专利名称：：蛋白质固定化支持体及其制造方法
技术领域：
：本发明涉及蛋白质能够在固定化用支持体上高效固定化的蛋白质固定化支持体的制造方法、以及蛋白质被固定化的蛋白质固定化支持体。
背景技术：
：关于蛋白质被固定化的支持体，将该蛋白质作为探针来使用，以便对生物体物质、化学物质进行纯化或检测。例如，已固定了与抗体分子具有亲和性的蛋白质的蛋白A、蛋白G的支持体，被用于抗体的亲和纯化。另外，抗体被固定化的支持体，被用作利用抗原抗体^^应而对该抗原进^ft检测、定量的诊断试剂。当在这样的纯化或检测中使用将蛋白质固定化了的支持体时，通常为了使作为该支持体的性能指标的纯化容量、检测灵^t度提高，需要增加蛋白质的固定化量。作为将蛋白质结合在固定化用支持体上的方法，通常是使具有^或甲M醃基等活性官能团的固定化用支持体、与蛋白质分子中的M进行偶联。但是，根据蛋白质的分子种类，由于具有氨基的氨基酸的含有率少、原因，会有无法将足够量的蛋白质固定化的情况。另外，就已被固定化于支持体上的蛋白质而言，在蛋白质的功能、活性体现中发挥重要作用的氨基被消耗在与支持体的结合中，由此会有功能、活性丧失的情况。进而，近年来，作为蛋白质固定化支持体的用途，开发出使用各种蛋白质或抗体被总体固定化的蛋白质芯片、抗体芯片，对与来源于作为检查对象的患者的生物体材料或药品候补的低分子化合物有相互作用的分子种及其强度进行评价的方法。在蛋白质芯片、抗体芯片的制造中，为了使获得的信号的解析容易进行，要求减少在各种蛋白质之间固定化量的不均。
发明内容本发明的目的在于，提供一种即便是以往难以在固定化用支持体上固定足够量的蛋白质，也能使其在支持体高效固定化从而能够增加固定化量的蛋白质固定化支持体的制造方法，以及利用上述制造方法得到的蛋白质固定化支持体。为了实现上述目的，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，通过使用具有含碱性^J^酸分子的标签序列的蛋白质，例如即侵是以往固定后反应的效率差且固定化量不够充分的蛋白质，也可以增大蛋白质固定化量，从而完成了该研究。本发明的一个实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的制造方法，包含在支持体上将具有标签序列的蛋白质固定化的工序，所述的标签序列含有碱性氨基酸为连续三个以上的序列。就上述蛋白质固定化支持体的制造方法而言，上M性Jl^酸可以是赖氨酸、精氨酸、及组氨酸中的任意一种。就上述蛋白质固定化支持体的制造方法而言，上述标签序列可以是组氨酸标签。就上述蛋白质固定化支持体的制造方法而言，上述固定化用支持体可以具有选自氛基、环氣基、及曱^t酰基中的至少一种官能团。就上述蛋白质固定化支持体的制造方法而言，上述固定化用支持体可以是磁性粒子。本发明的一个实施方式涉及的蛋白质固定化支持体，可以通过上述蛋白质固定化支持体的制造方法而获得。根据上述蛋白质固定化支持体的制造方法，例如，即便是固定后反应的效率差而无法得到足够的固定化量的蛋白质，也可以增加蛋白质固定化量。因此，就通过上述蛋白质固定化支持体的制造方法得到的上述蛋白质固定化支持体而言，蛋白质的固定化量大。具体实施例方式以下，对本发明的一个实施方式涉及的蛋白质固定化支持体及其制造方法进:^H兑明。1.蛋白质固定化支持体及其制造方法
技术领域：
：本发明的一个实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的制造方法，包含在支持体上将具有标签序列的蛋白质(以下也称为"标签蛋白质")固定化的工序，所述的标签序列含有碱性氛基酸为连续三个以上的序列。本发明的一个实施方式涉及的蛋白质固定化支持体，蛋白质和固定化支持体借助与标签序列结合的官能团(例如亚氨基、酰胺键)进行化学结合。1.1.标签蛋白质就本实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的制造方法而言，在固定化用支持体上固定化的标签蛋白质，含有具有碱性氨基酸为连续三个以上的序列的标签序列。