专利名称：一种同时检测多种肿瘤标志物的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种同时检测多种肿瘤标志物的酶促化学发光免疫分析定量测定
试剂盒。
背景技术：
肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病，2002年世界卫生组织(WHO)公 布全世界每年新增1000万癌症病例，目前世界上死亡人数中有12%死于癌症。因此，WHO 指出及早诊断和治疗是对抗癌症的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重 要因素。肿瘤标志物(Tumor marker, TM)作为一项重要指标，在肿瘤早期诊断当中发挥着 越来越重要的作用。TM是由肿瘤组织产生，存在于肿瘤组织本身、或分泌至血液或其他体 液、或因肿瘤组织剌激由宿主细胞产生的而含量明显高于正常参考值的一类物质。TM在肿 瘤的治疗监测和预后方面具有一定的应用价值。目前发现的肿瘤标志物已经有一百多种， 由于大多数情况下体内肿瘤标志物的含量都非常低，一般的检测方法很难对其进行精确的 定量。过去对肿瘤标志物的检测主要用放射免疫分析法，这种方法存在诸多缺点，如操作复 杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等。因此，亟待发展一种新的 检测方法对血液中TM进行精确的定量分析。 化学发光免疫分析技术的出现使检测特异性不断提高，肿瘤诊断研究不断向深入 发展。过去主要是对单个肿瘤标志物检测，由于交叉反应与标志物特异性存在一定的差异， 因此在实际应用中受到了限制。近年来，人们通过多种TM同时检测，联合应用以期达到准 确诊断肿瘤的目的。 与传统检测方法相比，本发明可以同时对一份样本进行多个指标的检测；具有极 高的灵敏度和可靠性；检测成本低，利于大规模推广应用。本发明的反应与传统化学发光 法几乎一模一样，应用表面特殊处理的标准不透明96孔微孔板作为基质，保证了反应的方 便性与快捷性，兼容市场上通用的所有型号洗板机或全/半自动板式化学发光免疫分析系 统；解决了其它基于玻片或膜等的生物芯片反应步骤的手工操作过多且操作复杂、可重复 性差、均一性差等问题。
发明内容
本发明的目的是提供了简便、快捷、准确的同时检测多种肿瘤标志物的酶促化学 发光免疫分析定量测定试剂盒。 本发明是由96孔位的支撑架及放置其上的可拆卸的不透明微孔板条组成，其中， 每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗体，检测同一个肿瘤标志物，可以同时检 测3-8种肿瘤标志物。 本发明精心设计的96孔板酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒，高度灵敏和 特异，操作简便快速，可在短时间内同时检测3-8种肿瘤标志物的含量，费用低廉，适用于肿瘤高危人群或肿瘤高发地区体检时多种肿瘤的辅助性初筛。它具有特异性高、准确性高、 灵敏、简便快速等优点。本发明特别适合肿瘤医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一 种非常有价值的检测手段。 本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替 酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，
比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约io倍，并且多种肿瘤同时检测，提高了肿瘤诊断
的特异性和准确性，可为肿瘤疾病的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。
图1本发明实施例1、2的结构示意图。
图2本发明实施例3-8的结构示意图。
图3本发明实施例9、10的结构示意图。
具体实施例方式
实施例1制备同时检测前列腺癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒
—、酶标记物制备 用改良的过碘酸钠氧化法标记前列腺特异性抗原(PSA)、复合前列腺特异性抗原 (cPSA)、游离前列腺特异性抗原(fPSA)三种单克隆抗体。 酶标记物稀释液配制称量12. 12g的Tris，9g NaCl， 200mL新生牛血清，0. 5mL Tween 20和lmL Proclin 300，将上述试剂称量好放入洁净容器中，调pH值7. 0 7. 5加 双蒸水至1L，溶解混匀。 分别采用棋盘实验选择三种酶标记物的工作浓度。每个产品分装一瓶，共分装三 瓶。 二、肿瘤标志物复合校准品的制备 用前列腺特异性抗原(PSA)、细胞角蛋白19(Cyfra21-1)、甲胎蛋白(AFP)、癌
胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、肿瘤相关抗原19-9(CA19-9)、肿瘤相关抗
原153(CA15-3)、肿瘤相关抗原72-4(CA72-4)、肿瘤相关抗原125 (CA125)、肿瘤相关抗原
50(CA50)、胃泌素释放肽前体(ProGRP)、铁蛋白(Fer)、组织多肽特异性抗原(TPS)、磷脂酰
肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)纯品配制成低(正常判断值附近)、高两个浓度肿瘤标志物复合校
准品，分装，2mL/瓶。 三、固相反应条的制备 如图1所示，在反应条1-3上的反应孔中包被上PSA单克隆抗体
