专利名称：生物分子检测方法及生物分子检测用芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种使用可与生物分子结合的电化学活性物质(氧化还原试剂)电化学检测生物分子的方法以及用于该方法的生物分子检测用芯片。
本申请要求2007年2月6日提出的日本国专利申请2007-27222号申请的优先权，该申请的内容全部引用于本申请中。
背景技术：
近年来，在医疗、食品卫生、环境保护的领域中，要求能够低成本且简便快速地分析基因或蛋白质等的生物分子的技术。现有技术中，广泛利用使用荧光试剂的生物分子传感器，其中，包括DNA传感的光学检测法。但是，在该技术中，需要使用昂贵的荧光试剂或荧光检测机构，因此，不能抑制成本增大，而且，需要进行控制在固相上固定目标生物分子的捕捉分子而进行的前处理以及固相反应，因而，有不能进行简便快速的分析的问题。
另一方面，已提出了使用可与生物分子结合的电化学活性物质(氧化还原试剂)电化学检测生物分子的方法以及用于该方法的生物分子检测用芯片。该电化学检测法，不需要昂贵的试剂，反应操作也比较简便，因而，期待其在POC(即时检验(Point of care))领域的应用。
在专利文献1中，记载了一种检测试样溶液中的基因的方法，其是通过在试样溶液中添加对双链DNA特异结合的电化学活性试剂，测定其电化学应答(溶液电阻的变化)而进行检测的方法。更详细地，作为电化学活性试剂(氧化还原试剂)使用烟酸己可碱33258(Hoechst33258)(小型凹槽结合物(miner groove binder))，制作在包含对象基因的被检试样中添加有电化学活性试剂以及基因结合反应用试剂的混合溶液，比较该混合溶液的基因合成反应前的电阻和基因合成反应后的电阻，由此，即使是低浓度包含目标基因的试样溶液，也能够确实地检测目标基因。
专利文献1专利第3511596号公报
发明内容
发明要解决的课题 但是，上述的专利文献1中记载的基因检测方法中，采用进行基因合成反应(核酸扩增反应)前的混合溶液的电化学测定和基因合成反应后的电化学测定，然后比较各自的测定结果的操作顺序(参照专利文献1第0026段)，因此，需要准备两套贵重的试样或昂贵的试剂，增大了成本，而且，在刚一进行制备用于基因合成反应的混合溶液时反应就有可能进行的等温合成反应体系中，例如NASBA(核酸序列依赖性扩增(Nucleic Acid Sequence BasedAmplification))法、ICAN法(等温的和嵌合引物起始的核酸扩增(Isothermaland Chimeric Primer initiated Amplification of Nucleic Acids))、LAMP法(环媒恒温扩增(Loop mediated Isothermal Amplification))等中，基因合成反应前的混合溶液并非一直不变，在该情形下，在基因合成反应前后的测定结果的比较中，不能进行正确的判断。另外，上述的专利文献1中记载的基因检测方法中，由于混合溶液中含有的杂质等导致在测定电化学应答的传感器部等中产生异常，在该情形下，由于不能从测定结果检测出异常，因而也不能进行可靠性高的基因检测。
本发明，是考虑上述实情而做出的发明。本发明的目的是，提供一种能够低成本且可靠性高的进行电化学检测生物分子的方法以及用于该方法的生物分子检测用芯片。
解决课题的方法 对于上述要解决的课题进行锐意研究的结果是，本发明人发现，通过比较含有电化学活性物质不含有生物分子的基准溶液和电化学活性物质与生物分子反应后的被检溶液之间的电化学应答，能够与上述现有技术同样地进行生物分子的检测，另外，在进行刚一进行制备混合溶液时反应就有可能进行的等温合成反应(NASBA法、ICAN法、LAMP法)的情形，也能够进行正确的比较，从而，完成了本发明。