标签序列的M酸数为3个以上，对长度的上限没有限制，但为了抑制对蛋白质性质的影响，通常优选5~30个。标签序列优选其一部分或全部由碱性M酸形成，更优选由从赖氨酸、精氨酸及组氨酸中选择的碱性^^酸连续3个以上的序列形成，进一步优选含有赖氨酸、精氨酸及组氨酸中的任意一种^J^酸连续3个以上的序列，特别优选仅由上述任意一种M酸连续3~10个的序列形成。在标签序列仅由赖氨酸、精氨酸及组氨酸中的任意一种M酸形成的情况下，这些标签序列分别为寡聚赖氨酸、寡IMt氨酸、寡聚组氨酸。另外，由五聚体或六聚体形成的寡聚组氨酸通常是被称为组氨酸标签(HisTag)的标签。从能够使用市售的表达载体(vector)、能够容易地构建重组蛋白质这一点出发，优选使用组氨酸标^ft为标签序列。作为在蛋白质上附加标签序列的方法，例如可以举出在蛋白质的一级序列上组入标签序列的方法、在蛋白质的氨基酸残基上以接枝状附加标签序列的方法。当在蛋白质的一级序列中组入标签序列时，为了使对蛋白质的性质造成的影响为最小限，优选在作为蛋白质分子的末端的N末端或C末端附加标签序列，但也可以向蛋白质的内部序列组入标签序列。此时，关于蛋白质，可以通过制备组入了下述序列的表达载体，培养用该表达载体而转化的;U^杆菌等，从该;U^杆菌分离纯化表达的蛋白质，由此来制备，所述的序列例如在使阅读框一致的状态下将编码蛋白质的基因及编码标签序列的基因融合而得的序列。当在蛋白质的氨基酸瓶基上以接枝状附加标签序列时，例如，可以通制备。作为蛋白质和标签序列的偶联方法，例如在将蛋白质和标签序列混合的状态下，使用N-乙基-N，-(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)等碳化二亚胺试剂等进行处理，由此可以在蛋白质的氨基和/或亚氨基与标签序列的末端氛基之间、蛋白质的羧基和标签序列的氨基和/或亚氨基之间、或者它们两者处将蛋白质和标签序列偶联。1.2.固定化用支持体使标签蛋白质固定化的固定化用支持体，优选具有与标签蛋白质进行化学结合的官能团。这样的官能团例如优选是从氣基、环氣基、及曱M醃基中选择的至少一种。由于在标签序列中含有碱性氨基酸，所以固定化用支持体所具有的官能团由这些官能团组成，由此在标签序列中的碱性氨基酸中所含的JL^和/或亚氨基与上述官能团高^L^应，其结果，蛋白质和固定化用支持体借助标签序列进行化学结合，由此可以使标签蛋白质有效地固定化在固定化用支持体上，认为这有助于固定化量的增大。另外，标签序列含有碱性氨基酸为连续3个以上的序列。碱性氨基酸具有#^及亚#*或任意一方，所以在标签序列中，碱性氨基酸中所含的氨基和/或亚氣基的密度高，如后所述，该氛基和/或亚氨基的反应性高。由此，与标签蛋白质中存在于标签序列以外的部位的氨基等相比，可以使官能团发生反应，所以可以减少对蛋白质自身性质的影响，认为这有助于已固定化的蛋白质的性质的维持。通过上述方法，可以得到标签蛋白质在标签蛋白质和固定化支持体上高效进行化学结合而得的蛋白质固定化支持体。关于固定化用支持体中所含的官能团，在制作固定化用支持体时，例如，除了能够通过共聚、接枝共聚、偶联、等离子体处理等操作进行化学导入之外，还能够通过混入、涂敷等操作对固定化用支持体进行物理导入。如果考虑官能团的导入效率，优选官能团进行化学导入。1.3.标签蛋白质和固定化用支持体的固定化作为标签蛋白质和固定化用支持体的结合方法，例如可以举出通过使而使标签蛋白质和固定化用支持体化学结合的方法。例如，当在固定化用支持体中有^&存在时，可以使用EDC等碳化二亚胺试剂通过胺偶联法结合该羧基与蛋白质中的JL^和/或亚氨基。就本实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的制造方法而言，作为要固定化的蛋白质，在使用含有如下标签序列的蛋白质的情况下，可以使得与固定化用支持体中的官能团的偶联效率飞跃性增大，因此可以将蛋白质向固定化用支持体的固定化量大幅增加，所述的标签序列具有碱性氨基酸为连续3个以上的序列。