四、化学发光底物液 化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0. 3mM 4_羟基联苯、0. 05mM 4-碘苯硼酸、 0. 2M pH8. 7硼酸-硼砂缓冲液，其pH值为8. 0 10. 0 ; 化学发光底物B液，包括3. 5mM过氧化脲、0. 1 % Tween20、0. 2M pH7. 2磷酸盐缓冲 液，其pH值为7. 0 7. 6。
五、20倍洗涤液 称量24g Tris，4g的KC1， 160g NaCl于洁净容器中，加双蒸水至1L，溶解混匀，调整PH至7. 4。 六、半成品及成品组成 上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定 性检定合格才能组装成同时检测前列腺癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒。组装 成试剂盒后需抽检合格后才能出厂。 实施例2制备同时检测大肠癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记CEA、 CA19-9、 CA72-4三种单克隆抗体作为酶标
记物、如图1所示，在反应条1-3上的反应孔中依次分别包被上CEA单克隆抗体、CA19-9单
克隆抗体、CA72-4单克隆抗体外，其余均以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。 实施例3制备同时检测肺癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记Cyfra21-l、NSE、CEA、ProGRP四种单克隆抗体作
为酶标记物、如图2所示，在反应条l-4上的反应孔中依次分别包被上Cyfra21-1单克隆抗
体、NSE单克隆抗体、CEA单克隆抗体、ProGRP单克隆抗体外，其余均以与实施例1相同的方
法制备该试剂盒。 实施例4制备同时检测胃癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记CEA、 CA19-9、 CA72-4、 Cyfra21-1四种单克隆抗
体作为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上CEA单克隆抗
体、CA19-9单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、Cyfra21-1单克隆抗体外，其余均以与实施例
l相同的方法制备该试剂盒。 实施例5制备同时检测肝癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记AFP、 CA19-9、 Fer、 GPC3四种单克隆抗体作为酶
标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上AFP单克隆抗体、CA19-9
单克隆抗体、Fer单克隆抗体、GPC3单克隆抗体外，其余均以与实施例l相同的方法制备该
试剂盒。 实施例6制备同时检测胰腺癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒
除用改良的过碘酸钠氧化法标记CEA、 CA19-9、 CA242、 CA50四种单克隆抗体作 为酶标记物、如图2所示，在反应条l-4上的反应孔中依次分别包被上CEA单克隆抗体、 CA19-9单克隆抗体、CA242单克隆抗体、CA50单克隆抗体外，其余均以与实施例1相同的方 法制备该试剂盒。 实施例7制备同时检测卵巢癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒
除用改良的过碘酸钠氧化法标记CA125、 CA153、 CA72_4、 AFP四种单克隆抗体作 为酶标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上CA125单克隆抗体、 CA153单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、AFP单克隆抗体外，其余均以与实施例1相同的方 法制备该试剂盒。 实施例8制备同时检测乳腺癌的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒
除用改良的过碘酸钠氧化法标记CA153、CEA、CA72-4、TPS四种单克隆抗体作为酶 标记物、如图2所示，在反应条1-4上的反应孔中依次分别包被上CA153单克隆抗体、CEA单 克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、TPS单克隆抗体外，其余均以与实施例l相同的方法制备该 试剂盒。
5
实施例9制备同时检测男性8项的肿瘤标志物酶促化学发光免疫分析定量测定试 剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记Cyfra21-1 、 AFP、 CEA、 NSE、 CA19-9、 PSA、 CA72-4、 CA125八种单克隆抗体作为酶标记物、如图3所示，在反应条1-8上的反应孔中依次分别包 被上Cyfra21-1单克隆抗体、AFP单克隆抗体、CEA单克隆抗体、NSE单克隆抗体、CA19-9单 克隆抗体、PSA单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、CA125单克隆抗体外，其余均以与实施例1 相同的方法制备该试剂盒。 实施例10制备同时检测女性8项的肿瘤标志物酶促化学发光免疫分析定量测定 试剂盒 除用改良的过碘酸钠氧化法标记Cyfra21-1、 AFP、 CEA、 NSE、 CA19-9、 CA153、 CA72-4、 CA125八种单克隆抗体作为酶标记物、如图3所示，在反应条1_8上的反应孔中依 次分别包被上Cyfra21-1单克隆抗体、AFP单克隆抗体、CEA单克隆抗体、NSE单克隆抗体、 CA19-9单克隆抗体、CA153单克隆抗体、CA72-4单克隆抗体、CA125单克隆抗体外，其余均 以与实施例1相同的方法制备该试剂盒。