即，本发明提供一种生物分子检测方法，其是通过电化学应答测定来检测作为检测对象的生物分子的生物分子检测方法，其特征在于，包括基准溶液测定步骤，该步骤测定基准溶液的电化学应答，该基准溶液包含对于作为检测对象的生物分子具有直接或间接结合性的电化学活性物质；被检溶液制备步骤，该步骤在上述基准溶液测定步骤测定结束的上述基准溶液中添加包含上述作为检测对象的生物分子的被检试样，制备被检溶液；被检溶液测定步骤，该步骤测定上述被检溶液的电化学应答；比较步骤，该步骤比较上述基准溶液的电化学应答的测定结果和上述被检溶液的电化学应答的测定结果，导出比较结果；生物分子含有信息检测步骤，该步骤根据上述比较结果，检测上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子的含有信息。
本发明还提供一种生物分子检测方法，其是通过电化学应答测定来检测作为检测对象的生物分子的生物分子检测方法，其特征在于，包括基准溶液测定步骤，该步骤测定基准溶液的电化学应答，该基准溶液包含对于作为检测对象的生物分子具有直接或间接结合性的电化学活性物质；被检溶液制备步骤，该步骤在上述基准溶液测定步骤测定结束的上述基准溶液中添加包含上述作为检测对象的生物分子的被检试样，制备被检溶液；被检溶液测定步骤，该步骤测定上述被检溶液的电化学应答；比较步骤，该步骤比较上述基准溶液的电化学应答的测定结果和上述被检溶液的电化学应答的测定结果，导出比较结果；生物分子含有信息检测步骤，该步骤根据上述比较结果，检测上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子的含有信息。
根据本发明的生物分子检测方法，不需要准备两套包含贵重的试样和昂贵的试剂的溶液，因此，与现有技术的生物分子检测方法相比，能够降低检测成本。另外，在刚一进行制备混合溶液时反应就有可能进行的等温合成反应(NASBA法、ICAN法、LAMP法)的情形下，也可通过设计基准溶液进行正确的比较。
另外，根据本发明的生物分子检测方法，能够不必经过扩增作为检测对象的生物分子的步骤进行测定，因此，可快速且低成本地进行测定，能够应用于包括不适宜扩增的分子或没有必要扩增的情形的宽广范围的对象分子。
本发明的生物分子检测方法，可以是上述被检溶液，由上述作为检测对象的生物分子的浓度未知的两种以上的上述被检溶液构成；上述被检溶液测定步骤，包含未知浓度的两种以上的上述被检溶液的各自的上述电化学应答的测定；上述比较步骤，是相对比较上述基准溶液的上述电化学应答的测定结果和各上述被检溶液的上述电化学应答的测定结果，导出比较结果的步骤；上述生物分子含有信息检测步骤，是根据上述比较结果，检测各上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子的含有信息的步骤。
本发明的生物分子检测方法，可以是在上述被检溶液测定步骤之后，包含第2基准溶液测定步骤，该步骤测定上述基准溶液或与上述基准溶液具有相同组成的基准溶液的电化学应答；校正步骤，该步骤根据比较上述基准溶液测定步骤的测定结果和上述第2基准溶液测定步骤的测定结果的结果，进行上述电化学应答测定的校正。
根据上述方法，在进行生物分子检测之后，通过在相同反应槽内进行使用含有电化学活性物质的基准溶液的电化学测定，可进行校准，因此，能够检测传感器部等的异常，能够进行可靠性高的检测。
本发明的生物分子检测方法，可以是在上述被检溶液测定步骤之后，包括第2基准溶液测定步骤，该步骤测定上述基准溶液或与上述基准溶液具有相同组成的基准溶液的电化学应答；异常检测步骤，该步骤根据比较上述基准溶液测定步骤的测定结果和上述第2基准溶液测定步骤的测定结果的结果，检测电化学应答的测定装置的异常。
根据上述方法，在进行生物分子检测之后，通过在相同反应槽内进行使用含有电化学活性物质的基准溶液的电化学测定，可进行校准，因此，能够检测传感器部等的异常，能够进行可靠性高的检测。
本发明的生物分子检测方法，可以是对于试样进行使该作为检测对象的生物分子直接或间接地扩增和/或变性的反应，得到上述被检试样。
即使是微量含有作为检测对象的生物分子的试样，通过PCR反应等进行扩增，也可能够检测。另外，也可通过使双链核酸链变成单链等的变性而使检测容易地进行。
