化学物质。分析物^^从下歹,质所组成的组中选择苹果酸、醇、
铵、抗坏血酸、胆固醇、半胱氨酸、葡萄糖、谷胱甘肽、甘油、尿素、3-羟基丁 酸酯、乳酸、5-核苷酸酶、肽、丙酮酸盐(酯)、水杨酸盐(酯)和甘油三酸脂。 在特别优选的实施方案中，待用本发明所述电化学传感器确定的分析物是葡萄糖。
在另一方面，本发明涉及制备本发明所述电化学传感器的方法，包括步骤:
(a) 提供电催化剂颗粒，
(b) 用酶涂敷电催化剂颗粒，其中，所述酶共价结合到电催化剂颗粒上，
(c) 将从步骤(b)得到的共价涂敷了酶的电催化剂颗粒与导电电极材料
以及任选的另外的物质相混合，
(d) 将步骤(c)中得到的混合物加工制作成电极，并且
(e)将步骤(d)中得到的电极与至少一个其它电极进行组合。 为了制备本发明所述的电化学传感器，上面所定义的电催化剂颗粒优选首 先和涂敷试剂反应，该电催化齐噘粒表面通过这种方式被官能化。通过官能化 的电催化剂颗粒连续与交联剂及酶反应，从而获得了共价涂敷有酶的电催化剂 颗粒，其能够通过与上述的其它成分进行混合来加工形成电极基质。
根据本发明的制备方法实际上确实被证明是特别有利的，这是因为制造涂 敷酶的电催化齐脂巨够和电极的制备分开执行。而且，共价涂敷有酶的电催化剂 为电极糊的制备提供了所定义的起始材料，这种起始材料能在弓l入电极糊之前 謝B屯化，从而避免对完成的电极进行后续清洗。
在另一方面，本发明涉及观啶流体介质中分析物的方法，包括步骤
(a) 所述流体介质与根据本发明的电化学传 接触，禾口
(b) 通过测fijlf述电化学传麟产生的信号来确定流体介质中分析物的存在敏和量。
为了确定分析物，电化学传感器能以允许所述电化学传感器与流体介质接 触的任何方式进行设计。由此，传感器例如能被设计成允许含有分析物的介质 从中流过的流通池。另一方面，该传感器也能够被设计成扩散传感器，其中传 感器和介质的接触通过扩散而发生。同样地，该电化学传感器能被设计成旨在 完全或者部分植入病人体内的装置，在这种情况下其或者植入到血管中或植入
组织中，特别是植入皮下脂肪组织中。
根据分析物的存在*和量由传感器产生可测量信号。该信号优选是电信号， 比如例如是电流、电压、电阻等等，其通过适当的方法被评估或者读取。电化 学传lt^，是电流传感器。
将ffiil下面的附图和实施例对本发明作进一步阐述。
图1显示当使用葡萄糖氧化酶作为酶以及敦过氧化氢作为氧化还原反应介
体时，葡萄糖转化相对于葡萄糖浓度[mM]曲线图，其作为氧浓度的函数。Km^ 和VH^^f^的是根据Michaelis-Menten动力学得出的葡萄糖的酶动力学常数。 图2显示了在对测试溶液中的葡萄糖浓度进行的7天测量过程中根据本发 明的电化学传感器的观糧到的信号[nA]相对于时间[秒]的曲线图，其中葡萄糖浓 度从0到26mM之间周期性变化。没有盖膜的电极作为工作电极，所述电极含 有涂敷了葡萄糖氧化酶作为电催化齐啲二氧化锰，根据本申请实施例6制备得 到。
图3显示的是具有固定酶的两个电化学传感器的须糧信号[nA]相对于测试 溶液中葡萄糖浓度[mM]的关系图。用三角形表示的测量值显示了本发明所述的 电化学传感器的功能曲线，其中葡萄糖氧化酶共价结合到工作电极的电催化剂 上并且没有使用盖膜。正方形所表示的测量值形成了相同尺寸的传感器的功能 曲线，其中所述酶利用由聚氨酯组成的盖膜固定在工作电极中并且不通过共价 结合方式与电催化剂相结合。
具体实施方式
实施例
实施例l:羧基官能化的二氧化锰的制备