权利要求
一种同时检测多种肿瘤标志物的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括辣根过氧化物酶标记的多种肿瘤标志物的单克隆抗体；包被有多种肿瘤标志物的单克隆抗体的微孔板；多种肿瘤标志物校准品和洗涤液；以及上述酶所作用的化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的微孔板为每12孔为一个反应条， 每个反应条负载相同的抗体，检测同一个肿瘤标志物，可以在一块微孔板上同时检测3-8 种肿瘤标志物。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述同时检测3-8种肿瘤标志物包括同 时检测前列腺癌的3种肿瘤标志物；同时检测大肠癌的3种肿瘤标志物；同时检测肺癌的4 种肿瘤标志物；同时检测胃癌的4种肿瘤标志物；同时检测肝癌的4种肿瘤标志物；同时检 测胰腺癌的4种肿瘤标志物；同时检测卵巢癌的4种肿瘤标志物；同时检测卵巢癌的4种肿 瘤标志物；同时检测男性8项的肿瘤标志物；同时检测女性8项的肿瘤标志物。
4. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测前列腺癌的3种肿瘤标 志物为前列腺特异性抗原、复合前列腺特异性抗原、游离前列腺特异性抗原。
5. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测大肠癌的3种肿瘤标志 物为癌胚抗原、肿瘤相关抗原19-9、肿瘤相关抗原72-4。
6. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测肺癌的4种肿瘤标志物 为细胞角蛋白19、神经元特异性烯醇化酶、癌胚抗原、胃泌素释放肽前体。
7. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测胃癌的4种肿瘤标志物 为癌胚抗原、肿瘤相关抗原19-9、肿瘤相关抗原72-4、细胞角蛋白19。
8. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测肝癌的4种肿瘤标志物 为甲胎蛋白、肿瘤相关抗原19-9、铁蛋白、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3。
9. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测胰腺癌的4种肿瘤标志 物为癌胚抗原、肿瘤相关抗原19-9、肿瘤相关抗原242、肿瘤相关抗原50。
10. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测卵巢癌的4种肿瘤标 志物为肿瘤相关抗原125、肿瘤相关抗原153、肿瘤相关抗原72-4、甲胎蛋白。
11. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测乳腺巢癌的4种肿瘤 标志物为肿瘤相关抗原153、癌胚抗原、肿瘤相关抗原72-4、组织多肽特异性抗原。
12. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测男性8项的肿瘤标志 物为细胞角蛋白19、甲胎蛋白、癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶、肿瘤相关抗原19-9、前 列腺特异性抗原、肿瘤相关抗原72-4、肿瘤相关抗原125。
13. 如权利要求3所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述同时检测女性8项的肿瘤标志 物为细胞角蛋白19、甲胎蛋白、癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶、肿瘤相关抗原19-9、肿 瘤相关抗原153、肿瘤相关抗原72-4、肿瘤相关抗原125。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测多种肿瘤标志物的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒。本发明所提供的检测多种肿瘤标志物的酶促化学发光免疫分析定量测定试剂盒包括多种肿瘤标志物的单克隆抗体酶标记物；多种肿瘤标志物的单克隆抗体包被微孔板；多种肿瘤标志物复合校准品；化学发光底物和洗涤液。其包被微孔板的特征在于每12孔为一个反应条，每个反应条负载相同的抗体，检测同一个肿瘤标志物，可以同时检测3-8种肿瘤标志物。本发明能简便、快速、准确的同时联合检测多种肿瘤标志物，它使同时检测多种肿瘤标志物的费用降低，更易推广。
文档编号G01N33/577GK101750497SQ20081024012
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者唐宝军, 宋胜利, 应希堂, 张坤, 胡国茂, 郑金来 申请人:北京科美东雅生物技术有限公司