本发明的生物分子检测方法中，上述被检溶液也可包含多种上述作为检测对象的生物分子以及多种上述电化学活性物质。另外，上述基准溶液也可包含多种上述电化学活性物质。
电化学应答的测定中，测定溶液的电流值以及电压值。此时，通过电化学活性物质(氧化还原试剂)的特性，在特异的电压区域(电位区域)上显示电流峰值。因此，例如，只要是使用对多种不同的生物分子分别特异地结合并且具有分别特有的电位活性的电化学活性物质，在各生物分子上显示特异的电流峰值，通过此时的电位区域，可进行定性。另外，通过此时的电流值，也可进行定量。即，可通过一次测定同时检测多种不同的作为检测对象的生物分子的含有信息。
本发明的生物分子检测方法中，上述基准溶液测定步骤或被检溶液测定步骤中的电化学应答的测定，也可是基准溶液或被检溶液的扩散电流值的测定。
另外，上述电化学活性物质，可以是从FND(二茂铁基萘四甲酰二亚胺(Ferrocenyl naphthalene diimide))、烟酸己可碱(Hoechst)(包括烟酸己可碱33258、烟酸己可碱33342等)、偏端霉素(Distamycin)、核黄(Nuclearyellow)、DAPI(4’，6-二甲脒基-2-苯基吲哚(4’，6-diamidino-2-phenylindole))、重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐(Berenil)、亚甲蓝(Methylene blue)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、道诺霉素(Daunomycin)、溴化乙啶(Ethidium bromide)、碘化丙碇(Propidium iodide)、9-氨吖啶(9-Aminoacridine)、椭圆玫瑰树碱(Ellipticine)、安吖啶(Amsacrine)、羟胺硫蒽酮(Hycanthone)、放线菌素D(Actinomycin D)、色霉素(Chromomycin)、光辉霉素(MithramycinA)、棘霉素(Echinomycin)、奎吖因(Quinacrine)、诺加霉素(Nogalamycin)、原黄素(Proflavine)、阿米洛利(Amiloride)、三甲补骨脂内酯(Trioxalen)、氯喹(Chloroquine)所组成的组中选出的一种物质。
另外，本发明的生物分子检测方法中，既可是以具有电荷或负电性的分子作为检测对象，也可是以单链或双链的核酸、蛋白质、脂质、糖质作为检测对象。
另外，本发明的生物分子检测方法，其特征也在于，根据基准溶液与被检溶液的测定结果的比较，能够相对地定量评价含有未知浓度的同种生物分子的其他的被检溶液。这些方法，也可应用于碱基变异检测，例如、LAMP法、UCAN法、ASP(Allele Specific Primer)法等，识别碱基变异，产生核酸链扩增，因此，根据基因变异的有无，其扩增量不同。因此，比较测定含有扩增正常基因的试样的被检溶液与基准溶液，测定含有扩增反应未知的基因的试样的被检溶液，相对评价先前的比较测定结果，由此，可判别未知的基因是正常的基因还是发生变异的基因。
另外，基准溶液以及被检溶液的电化学应答的测定，既可使用相同的电极进行检测，也可使用不同的电极进行检测，进一步地，也可进行复数次检测。测定方法，可利用由对电极以及作用电极两根电极构成的两电极法、上述两根电极以及参照电极构成的三电极法、上述三电极法中的对电极以及作用电极构成电场晶体管(transistor)的电检测法等。
另外，本发明还提供一种生物高分子检测用芯片，其是通过电化学应答测定来检测作为检测对象的生物分子的生物分子检测用芯片，其特征在于，具有腔室，该腔室可收容基准溶液或被检溶液，该基准溶液包含对上述作为检测对象的生物分子具有结合性的电化学活性物质，该被检溶液包含被检试样和上述电化学活性物质，该被检试样可能含有上述作为检测对象的生物分子；送液装置，该送液装置向上述腔室输送上述基准溶液或上述被检溶液；电化学应答测定装置，该电化学应答测定装置测定上述腔室中收容的上述基准溶液或上述被检溶液的电化学应答；排液装置，该排液装置从上述腔室排出上述基准溶液或上述被检溶液。