1.6g二氧化锰(TechnipurCompany)在256ml甲苯中悬浮，将84gGeniosif GF20 (WackerCompany)力口到所得的悬液中里，在氮气氛围中、5(TC以及520 rpm下将反应混合物搅拌24小时以制备羧基官能化的二氧化锰。在冷却并沉淀
二氧化锰后，滗析出甲苯，将残留物洗涤两次，每次用250ml的甲苯，之后用 250ml的丙酮洗涤一次。在按照此方式获得的官能化二氧化锰中添加250 ml水 并在室温下搅拌24小时。接着，水被离心分离，残留物置于CaCl2上5(TC真空 千燥，得到大约1.5mg的羧基官能化二氧化锰。
实施例2:将葡萄糖氧化酶耦连到羧基一官能化的二氧化锰上
500mg的l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、 400mg的N-羟 基琥珀酰亚胺和70mg的葡萄糖氧化酶加入到100mg的来自实施例1的干的、 羧基官能化的二氧化锰中，室温下在水溶液里搅拌24小时。当固鹏淀后，除 去上清液，用pH 7.4的磷酸钾缓冲液洗涤所述固体四次。得到的固体在空气中 千燥后，得到大约85mg的涂敷酶的电催化剂，其具有的酶活性为0.06U/mg。
实施例3:制备氮基官能化的二氧化锰
将8ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷(Sigma Company)加到经充分搅拌的悬 浮液中，所述悬浮液是在加热到6(TC的32ml甲苯中的200mg 二氧化锰 (Technipur Company),所述混合物在6(TC进一步搅拌16小时。当固,淀后， 滗析出上清液，固微涤3次，每次用32ml甲苯。乘除的固i枯空气中干燥， 从而得到大约182mg的氨基官能化的二氧化锰。
^!M^用戊二,乍为交联齐鹏葡萄糖氧化酶偶联至嵐基官肖巨化的二氧化锰上 由实施例3得到的千燥固体用32ml 50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液洗涤一次， 随后置于16ml 50mMpH7.4的磷酸钾缓冲液中。往该悬浮液中添加16ml的10% 的戊二醛溶液(Sigma Company)并同时搅拌。在25。C 1.5小时后终止该反应。 沉淀的固体洗涤3次(每次用32ml 50mM pH7.4的磷酸钾缓冲液)，悬浮到16ml 的相同缓冲液中并同时搅拌，并与0.5mg/ml葡萄糖氧化酶(Roche Company) 在50mM pH7.4磷,缓冲液中的16 ml溶液混合。将所述混合物在25。C搅拌3 小时。当固体沉淀后，洗涤4次，每次用16ml的50mM的pH7.4的磷,缓冲 液洗。冻干后，得到大约200mg的酶活性为0.12U/mg的涂敷酶的电催化剂。^Mii:用辛二酸二琥珀酰亚胺作为交联齐i將葡萄糖氧化酶偶联至i嵐基官能化
的二氧化锰上
把在20m1 二氧杂环己烷中的0.02mg辛二酸二琥珀酰亚胺以及在2ml 0.1 m pH8.5的磷酸钾缓冲液中的0.008mg葡萄糖氧化酶加入到从实施例3中得到的 20mg干的氨基官能化的二氧化锰中，并在室温搅拌4小时。将所述固体离心后， 所述固佩涤2次，每次用5mJ 0.1MpH8.5的磷,缓冲液，随后置于5ml 0.1M pH8.5的磷酸钾缓冲液中。冻干后，得到大约18.8mg的酶活性为0.1U/mg的涂 敷酶的电催化剂。
实施例6:制备电流传感器
