专利名称：一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种疟疾快速检测装置，特别涉及一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸， 属于胶体金快速检测领域。
背景技术：
疟疾是疟原虫寄生于人体所引起的传染病，经疟蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染，可向各 年龄的人传播。如未及时进行治疗，疟疾可引起通常致命的严重疾病临床上以周期性定时性发作的寒 战、高热、出汗退热，以及贫血和脾大为特点。因原虫株、感染程度、免疫状况和机体反应性等差异， 临床症状和发作规律表现不一。寄生于人体的疟原虫有四种恶性疟原虫(P. falciparum)、间日疟原 虫(P. vivax)、三日疟原虫(P. malarial)和卵形疟原虫(P. ovale),不同的疟原虫分别引起间日疟、三 日疟、恶性疟及卵圆疟。最常见的是恶性疟原虫和间日疟原虫。恶性疟原虫是到目前为止最致命的一 种疟疾感染。
症疾在世界上分布广泛，据世界卫生组织统计，目前有92个国家和地区处于高度和中度流行， 每年发病人数为1.5亿，死于疟疾者愈200万人。大多数病例和死亡发生在撒哈拉以南非洲，但是， 亚洲、拉丁美洲、中东以及欧洲部分地区也受到影响。从无疟疾地区到有疟疾传播地区的人群免疫力 极其脆弱，通常面临延迟或错误的疟疾诊断。
及早、快速准确的诊断是疟疾预防和治疗的关键。传统的诊断方法是通过血涂片显微镜检査来判 断病人是否感染疟原虫，这种方法简便、经济、准确率高，缺点是结果判断受检验人员镜检水平和视 力疲劳程度等因素的影响，易导致误诊和漏检，且检査效率不高，不适于大规模现场调査及短时间内 处理大批量样本。随着免疫诊断技术和单克隆抗体技术的发展，疟疾诊断技术不断创新，包括酶联免 疫吸附法、聚合酶链式反应法等，上述方法各有所长，但都需专用仪器、专业人员操作，且价格昂贵， 仍不适于疟疾高发地区的大规模现场调査。
将胶体金免疫分析法引入疟原虫检测为疟疾的快速诊断提供了一个新的分析检测途径。专利 200610165288.3 —种检测症原虫的免疫层析试纸及其制备方法，是以重组疟原虫乳酸脱氢酶为抗原免 疫动物获得多抗，该法采用多抗免疫获得抗抗体，应用的方法是双多抗夹心法。本实用新型是用灭活 的恶性疟原虫病原体直接免疫小鼠，获得针对恶性疟病原体不同位点的配对的单克隆抗体，从而实现 双抗夹心原理制成试纸，特异性强、灵敏度高，适用于大规模现场检测。 发明内容
本实用新型针对上述存在的一些问题，提供了一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸。为解决上述技术问题，本实用新型是通过以下技术方案实现的 一种快速检测恶性疟的胶体金免 疫层析试纸，是由底板、吸水板、硝酸纤维素膜、恶性疟原虫单克隆抗体金标垫、样品吸液层组成， 底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，在底板一 端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和恶性疟原虫单克隆抗 体金标垫相互交叠连接，在恶性疟原虫单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。
其中，试验线由恶性疟原虫单克隆抗体I包被，控制线是由羊抗鼠多克隆抗体包被而成。金标垫 由恶性疟原虫单克隆抗体II作为胶体金标记。
样品吸液层由三层材料叠加组成，第一层为一定规格无纺布层、第二层为玻璃纤维层、第三层为 一定规格无纺布层。
配对的恶性疟原虫单克隆抗体的建立是以灭活的恶性疟原虫病原体直接免疫BALB/c小鼠，用 SP2/0细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水，提取小鼠腹水 纯化筛选，获得能同时与恶性柜原虫不同位点结合的两种疟原虫单克隆抗体I、 H,其中抗体I用于 包被硝酸纤维素膜上试验线，另一株种抗体H用于标记单克隆抗体金标垫，实现胶体金双抗夹心法。
检测时，血液样本经蒸馏水或皂素裂解，把检测试纸的样品吸液层端放入样本中(液面不得超过 MAX),或向板式试剂盒加样口滴加样品，由于毛细管作用样品将沿着试纸条吸水层端移动，当移动 至恶性疟原虫单克隆抗体II金标垫时，样品中的恶性疟原虫与恶性疟原虫单克隆抗体金标探针发生特 异结合，当移动至固定有恶性疟原虫单克隆抗体I试验线时，样品中的恶性疟原虫又与试验线中的症 原虫单克隆抗体I相结合，因此其胶体金滞留于试验线上，试验线处显示红色为阳性；相反如果样品 中没有感染恶性疟原虫，恶性疟原虫单克隆抗体金标探针就不会与试验线上的恶性疟原虫单克隆抗体 I发生特异结合，没有胶体金滞留，即仅有一条红色控制线为阴性，这就是双抗夹心法原理。根据此 原理，两条线为阳性，一条线为阴性得出判断。
当移动至羊抗鼠多克隆抗体控制线时，无论样品中有无感染恶性疟原虫，标记的金标探针都会与 己设定好的羊抗鼠多克隆抗体结合滞留，使控制线显示红色。因此控制线无色带产生则代表操作有误, 检測时样品液面超过MAX线或试纸已经过期。
由于采用上述技术方案，本实用新型所提供的一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸具有这 样的有益效果，即特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。