根据上述的生物高分子检测用芯片，能够依次将基准溶液和被检溶液输送至同一腔室，测定电化学应答，进行比较，因此，能够快速且便宜地检测作为检测对象的生物分子。
另外，本发明的生物高分子检测用芯片中，上述腔室，也可进一步具有使上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子扩增或变性的扩增变性装置。
另外，上述扩增变性装置可以是温度调节装置。
根据上述的构成，通过使作为检测对象的生物分子扩增或变性，能够提高检测的灵敏度。
图1A是说明本发明的生物分子检测方法的原理的图形。
图1B是说明本发明的生物分子检测方法的原理的图形。
图2是表示本发明的生物分子检测方法的实验结果的图形，表示单链寡DNA浓度与FND扩散电流值的关系。
图3A是表示本发明的生物分子检测方法的实验结果的图形，表示人类基因组DNA分子数与FND扩散电流值的关系。
图3B是表示本发明的生物分子检测方法的实验结果的图形，表示人类基因组DNA分子数与FND扩散电流值变化率的关系。
图4A是表示本发明的生物分子检测方法的实验结果的图形，表示通过FND扩散电流得出的基因检测的结果。
图4B是表示本发明的生物分子检测方法的实验结果的图形，表示通过FND扩散电流得出的基因检测的结果。
图5A是表示本发明的生物分子检测方法的实验结果的图形，表示通过FND扩散电流得出的基因检测的结果。
图5B是表示本发明的生物分子检测方法的实验结果的图形，表示通过FND扩散电流得出的基因检测的结果。
具体实施例方式 下面，参照附图，详细地说明实施本发明的生物分子检测方法以及生物分子检测用芯片的一实施方式。图1A～图5B是例示本发明的实施方式的图形，这些附图中，使用相同符号的部分表示相同物体，其基本的构成以及动作相同。
本发明的生物分子检测方法的原理如下所述。
在如图1A所示的具有电极传感器部的反应槽内，填充作为基准溶液的含有能够与对象生物分子结合的氧化还原试剂的电解溶剂，扫描电压，进行电流测定。由此，氧化还原试剂在电解溶剂中几乎均匀地扩散，因此，能够测定相应于氧化还原试剂的浓度的扩散电流。
另一方面，如图1B所示，在上述同样的反应槽内存在对象生物分子的情形，氧化还原试剂被该生物分子捕捉，因此，形成氧化还原试剂在电解溶剂中不均匀扩散的状态。此时，与图1A所示的状态相比，在电极传感器部附近存在的氧化还原试剂的量减少，因此，扫描电压，进行电流测定，能够测定比相应于氧化还原试剂的浓度的扩散电流低的电流值(电化学应答的测定)。
因此，本发明的生物分子检测方法中，首先，测定反应槽内含有氧化还原试剂(电化学活性物质)的电解溶剂的扩散电流值，即填充基准溶液的扩散电流值(基准溶液测定步骤)；接下来，测定在反应槽内含有检测对象试样(被检试样)以及氧化还原试剂的电解溶剂的扩散电流值，即填充被检溶液的扩散电流值(被检溶液测定步骤)；接下来，比较两测定值的差异(比较步骤)；根据该比较结果，能够获知生物分子的有无以及存在量(浓度)(生物分子含有信息检测步骤)。
另外，上述的生物分子检测方法，也可是在基准溶液测定步骤结束之后，在该基准溶液测定步骤中使用的基准溶液中，添加检测对象试样，制备被检溶液(被检溶液制备步骤)。
另外，对象试样中含有的生物分子的量少的情形下，可利用扩增反应(例如，目标生物分子是核酸的情形，可举出LAMP法、ICAN法、PCR法、NASBA法等)。该情形下，对于含有氧化还原试剂的电解溶剂和含有氧化还原试剂、扩增反应试剂、对象试样的电解溶剂，进行测定扩散电流值，比较两测定值，由此，能够进行生物分子的检测。另外，在这些测定后，也可，再次测定含有氧化还原试剂的电解溶剂的扩散电流值(第2基准溶液测定步骤)、与先前对于同样的电解溶剂测定的扩散电流值进行比较，由此，可进行电极传感器的校准(校正步骤)或异常检测(异常检测步骤)。