其结果，即^1A以往难以以足够量在固定化用支持体上固定化的蛋白质(例如蛋白G、蛋白A)，也能够有效地在固定化用支持体上固定化。进而，就本实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的制造方法而言，作为标签序列，使用赖氨酸、精氨酸及组氨酸中的任意一种氨基酸为连续3个以上的序列，由此可以进一步增大与固定化用支持体中的官能团的偶联效率。其原因考虑为，当相同M酸连续以簇状存在时，这些氨基酸残基的反应性增大。出现该现象的原因尚不确定，但认为通过使用赖氨酸、精关的氛基、亚氛基的密度局部增高，所以与作为反应对象的固定化用支持体的官能团的相互作用增大，以及标签序列的氣基酸的立体构象成为适合反应的位置等。另外，就本实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的制造方法而言，在固定用支持体具有从氛基、环氡基、及甲M耽基中选择的至少一种官能团的情况下(特别是具有的官能团为环ltJ^L曱M醃基或其任意一方的情况)，可以使蛋白质向固定化用支持体的固定化量增大。此时，关于蛋意一种M酸为连续3个以上的标签序列，与反应有7白质和固定化用支持体的结合，可以在将两者^t于适当的溶剂中之后通过混合一定时间来实现。对固定化用支持体的材质没有特别限定，例如可以是有机、无机、玻璃、金属、或它们的复合体。作为固定化用支持体的形态，例如可以举出粒子状、膜状、玻片状、盘状、板状、纤维状、管状。在固定化用支持体为粒子状的情况下，固定化用支持体优选为磁性粒子。此时，固定化用支持体可以在粒子的内部或表面含有磁性体。在固定化用支持体为磁性粒子的情况下，磁性体优选仅含于该粒子的内部而非在表面露出。由于固定化用支持体为磁性粒子，可以利用磁作用对粒子进行固液分离。磁性粒子的内部组成可以为均质，也可以为非均质，但优选残留磁化少且含有超顺磁性的磁性，粒的非均质粒子。另外，就磁性粒子而言，通过使其比重低而使其在水中的沉降减慢，容易向水中^t,所以优选含有有机物。作为具有非均质的内部组成的磁性粒子的内部结构，可以举出(I)由有机聚合物等非磁性的有机物形成的在连续相中有磁性体微粒分散的粒子；(II)以磁性，粒的二次凝聚物为核且以有机聚合物等非磁性的有机物为壳的粒子；(III)具有由有机聚合物等非磁性体形成的核粒子、在该核粒子的表面设有超顺磁性微粒的二次凝聚物层(磁性体层)、和作为磁性体层的外层的有机聚合物层的粒子等。其中，优选(III)在含有超顺磁性微粒的二次凝聚物层的核粒子(以下将"含有超顺磁性微粒的二次凝聚物层的核粒子"表示为"母粒子")的外层具有有机聚合物层的粒子。有机聚合物层可以由两层以上的聚合物层构成。需要说明的是，在各种粒子中使用的有机聚合物，优选除了核-壳型粒子的核部分之外，形成粒子5^面的聚合物具有从氛基、环IL^、及甲^t酰基中选择的至少一种官能团。另外，核粒子和其外层(磁性体层)的界面、以及磁性体层和其外层(有机聚合物层)的界面，可以是两层的成分混合存在的状态。作为上述(I)的粒子的优选制造方法，例如可以举出在特开平9-208788号公报中公开的方法。另外，作为上述(III)的粒子的优选制造方法，例如可以举出在特开2004-205481号乂》4艮中>^开的方法。作为磁性体，例如可以使用四氧化三铁(Fe304)、三氧化二铁(Y-Fe203)等各种铁氧体、铁、锰、钴、铬等金属或这些金属的合金等。通过使用平均粒径为30nm以下的磁性体，可以得到基本上为超顺磁性的固定化用支持体。关于磁性体的含量，优选占所有粒子重量的比例为10重量°/。以上，更优选20~80重量％。在这里，如果占所有粒子重量的比例为10重量％以下，则不会得到良好的磁分离性，分离需要相当长的时间，所以不优选。另一方面，如果占所有粒子重量的比例为80重量％以上，则在粒子表面露出的磁性体增多，所以不优选。