图l为检测试纸的主视结构图2为检测试纸的侧视结构图3为阴性结果图图4为阳性结果图。
图中1、吸水板，2、硝酸纤维素膜，3、羊抗鼠多克隆抗体控制线，4、试验线，5、单克隆抗体 金标垫，6、样品吸液层，7、底板，8、 MAX线。 具体实施例
根据图l、图2所示，本实用新型为一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸，是由底板(7)、 吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、恶性疟原虫单克隆抗体金标垫(5)、样品吸液层(6)组成，底板 中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3),底板一端 端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和恶性疟原虫单克隆抗体 金标垫相互交叠连接，在恶性疟原虫单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。
1. 经细胞培养方法获得恶性疟病原体，灭活备用。
2. 疟原虫配对单克隆抗体的制备
(1) 用重组的恶性疟原虫抗原免疫BALB/c小鼠。用SP20细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细 胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水。
(2) 提取小鼠腹水纯化筛选，获得能同时与恶性疟原虫不同位点结合的两种恶性疟原虫单克隆 抗体i、 n,抗体I用于包被硝酸纤维素膜上试验线，抗体II可用于双抗夹心法的胶体金标 记。
3. 胶体金的制备及与疟原虫单克隆抗体的结合
(1) 取双蒸水加适量的氯金酸磁力搅拌加温到90 95C加入适量枸橼酸三纳继续加热搅拌至 沸腾5分钟，冷却后避光保存备用。
(2) 把恶性疟原虫单克隆抗体标记的胶体金液，吸附纤维材料上，干燥后备用。
4. 制膜机制膜利用电脑控制传动速度，保证每单位膜上包被的抗体量相等。
5. 试纸条组合按公知技术组合。
6. 使用方法检测时，血液样本经蒸馏水或皂素裂解，把检测试纸的样品吸液层端放入样本中(液 面不得超过MAX线)，或向板式试剂盒加样口滴加样品，l分钟后取出试纸平放，由于毛细管和虹吸作 用样品将沿着试纸条吸水层端移动，5分钟时观察结果。
7. 结果判断两条红色线时为阳性；只有一条红色控制线时为阴性。
权利要求1. 一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纤维素膜(2)、恶性疟原虫单克隆抗体金标垫(5)、样品吸液层(6)组成，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条试验线(4)和一条多克隆抗体控制线(3)，底板一端端头为吸水板，另一端端头为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水板和恶性疟原虫单克隆抗体金标垫相互交叠连接，在恶性疟原虫单克隆抗体金标垫上压有样品吸液层。
2. 根据权利要求1所述的一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸，其特征在于硝酸纤维素膜上 有两条线， 一条由恶性症原虫单克隆抗体I包被的试验线和一条多克隆抗体控制线。
3. 根据权利要求1所述的一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸，其特征在于金标垫是由恶性 疟原虫单克隆抗体II作为胶体金标记。
4. 根据权利要求1所述的一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸，其特征在于控制线是由羊抗 鼠多克隆抗体包被而成。
5. 根据权利要求1所述的一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸，其特征在于样品吸液层由三 层材料叠加组成，第一层为一定规格无纺布层、第二层为玻璃纤维层、第三层为一定规格无纺布 层。
专利摘要一种快速检测恶性疟的胶体金免疫层析试纸，底板中部为硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上有一条疟原虫单克隆抗体I试验线和一条羊抗鼠多克隆抗体控制线，底板一端为吸水层，另一端为样品吸液层，硝酸纤维素膜两端分别与吸水层和金标垫相互交叠连接，在金标垫上压有样品吸液层。以灭活的恶性疟原虫病原体直接免疫BALB/c小鼠，用SP2/0细胞融合建立瘤株进行筛选，取瘤细胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其产生腹水，提取小鼠腹水纯化筛选，获得能同时与恶性疟原虫不同位点结合的两种疟原虫单克隆抗体I、II，其中抗体I用于包被硝酸纤维素膜上试验线，另一株种抗体II用于标记单克隆抗体金标垫。本装置特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门技术人员操作，而且结果易读。
文档编号G01N33/577GK201269878SQ200820122568
公开日2009年7月8日 申请日期2008年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者万积成 申请人:万积成