本发明的生物分子检测方法中，作为生物分子使用核酸的情形下，使用的电化学活性物质，只要是直接或间接与核酸结合的物质即可，没有特别限定，例如、可使用FND(二茂铁基萘四甲酰二亚胺(Ferrocenyl naphthalenediimide))、烟酸己可碱(Hoechst)(包括烟酸己可碱33258、烟酸己可碱33342等)、偏端霉素(Distamycin)、核黄(Nuclear yellow)、DAPI(4’，6-二甲脒基-2-苯基吲哚)、重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐(Berenil)、亚甲蓝(Methylene blue)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、道诺霉素(Daunomycin)、溴化乙啶(Ethidium bromide)、碘化丙碇(Propidium iodide)、9-氨吖啶(9-Aminoacridine)、椭圆玫瑰树碱(Ellipticine)、安吖啶(Amsacrine)、羟胺硫蒽酮(Hycanthone)、放线菌素D (Actinomycin D)、色霉素(Chromomycin)、光辉霉素(Mithramycin A)、棘霉素(Echinomycin)、奎吖因(Quinacrine)、诺加霉素(Nogalamycin)、原黄素(Proflavine)、阿米洛利(Amiloride)、三甲补骨脂内酯(Trioxalen)、氯喹(Chloroquine)等。其中，特别优选使用FND或烟酸己可碱33258。
实施例1 作为上述的本发明的生物分子检测方法的实施例，进行下述的实验。
＜电极制备＞ 用金刚石(4～6μm金刚石浆料)研磨单电极(金电极/直径lmm/BAS社制造)的电极表面，接下来，使用ALS650(BAS社制造)，在硫酸水溶液中，进行电解研磨(循环伏安法(サィクリック·ボルタンメトリ一))。研磨结束后，用蒸留水进行流水清洗干净。在该电极表面上，滴下巯基己醇溶液2μL，放入保湿箱，培育(Incubation)2小时。电极，在使用之前用蒸留水进行流水清洗干净，用于实验。
＜FND溶液制备＞ 在二茂铁基萘四甲酰二亚胺中添加醋酸，搅拌溶解，在该溶液中添加醋酸钾、氯化钾，进行充分地搅拌溶解后，使用蒸留水制备成适当的浓度。
＜DPV测定＞ 测定环境测定器/ALS650(BAS社制造) 三电极法测定/作用电极＝单电极、对电极＝白金线、参照电极＝银·氯化银 测定条件DPV(差动脉冲伏安法(Differential Pulse Voltammetry)) 初期电位＝0mV、最终电位＝600mV、电位增加＝20mV、振幅＝50mV、脉冲宽度＝0.05sec、样品宽度＝0.0167sec、脉冲时间＝0.2sec、静止时间＝2sec、灵敏度＝1e-6A/V ＜实验1＞ 使用两根实施了屏蔽处理(电极制备)的单电极，使用DPV测定下述3种制备溶液(300μL)的FND扩散电流。
1.FND溶液270μL+DDW30μL 2.FND溶液270μL+10pmol/μL单链寡DNA(120mer)30μL 3.FND溶液270μL+100pmol/μL单链寡DNA(120mer)30μL DDW是指二次蒸留水(Double Distilled Water)。单链寡DNA是使用ォペロン社制造的单链寡DNA。
该实验结果示于图2。由该附图可确认，随着制备溶液中的单链寡DNA的浓度升高，扩散电流值有减少的倾向。
＜实验2＞ 使用两根实施了屏蔽处理的单电极，使用DPV测定下述8种制备溶液(300μL)的FND扩散电流。