为了制备具有三个电极(工作电极、参考电极和反电极)的允许用来测定 血液中或者皮下脂肪组织中的葡萄糖的电化学传感器，在第一步骤中制备没有 盖膜的工作电极。为了这个目的，将根据实施例5的用葡萄糖氧化酶官能化的 二氧化锰与碳聚合物糊PE401 (Acheson Company)以及二甘醇单丁醚混合，用 分配技术将得到的混合物施加到由聚酯制成的传繊条的金表面上，并在25°C 真空干燥。以此方式得到的工作电极与作为参考电极的傲氯化银电极、作为反 电极的金电极结合。所述导电路径是绝缘的。
实施例7:检测电流传感器的观糧信号的稳定性禾喊性
根据实施例6所得到的电化学传 浸入到位于流通室中的葡萄糖溶液 里，检测7天，期间葡萄糖溶液浓度在0到26mM之间持续变化。图2和3显 示了该测量结果。
权利要求
1. 用于确定流体介质中分析物的电化学传感器，包含至少一个工作电极和至少一个参考电极，其中，至少所述工作电极包含在电极基质中的电催化剂颗粒，其特征在于适于确定所述分析物的酶被选择性地共价结合在所述电催化剂颗粒上。
2. 根据权利要求1所述的电化学传感器，其特征在于所述电催化剂为金属 氧化物，特别是从由Mn02、 FeOOH、 Fe304、 Fe203、 0203和￥205所组成的组 中选出来的金属氧化物。
3. 根据权利要求1或2所述的电化学传感器，其特征在于所述电催化剂为MnO^
4. 根据权禾頓求1-3中任一所述的电化学传感器，其特征在于90%的电催 化剂颗粒的直径为0.1拜一20拜，特别为0.5拜一5拜。
5. 根据权利要求M中任一所述的电化学传感器，其特征在于所述电催化 剂颗粒具有的酶活性为大约0.01U/mg—约10U/mg，特别为约0.1U/mg—约 10U/mg。
6. 根据权利要求1-5任一所述的电化学传感器，其特征在于所述电催化剂 颗粒具有结合所述酶的官能化表面。
7. 根据权利要求6所述的电化学传感器，其特征在于所述电催化剂颗粒的 表面用氨基基团^/和羧基基团官能化。
8. 根据权利要求6或7所述的电化学传繊，其特征在于所述电催化齐噘 粒的表面用氨基硅烷特别是用3-氨丙基三乙氧基硅烷官能化。
9. 根据权利要求6或者7的电化学传自，其特征在于电催化剂颗粒的表 面用羧基硅烷特别是3-(三乙氧基甲g基)丙基琥珀酸酐官能化。
10. 根据权利要求6-9任一所述的电化学传感器，其特征在于所述酶直接结 合至U所述电催化齐噘粒的所述官能化表面上。
11. 根据权利要求6到9任一所述的电化学传感器，其特征在于所述酶ffi31 交联剂结合到所述电催化剂颗粒的所述官能化表面上。
12. 根据权利要求11所述的电化学传感器，其特征在于所述交联剂是琥珀酰 亚胺并特别是辛二酸二琥珀酰亚胺。
13. 根据权禾腰求l-12任一所述的电化学传感器，其特征在于所述电极基质 含有大约为lwtM—大约50wt%，特别是大约5wt。/。一大约20wt"y。的电催化剂。
14. 根据权禾腰求1-13任一所述的电化学传感器，其特征在于所述电极基质 为多孔形式。
15. 根据权利要求l-14任一所述的电化学传感器，其特征在于所述电极基质 另外包括导电电极材料。
16. 根据权利要求1-15任一所述的电化学传感器，其特征在于所述酶是氧化酶。
17. 根据权利要求1-16任一所述的电化学传感器，其特征在于所述酶是葡萄 糖氧化酶。
18. 根据权禾腰求1-17任一所述的电化学传感器，其特征在于其另外包括反 电极。
19. 根据权利要求1-18任--所述的电化学传感器，其特征在于所述反电极涂 敷有导电材料。
20. 根据权利要求1-19任一所述的电化学传感器，其特征在于它包含至少 两个部分，其中第一部分包括所述电极，提供有生物相容性涂层并且能够与含 有所述分析物的所述流体介质接触，而其中第二部分处于不能到达所述流体介 质的区域中。