在固定化用支持体是粒子状的情况下，对粒子(固定化用支持体粒子)的粒径没有特别限制，通常为10nm~10mm。粒径由激光衍射散射法求出。另外，上述粒子的形状没有必要为球状，可以是针状等异形粒子。作为本实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的一例，可以举出使与抗体分子具有亲和性的作为蛋白质的蛋白A或蛋白G在琼脂糖制皿等固定化用支持体上固定化的支持体。关于该支持体，与以往的支持体相比，蛋白A或蛋白G的固定化量更多，因而可以增大抗体的纯化容量。另外，在本实施方式涉及的蛋白质固定化支持体的制造方法中，要固定化的蛋白质是抗体，使用聚合物乳胶等的,作为固定化用支持体，将抗体与该微粒结合而得的固定化支持体用作夹心ELISA法等的免疫诊断用支持体时，可以增加抗体的固定化量。由此，就分析对象抗原的测定临界浓度而言，低浓度侧及高浓度侧均很宽，所以可以制作测定对象的浓度的动态范围宽且可以在短时间内检查的诊断试剂。进而，当使各种蛋白质或抗体总体地在芯片上固定化而制作蛋白质芯片或抗体芯片时，可以制作在各种蛋白质之间固定化量的波动少，能高精度评价的芯片。2.实施例以下，对本发明的实施例进^i兌明，但本发明并不限于这些实施例。2.1.合成例l(具有氛基的固定化用支持体(膝性粒子)的合成)将75%二(3，5,5-三甲基己酰基)过氧化物溶液(日本油脂制"PEROYL355-75(S)")2质量份混合到1%十二烷絲酸钠水溶液20质量份，用超声波^t剂微细乳化。将其放到装有粒径0.77nm的聚苯乙烯粒子13质量份及水41质量份的反应器中，在25匸下搅拌12小时。使用其他容器，通过0.1°/。十二烷J^l酸钠水溶液400质量份将苯乙烯96质量份及二乙烯基苯4质量份乳化，将得到的液体放入到上述反应器中，在40n下搅拌2小时，然后升温至751C，聚合8小时。冷却至室温之后，进一步水洗利用离心分离而仅取出粒子的产物，干M粉碎，得到核粒子。核粒子的数均粒径为1.5jum。接着，向油性磁性流体(商品名"EXP系列"，Ferrotec公司制)中添加丙酮，使粒子析出并沉淀，然后对其进行干燥，由此得到具有经疏水化处理的表面的铁氧体系的磁性体微粒(一次平均粒径0.01nm)。接着，用混合机对上述核粒子15g及上U性体粒子15g进行混合，使用杂交系统NHS-O型(奈良M制作所(林)制)，以叶片(搅拌翼)的圆周速度100m/秒(16200rpm)对该混合物处理5分钟，得到在表面具有由磁性体微粒形成的磁性体层的数均粒径为2.0nm的母粒子。接着，将含有十二烷基^:酸钠0.25重量％及非离子性乳化剂(商品名"Emulgen150"，花王(林)制)0.25重量％的水溶液(以下称为"分散剂水溶液")375g^到1L可拆式烧瓶中，接着，^具有上i^t性体层的母粒子15g,用均化器进行分狀，然后加热至601C。向a剂水溶液150g中加入甲基丙烯酸甲酯27g、三羟曱基丙烷三甲基丙烯酸酯(以下称为"TMP")3g、及二(3，5，5-三甲基己醃基)过氧化物(日本油脂公司制；PEROYL355)0.6g，使其分^:得到预制乳状液，用1小时30分钟将该预制乳状液滴加到温座_控制成60n的上述1L可拆式烧瓶中。在滴加结束后，保持601C并搅拌1小时，然后向^t剂7JC溶液75g中加入甲基丙烯酸环己酯13.5§、甲基丙烯酸L5g、及二(3，5，5-三甲基己SLiO过氧化物(日本油脂公司制；PEROYL355)0.3g，使其^ft得到预制乳状液，用1小时30分钟将该预制乳状液滴加到温度控制成60n10的上述1L可拆式烧瓶中。然后升温至751C，然后进一步继续聚合2小时，^^应结束。接着，使用磁力对上述可拆式烧瓶中的粒子进行分离，然后4吏用蒸馏水反复清洗。综上，得到具有氣基的膝性粒子(以下为"A粒子")。2.2.合成例2(具有环氧基的固定化用支持体(磁性粒子)的合成)在合成例1中，使用13.5g的GMA及1.5g的TMP来代替13.5g的甲基丙烯酸环己酯及i.sg的甲基丙烯酸，除此之外，进行与合成例l相同的步骤，由此得到具有环氡基的粒子(以下为"粒子B")。