1.FND溶液150μL+人类基因组DNA(0拷贝)溶液150μL 2.FND溶液150μL+人类基因组DNA(10拷贝)溶液150μL 3.FND溶液150μL+人类基因组DNA(102拷贝)溶液150μL 4.FND溶液150μL+人类基因组DNA(103拷贝)溶液150μL 5.FND溶液150μL+人类基因组DNA(104拷贝)溶液150μL 6.FND溶液150μL+人类基因组DNA(105拷贝)溶液150μL 7.FND溶液150μL+人类基因组DNA(106拷贝)溶液150μL 8.FND溶液150μL+人类基因组DNA(107拷贝)溶液150μL 人类基因组DNA溶液，是使用ロッシェ社制造的人类基因组DNA。
该实验结果示于图3A、3B。
图3B是表示将基因组DNA分子数为0拷贝的制备溶液的扩散电流值作为基准扩散电流值i0、各基因组分子数存在下的扩散电流值作为i时，通过下式算出的各制备溶液的扩散电流值变化率Δi(％)。
Δi(％)＝[(i0-i)/i0]×100 由这些附图可知，对于人类基因组DNA的浓度为10～105拷贝/300μL的制备溶液(上述2～6)测定的扩散电流值，与不含有人类基因组DNA的制备溶液的测定值几乎相同。另一方面可确认，对于人类基因组DNA的浓度为超过106拷贝/300μL的制备溶液(上述7，8)，扩散电流值随着浓度而减少。由此，可知通过本发明的生物分子检测方法检测人类基因组DNA时的检测极限。
＜实验3＞ 使用两根实施了屏蔽处理的单电极，使用DPV测定下述3种制备溶液(300μL)的FND扩散电流。
1.FND溶液270μL+DDW30μL 2.FND溶液270μL+PCR反应前溶液30μL 3.FND溶液270μL+PCR反应后溶液30μL PCR反应前溶液，是如下述制备作为扩增对象的人类基因组DNA以及PCR试剂的溶液。PCR反应后溶液，是对于该PCR反应前溶液在下述条件下进行PCR反应得到的溶液。
表1
该实验结果示于图4A、4B。另外，图4B表示以与图3B同样的方法算出的扩散电流值变化率Δi(％)。由这些附图可知，在FND溶液中添加PCR反应前溶液的制备溶液(上述2)的扩散电流值，与在FND溶液中添加蒸留水的制备溶液(上述1)的扩散电流值几乎相同。另一方面，可确认，与此相比，在FND溶液中添加PCR反应后溶液的制备溶液(上述3)的扩散电流值显著降低。由此，通过比较仅使用FND溶液的制备溶液的扩散电流值和在FND溶液中添加PCR反应后溶液的制备溶液的扩散电流值，可知，能够进行制备溶液中的对象生物分子的检测。
＜实验4＞ 使用一根实施了屏蔽处理的单电极，在水温下(4℃)使用DPV测定下述3种制备溶液(300μL)的FND扩散电流。
1.FND溶液200μL+DDW100μL 2.FND溶液200μL+200ng/L人类基因组DNA溶液100μL 3.FND溶液200μL+200ng/μL变性人类基因组DNA溶液100μL 上述1～3的制备溶液，分别在4℃下放置10分钟，然后，进行DPV测定。此处，在2的制备溶液中，使用双链人类基因组DNA。另一方面，3的制备溶液，是通过将含有与2相同的双链人类基因组DNA的溶液100μL，在95℃下加热5分钟，然后立刻，在冰水中浸渍3分钟实施急速冷却处理，然后，与200μL的FND溶液混合而获得。通过该处理，3的制备溶液中的人类基因组DNA变性成单链。
该实验结果示于图5A、5B。图5B是表示以与图3B同样的方法算出的扩散电流值变化率Δi(％)。由这些附图可确认，与在FND溶液中添加蒸留水的制备溶液(上述1)相比，含有人类基因组DNA、变性人类基因组DNA溶液的制备溶液(上述2，3)，扩散电流值变低，进一步地，与含有双链人类基因组DNA的制备溶液(上述2)相比，该含有双链人类基因组DNA变性成单链的制备溶液(上述3)，相对于仅含有FND溶液的制备溶液的扩散电流值的变化率高。
实施例2 另一方面，作为本发明的生物分子检测用芯片的实施例，可利用生物高分子检测用芯片，该生物高分子检测用芯片具有腔室，该腔室可收容基准溶液或被检溶液，该基准溶液包含对作为检测对象的生物分子具有结合性的电化学活性物质，该被检溶液包含被检试样和上述电化学活性物质，该被检试样有可能含有作为检测对象的生物分子；送液装置，该送液装置向上述腔室输送基准溶液或被检溶液；电化学应答测定装置，该电化学应答测定装置测定上述腔室中收容的基准溶液或被检溶液的电化学应答；排液装置，该排液装置从上述腔室排出基准溶液或被检溶液。
