专利名称：基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症的试剂盒。
背景技术：
在男性不育的病例中，无精子症占有较大的比例，文献报道其最高发生率 达24.3%。其发病原因很多，包括内分泌因素、遗传因素、理化因素、药物因素 及疾病因素等。无精子症可由多种病因引起，但概括起来可分为两大类， 一类 为睾丸有正常生精功能，由于输精管道梗阻，精子不能排出体外，即所谓梗阻 性无精子症(OA);另一类为睾丸生精功能障碍，精子不能发生，即所谓非梗 阻性无精子症(NOA)，其病因甚多，有遗传因素、内分泌因素、药物因素、理 化因素及疾病因素等。
既往用果糖定性实验鉴别梗阻性无精子症，精道梗阻患者精浆果糖阴性， 但需排除是否有输精管及精囊缺如；若输精管正常，则可能系获得性射精管梗 阻。精浆果糖阳性，则需行精道造影。若无精道梗阻，则需作睾丸活检，以明 确睾丸原发性生精障碍的诊断。精道造影及睾丸活检有一定的创伤，并且可引 起一些并发症，如阴囊血肿、疼痛和感染，且对生精上皮有一定的损伤，也不 能完全排除活检损伤引起的免疫反应即免疫性睾丸炎的可能性。
近年来，用查找精液中生精细胞来鉴别梗阻性与原发性无精子症的研究受到 关注，研究认为，同一病人精液生精细胞检查结果与睾丸活检所反应的细胞发 育水平相一致，并认为是替代睾丸活检的理想方法。然而，未査见生精细胞的无精子症患者，仍有相当比例属于非梗阻性无精子症。
目前，对于临床上睾丸容积正常，性激素水平亦正常的无精子症患者，为
了鉴别是梗阻性无精子症(OA)还是非梗阻性(NOA)即原发性生精障碍，最 终只有依靠操作复杂，损伤严重的输精管造影和诊断性外科取精手术，如经皮 附睾精子抽吸术(PESA)和睾丸精子抽吸术(TESA)，这些都是创伤性的、破坏 性的诊断性检查，病人有恐惧感，不易接受，不经济且不实用。所以，寻找简 便易行、无创伤及副作用的鉴别方法显得十分必要。
发明内容
Eppin (SPINLW1; GenelD57119)是睾丸和附睾特异性分泌的具有丝氨酸 蛋白酶抑制剂结构的蛋白质，存在于睾丸和附睾中，射精后的人类精浆中及精 子表面均分布大量的Eppin。梗阻性无精子症患者精浆中将不含Eppin，非梗阻 性无精子患者精浆中含有Eppin,本发明的目的在于利用上述这一特点，提供一 种具有重要的临床实用价值的一种基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精 子症的试剂盒，它由下述技术方案来实施.-
包括牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液、TBST洗脱液、兔抗人Eppin抗体、羊 抗兔IgG抗体、显色剂、微量过滤器及置于其间的硝酸纤维素膜，测试时待检 精浆经磷酸盐缓冲液稀释后吸附固定在微量过滤器中的硝酸纤维素膜上并用牛 血清白蛋白封闭，用TBST洗脱液对经所述蛋白封闭的硝酸纤维素膜进行第一 次洗涤，再经兔抗人Eppin抗体孵育后用TBST进行第二次洗涤，尔后经羊抗兔 IgG抗体孵育，最后用显色剂显色鉴别。
所述羊抗兔IgG抗体采用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗体。
所述碱性磷酸酶标记的羊抗兔的第二抗体的滴度为1: 2000。
所述牛血清白蛋白的浓度为3%。所述兔抗人抗体的滴度为1: 2000。
所述显色剂采用氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。
本发明的用抗Eppin抗体检测精浆中Eppin的诊断试剂盒，以鉴别梗阻性 (OA)和非梗阻性(NOA)无精子症，无创伤，以此可减轻病人接受精道造影和 睾丸活检的痛苦，同时可节省原精道造影等相关检测所需的大量的检测费用； 用本发明试剂盒来鉴别梗阻性(OA)和非梗阻性(NOA)无精子症其抗原抗体反 应特异性强，灵敏度高，可达分子水平，并且简单易行和快速，只需一滴精液， 2小时内出结果；由于临床上有大量无精子症患者，而本发明试剂盒能简单易行 地鉴别梗阻性(OA)和非梗阻性(NOA)无精子症，所以本发明在临床上具有重 要的应用前景和实用价值。
图1是本发明试剂盒检测非梗阻性无精症患者和梗阻性无精症患者精浆的 情形。
图2是精浆的相差图像。
图3是附睾管腔上皮细胞显微图像。
图4是将Eppin的DNA插入PET100D/TOP质粒，体外重组6-His-Eppin蛋 白质，Western blotting印迹图。
图5是正常人、非梗阻性无精症患者和梗阻性无精症患者精桨中Eppin蛋 白的Western blotting印迹图。
图6是Bio-Dot微量过滤器的结构示意图。
具体实施例方式
本实施例的Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症的试剂盒主要由硝 酸纤维素膜、3%牛血清白蛋白(BSA)、磷酸盐缓冲液、TBST洗脱液、1: 2000兔抗人Eppin抗体(购自美国SANTA CRUZ公司)、碱性磷酸酶(AP)标记的 1: 2000山羊抗兔IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)和氮蓝四唑 /5-溴-4-氯-3-n引噪磷酸显色剂组成。TBST是一种常用的生物洗涤液，由PH为 7.5、浓度为lOOmM的Tris-HCl (三羟甲基氨基甲垸盐酸盐)和浓度为150mM 的NaCl及浓度为0.05%的Tween-20配制而成。