2.3.合成例3(具有甲M酖基的固定化用支持体(磁性粒子)的合成)取利用冻结干燥得到的5g粒子B放到1L可拆式烧瓶中，it^lmol/L的硫酸60ml，在601C下搅拌6小时。接着，使用磁力对上述可拆式烧瓶中的粒子进行分离，然后4吏用蒸镏水反复清洗。综上，得到具有2，3-二羟基丙基的磁性粒子。使将该粒子进行冻结千燥而得到的干燥粒子l.Oga于8ml的吡啶中，然后添加对甲笨晴酰氯0.2g，室温下搅拌2小时。反应后，使用磁力分离粒子，用丙酮清洗4次，接着用蒸镭水清洗4次，得到2，3-二羟基丙基被曱M酰化的磁性粒子(以下为"C粒子")。该磁性粒子(粒子C)的数均粒径为2.9nm。2.4.实施例l对以下的四种蛋白质，评价其向具有氛基的粒子A的固定化量。所述四种蛋白质如下所示。(i)N末端具有组氨酸分子为连续6个的6组氨酸标签的谷胱甘肽S-转移酶(His6-GST、UpstateBiotechnology公司制，目录编号No.12—350，分子量27kDa)，(ii)同样在N末端具有6组氨酸标签的Aktl(His6—Aktl、UpstateBiotechnology乂>司制，目录编号No.14-279,分子量59kDa),(iii)同样在N末端具有6组氨酸标签的泛素(Ubiquitin)(His6—泛素、AFFINITIResearchProductsLtd制，目录编号No.UW8610，分子量9.4kDa)、(iv)N末端具有组氨酸分子为连续10个的10组氨酸标签的泛素(HislO-泛素、R&DSystemsInc制，目录编号No.701-UB，分子量10kDa)o首先，利用超滤作用将各蛋白质的溶剂置换成磷酸钠緩冲溶液(10mM、pH7.0)，推^据吸光度将浓度调制成1.0mg/mL。如下所示评价这些蛋白质向粒子A的固定化量。从粒子A^L液取lmg量的粒子到试管中，使用试管用的磁力架对粒子进行分离，然后除去上清，接着分歉于100iLiL的0.1M的MES緩沖溶液(pH5.0)中。向其中添加EDC的MES溶液(浓度10mg/mL)5HL，在25TC下反应30分钟。使用磁力架分离粒子并舍弃溶剂，新添加MES緩冲溶液100jiL。向其中加入蛋白质溶液20nL，在25"C下振荡反应3小时。最后用0.5mL的洗涤液(0.05%含有Tween20表面活性剂的PBS緩冲液)清洗粒子4次，得到蛋白质固定化磁性粒子。使用作为蛋白质定量法的BCA测定法对该蛋白质固定化量进行定量。浓度是以作为测定对象的蛋白质溶液为标准物质而算出。将其结果示于表2,5.比较例l作为实施例l的比较例，对以下的四种蛋白质，采用与实施例l所用的方法相同的方法，测定其向粒子A的固定化量。所述四种蛋白质如下所示。(i)谷胱甘肽-S-转移酶(GST、Sigma公司制，产品No.G5663，分子量26kDa),(ii)具有GST标签的Aktl(GST-Aktl、Abnovacorporation公司制，目录No.H00000207-P01，分子量79kDa)，(iii)泛素(泛素、NovusBiologicalsInc制，目录编号No.NB800-PC40,分子量8.5kDa)，(iv)N末端具有GST标签的泛素(GST-泛素、NovusBiologicalsInc制，目录编号No.NB800-PC42，分子量35kDa)。利用超滤作用将各蛋白质的溶剂置换成磷酸钠緩冲溶液(10mM、pH7.0),利用吸光度将浓度调制成1.0mg/mL后使用。将得到的结果示于表l。2.6.实施例2在本实施例中，对于在实施例l中使用的四种蛋白质，评价其向具有环氧基的粒子B的固定化量。从粒子B^L液取lmg量的粒子到试管中，使用试管用的磁力架对粒子进行分离，然后除去上清，接着^L于Lys6-蛋白G的0.1M硼酸緩冲溶液(pH9.5)中。向其中添加蛋白质溶液20nL，在37"C下振荡^[24小时。