另外，上述腔室，也可具有变性装置，该变性装置直接或间接地使上述被检溶液中的作为检测对象的生物分子扩增或变性。该变性装置可以是温度调节装置。
使用该种芯片，能够在一个腔室内进行通过温度调节装置进行的作为检测对象的生物分子的扩增和电化学测定，因此，可简化实验作业，可使试剂的使用量控制在最低限度。
上面，对本发明的生物分子检测方法以及生物分子检测用芯片，通过示出具体的实施方式进行了说明，但是，本发明不限定与此。只要是本领域技术人员，可在不超出本发明的宗旨的范围内，对检测顺序或芯片的各构成部分进行各种的变更和/或改良。
工业实用性 本发明的生物分子检测方法以及生物分子检测用芯片，能够在医疗、食品卫生、环境保护等产业领域，作为可低成本且简便快速地分析基因或蛋白质等的生物分子的技术进行利用。
权利要求
1.一种生物分子检测方法，其是通过电化学应答测定来检测作为检测对象的生物分子的生物分子检测方法，其特征在于，包括
基准溶液测定步骤，该步骤测定基准溶液的上述电化学应答，该基准溶液包含对于上述作为检测对象的生物分子具有直接或间接结合性的电化学活性物质；
被检溶液测定步骤，该步骤测定被检溶液的上述电化学应答，该被检溶液包含被检试样和上述电化学活性物质，该被检试样包含上述作为检测对象的生物分子；
比较步骤，该步骤比较上述基准溶液的上述电化学应答的测定结果和上述被检溶液的上述电化学应答的测定结果，导出比较结果；
生物分子含有信息检测步骤，该步骤根据上述比较结果，检测上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子的含有信息。
2.一种生物分子检测方法，其是通过电化学应答测定来检测作为检测对象的生物分子的生物分子检测方法，其特征在于，包括
基准溶液测定步骤，该步骤测定基准溶液的上述电化学应答，该基准溶液包含对于作为检测对象的生物分子具有直接或间接结合性的电化学活性物质；
被检溶液制备步骤，该步骤在上述基准溶液测定步骤测定结束的上述基准溶液中添加包含上述作为检测对象的生物分子的被检试样，制备被检溶液；
被检溶液测定步骤，该步骤测定上述被检溶液的上述电化学应答；
比较步骤，该步骤比较上述基准溶液的上述电化学应答的测定结果和上述被检溶液的上述电化学应答的测定结果，导出比较结果；
生物分子含有信息检测步骤，该步骤根据上述比较结果，检测上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子的含有信息。
3.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
上述被检溶液，由上述作为检测对象的生物分子的浓度未知的两种以上的上述被检溶液构成，
上述被检溶液测定步骤，包含未知浓度的两种以上的上述被检溶液的各自的上述电化学应答的测定，
上述比较步骤，是相对比较上述基准溶液的上述电化学应答的测定结果和各上述被检溶液的上述电化学应答的测定结果而导出比较结果的步骤，
上述生物分子含有信息检测步骤，是根据上述比较结果，检测各上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子的含有信息的步骤。
4.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
在上述被检溶液测定步骤之后，包含
第2基准溶液测定步骤，该步骤测定上述基准溶液或与上述基准溶液具有相同组成的基准溶液的上述电化学应答；
校正步骤，该步骤根据比较上述基准溶液测定步骤的测定结果和上述第2基准溶液测定步骤的测定结果的结果，进行上述电化学应答测定的校正。
5.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
在上述被检溶液测定步骤之后，包括
第2基准溶液测定步骤，该步骤测定上述基准溶液或与上述基准溶液具有相同组成的基准溶液的上述电化学应答；