测试时一般先将硝酸纤维素膜置于Bio-Dot微量过滤器上。Bio-Dot微量过 滤器的结构见图6，主要由模板1、密封垫2、密封垫支板3和设有抽真空管6 的底座4组成。模板1、密封垫2和密封垫支板3上均布有相互对应的若干孔7， 硝酸纤维素膜5置于密封垫2上。
本实施例分别取3例无精症患者的精浆，分别用lOul磷酸缓冲液稀释，稀 释后分别从模板1的三个孔中滴入Bio-Dot微量过滤器中，用密封垫支板3上的 抽真空管6抽气，使该微量过滤器的内部形成负压，从而使上述精浆吸附固定 于硝酸纤维素膜上。用3%牛血清白蛋白封闭该硝酸纤维素膜30分钟后，用上 述TBST对牛血清白蛋白封闭后的硝酸纤维素膜洗涤3次。洗涤后，用滴度l: 2000兔抗人Eppin抗体(第一抗体)孵育1小时。再次用TBST洗涤3次。尔 后加入碱性磷酸酶(AP)标记的l: 2000山羊抗兔的IgG二抗，孵育1小时， 最后用氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT/BCIP)显色剂显色鉴别，其结果 如图1所示Eppin阳性(Lane 1， Lane 2)为非梗阻性无精症患者；Eppin阴性 (Lane 3)，为梗阻性无精症患者。
用抗Eppin抗体行免疫荧光和免疫组织化学研究，附睾管腔上皮细胞及精子 表面、精浆中均含有大量的Eppin蛋白，如图2、 3。
将Eppin的DNA插入PET100D/TOP质粒，体外重组6-His-Eppin蛋白质， Western blotting印迹结果如图4。取正常人、非梗阻性无精症和梗阻性无精症患者的精浆各20ul进行Western blotting检测，结果参见图5，正常人和非梗阻性无精症患者精浆中含有Eppin 蛋白(图中的Lanel、 Lane2所示，Eppin蛋白显色呈阳性)，特异性高。而 梗阻性无精症患者精浆中未检测到Eppin蛋白(图中的Lane3所示，Eppin蛋 白显色呈阴性)。Western blotting印迹法进一步证实了试剂盒鉴别无精症的可 行性。
所以，用抗Eppin抗体检测梗阻性无精子症和非梗阻性无精子症特异性高， 灵敏度高，准确性高，再加上无创伤性；快速方便和检测费用低，具有广阔的 临床应用前景。
本发明应不限于上述实施例，根据本发明的技术方案，睾丸和附睾的其它 特异性蛋白如HE、 PH2()、 P34H、 GP20、 GP83、 GP39、 Ubiquitin等也可以做成 上述的试剂盒用于检测梗阻性和非梗阻性无精子症。
权利要求
1. 基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症的试剂盒，其特征在于包括牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液、TBST洗脱液、兔抗人Eppin抗体、羊抗兔IgG抗体、显色剂、微量过滤器及置于其间的硝酸纤维素膜，测试时待检精浆经磷酸盐缓冲液稀释后吸附固定在微量过滤器中的硝酸纤维素膜上并用牛血清白蛋白封闭，用TBST洗脱液对经所述蛋白封闭的硝酸纤维素膜进行第一次洗涤，再经兔抗人Eppin抗体孵育后用TBST缓冲液进行第二次洗涤，尔后经羊抗兔IgG抗体孵育，最后用显色剂显色鉴别。
2. 根据权利要求1所述的基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症 的试剂盒,其特征在于所述羊抗兔IgG抗体采用碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG抗 体。
3. 根据权利要求2所述的基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症 的试剂盒，其特征在于所述碱性磷酸酶标记的羊抗兔的第二抗体的滴度为1: 2000。
4. 根据权利要求1所述的基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症 的试剂盒，其特征在于所述牛血清白蛋白的浓度为3%。
5. 根据权利要求1所述的基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症 的试剂盒，其特征在于所述兔抗人抗体的滴度为h 2000。
6. 根据权利要求1所述的基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症 的试剂盒，其特征在于所述显色剂采用氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3』引哚磷酸。
全文摘要
本发明涉及基于Eppin抗体检测梗阻性和非梗阻性无精子症的试剂盒。包括牛血清白蛋白、磷酸盐缓冲液、TBST洗脱液、兔抗人Eppin抗体、羊抗兔IgG抗体、显色剂、微量过滤器及置于其间的硝酸纤维素膜，测试时待检精浆经磷酸盐缓冲液稀释后吸附固定在微量过滤器中的硝酸纤维素膜上并用牛血清白蛋白封闭，用TBST洗脱液对经所述蛋白封闭的硝酸纤维素膜进行第一次洗涤，再经兔抗人Eppin抗体孵育后用TBST进行第二次洗涤，尔后经羊抗兔IgG抗体孵育，最后用显色剂显色鉴别。其优点是无创伤，以此可减轻病人接受精道造影和睾丸活检的痛苦，同时可节省原精道造影等相关检测所需的大量的检测费用；灵敏度高，可达分子水平，并且简单易行和快速，具有重要的应用前景和实用价值。
文档编号G01N33/543GK101435820SQ20081023457
公开日2009年5月20日 申请日期2008年11月21日 优先权日2008年11月21日
发明者刘边疆, 炜 张, 王增军, 苏仕峰 申请人:江苏省人民医院