21. 根据权利要求20所述的电化学传自，其特征在于所述生物相容性涂层 是fflil把预制的膜施加在所述传麟上形成。
22. 根据权利要求20所述的电化学传lifl，其特征在于所述生物相容性涂层M:把聚合物溶液施加在所述传感器上并随后干燥形成的。
23. 根据权利要求22所述的电化学传感器，其特征在于所述聚合物是 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷翻旦碱-掩甲基丙烯酸正丁酯。
24. 根据权利要求20-23任-所述的电化学传感器，其特征在于所述生物相 容性涂层的厚度为约lMm-约100,， j，约25miti。
25. 根据权利要求20所述的电化学传 ，其特征在于所述第二部分包括用于记录测量值的装置。
26. 根据权利要求25所述的电化学传 ，其特征在于所述第二部分另外包 括电压电源、和选自无线数据传输装置和用于显示测量值的显示器的元件。
27. 根据权利要求20所述的电化学传lf^，其特征在于所述第二部分包括用 于记录测量值的装置的接口 ，所述记录测量值的装置与电化学传感器分离。
28. 根据权利要求1-27任一所述的电化学传感器，其特征在于该传 被设 计为用于多次测量。
29. 根据权利要求l-28任一所述的电化学传感器，其特征在于该传/i^被设 计成为可全部或部分植入的设备。
30. 根据权利要求1-28任一所述的电化学传感器，其特征在于该传 被设 计为流通池形式。
31. 根据权利要求1-30任一所述的电化学传感器，其用于测定 中的分析 物，特别是在全血、血浆、血清或细胞外组织液中的分析物。
32. 根据权利要求1-31任一所述的电化学传感器，其用于确定从如下物质所 构成的组中选择的分析物苹果酸，醇，铵，抗坏血酸，胆固醇，半胱氨酸， 葡萄糖，谷胱甘肽，甘油，尿素，3-羟基丁酸酯，乳酸，5'-核苷酸酶，肽，丙 酮酸盐，水杨酸盐和甘油三酸脂，特别是葡萄糖。
33. 根据权利要求1-32任一所述的电化学传感器的制造方法，包括步骤(a) 提供电催化剂颗粒，(b) 用酶涂敷电催化剂颗粒，其中，所述酶通过共价结合到所述电催化剂 颗粒上，(c) 把由步骤(b)得到的被 价涂敷的所述电催化齐噘粒与导电电极材 料以及任选的其它物质进行混合，(d) 对由步骤(c)所得到的混合物进行加工以形成电极，以及(e) 把由步骤(d)所得到的电极与至少一个其它电极进行组合。
34. 根据禾又利要求33所述的方法，其特征在于在步骤(b)中，所述电催化 齐噘粒首先与涂敷试齐阪应，随后与交联剂反应，最后与酶反应。
35.确定流体介质中分析物的方法，其包括步骤(a) 4妙万述流体介质与权禾腰求1-32任一所述的电化学传# 触，以及(b) 通过测量由所述电化学传感器产生的信号确定所述流体介质中分析物 的存在敏和量。
全文摘要
本发明涉及具有共价结合酶的CM传感器，尤其涉及电化学传感器、其制造方法以及利用该电化学传感器确定流体介质中的分析物的方法。所述电化学传感器包含至少一个工作电极和至少一个参考电极，并且至少所述工作电极包含在电极基质中的电催化剂颗粒，其特征在于适于确定所述分析物的酶被选择性地共价结合在所述电催化剂颗粒上。
文档编号G01N27/327GK101393159SQ20081021543
公开日2009年3月25日 申请日期2008年7月18日 优先权日2007年7月19日
发明者A·斯泰布, H·佩谢尔, M·汉塞克, R·米施勒, T·迈耶 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司