异常检测步骤，该步骤根据比较上述基准溶液测定步骤的测定结果和上述第2基准溶液测定步骤的测定结果的结果，检测上述电化学应答的测定装置的异常。
6.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
对于试样进行使该作为检测对象的生物分子直接或间接地扩增和/或变性的反应，得到上述被检试样。
7.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
上述被检溶液包含多种上述作为检测对象的生物分子和多种上述电化学活性物质。
8.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
上述基准溶液测定步骤或上述被检溶液测定步骤中的上述电化学应答的测定，是基准溶液或被检溶液的扩散电流值的测定。
9.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
上述电化学活性物质是从由二茂铁基萘四甲酰二亚胺、烟酸己可碱、偏端霉素、核黄、4’，6-二甲脒基-2-苯基吲哚、重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐、亚甲蓝、米托蒽醌、道诺霉素、溴化乙啶、碘化丙碇、9-氨吖啶、椭圆玫瑰树碱、安吖啶、羟胺硫蒽酮、放线菌素D、色霉素、光辉霉素、棘霉素、奎吖因、诺加霉素、原黄素、阿米洛利、三甲补骨脂内酯、氯喹所组成的组中选出的一种物质。
10.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
上述作为检测对象的生物分子是具有电荷或负电性的分子。
11.根据权利要求1或2所述的生物分子检测方法，其中，
上述作为检测对象的生物分子是从由核酸、蛋白质、脂质、糖质所组成的组中选出的一种物质。
12.根据权利要求10所述的生物分子检测方法，其中，
上述作为检测对象的生物分子是核酸。
13.根据权利要求12所述的生物分子检测方法，其中，
上述作为检测对象的生物分子是单链核酸。
14.根据权利要求12所述的生物分子检测方法，其中，
上述作为检测对象的生物分子是双链核酸。
15.一种生物高分子检测用芯片，其是通过电化学应答测定来检测作为检测对象的生物分子的生物分子检测用芯片，其特征在于，具有
腔室，该腔室可收容基准溶液或被检溶液，该基准溶液包含对上述作为检测对象的生物分子具有结合性的电化学活性物质，该被检溶液包含被检试样和上述电化学活性物质；
送液装置，该送液装置向上述腔室输送上述基准溶液或上述被检溶液；
电化学应答测定装置，该电化学应答测定装置测定上述腔室中收容的上述基准溶液或上述被检溶液的电化学应答；
排液装置，该排液装置从上述腔室排出上述基准溶液或上述被检溶液。
16.根据权利要求15所述的生物分子检测用芯片，其中，
上述腔室，还具有使上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子扩增或变性的温度调节装置。
全文摘要
一种生物分子检测方法，其是通过电化学应答测定来检测作为检测对象的生物分子的生物分子检测方法，其中，包括基准溶液测定步骤，该步骤测定基准溶液的上述电化学应答，该基准溶液包含对于上述作为检测对象的生物分子具有直接或间接结合性的电化学活性物质；被检溶液测定步骤，该步骤测定被检溶液的电化学应答，该被检溶液包含被检试样和上述电化学活性物质，该被检试样包含上述作为检测对象的生物分子；比较步骤，该步骤比较上述基准溶液的电化学应答的测定结果和上述被检溶液的电化学应答的测定结果，导出比较结果；生物分子含有信息检测步骤，该步骤根据上述比较结果，检测上述被检溶液中的上述作为检测对象的生物分子的含有信息。
文档编号G01N37/00GK101606057SQ20088000402
公开日2009年12月16日 申请日期2008年2月5日 优先权日2007年2月6日
发明者中山雅人 申请人:凸版印刷株式会社