最后用0.5mL的洗涤液(0.05%含有Tween20表面活性剂的PBS緩冲液)清洗粒子4次，得到蛋白质固定化磁性粒子。使用与实施例l所用的方法相同的方法，测定该蛋白质固定化量。将其结果示于表2。2.7.比较例2在本比较例中，作为实施例2的比较例，对在比较例l中使用的四种蛋白质，采用与实施例2所用的方法相同的方法，测定其向具有环氧基的粒子B的固定化量。将其结果示于表2。2.8.实施例3在本实施例中，作为粒子，使用具有甲M酰基的粒子C来代替粒子B，除此之外，采用与实施例2相同的材料和方法，进行将M白质固定在粒子上的处理，然后测定蛋白质的固定化量。将其结果示于表3。2.9.比较例3在本比较例中，作为实施例3的比较例，作为粒子，使用具有甲MiL基的粒子C来代替粒子B，除此之外，采用与比较例2相同的材料和方法，进行将各蛋白质固定在粒子上的处理，然后测定蛋白质的固定化量。将其结果示于表3。〔表1〕每lmg含有羧基的粒子A对蛋白质的固定化量实施例l比较例lHis6-GST18"gGST10wgHis6—Akt114MgGST—Akt19tfgHis6-泛素14wg泛素9"gHis10-泛素16GST—泛素11wg〔表2〕13每lmg含有环氧基的粒子B对蛋白质的固定化量实施例2比较例2<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>〔表3〕每lrag含有甲^t酰基的粒子C对蛋白质的固定化量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本实施例中，使用蛋白G作为蛋白质，对向固定化用支持体的固定化量中的标签序列的效果进行研究。蛋白G是改变文献BengtGussetal.(1986)TheEMBOJournal.5(7)1567-1575中记载的分子而使用。对于文献中的蛋白G的JL&酸编号190号至384号的序列，制作在其N末端融合了有连续6个赖氨酸分子的6赖氨酸标签(以下记为"Lys6")的赖氨酸标签融合蛋白。按照文献中记载的方法，获得编码氨基酸编号l卯号至384号的序列的基因，化学合成对其M末端侧的6M酸序列进行的DNA，将其和对C末端的12^酸进行编码的DNA用作PCR引物，用PCR法进行扩增，由此制作使与6赖氨酸标签进行编码的DNA融合且对蛋白G进行编码的基因，将其导入到表达载体中，用大肠杆菌使其表达，然后对该大肠杆菌进行分离纯化，由此制备具有目标标签序列(赖氨酸标签)的蛋白质(Lys6-蛋白G)。利用与在实施例1中使用的方法相同的方法，将该Lys6-蛋白G固定于具有氛基的粒子A，测定其固定化量。将其结果示于表4。另外，测定该Lys6-蛋白G固定化粒子的免疫球蛋白G(IgG)固定化量。从Lys6-蛋白G固定化粒子的^ft液取lmg量的粒子到试管中，使用试管用的磁力架对粒子进行分离，然后除去上清，接着^ft于50nL的0.1M柠檬酸—磷酸緩冲溶液(pH5.0)中。向其中添加10nL的人IgG(Sigma公司制、商品编号14506)的0.1M柠檬酸-磷酸緩冲溶液(lmg/mL、pH5.0)，25匸下振荡反应1小时。用O.lM柠檬酸-磷酸緩冲溶液(pH5.0)清洗未>^应的人IgG数次，然后用50nL的0.1M柠檬酸緩冲溶液(pH2.0)洗脱被粒子俘获的人IgG，利用吸光度计算已回收的IgG量。将得到的每lmg粒子的IgG结合容量示于表4。2.11.比较例4制作与实施例4中举出的文献中的蛋白G的氨基酸编号l卯号至384号的序列相当的蛋白G分子。按照文献中记载的方法，获得编码蛋白G的"ll^酸编号190号至384号的序列的基因，将其导入到表达栽体中，用U杆菌使其表达，然后进行分离纯化，由此制备目标蛋白G。利用与在实施例1中使用的方法相同的方法，将该蛋白G固定于具有氣基的粒子A上，测定其固定化量。将其结果示于表4。另外，利用与在实施例4中使用的方法相同的方法，测定人IgG的结合容量。将其值示于表4中。〔表4〕每lmg粒子的蛋白G固定化量和人IgG结合容量实施例4比较例4Lys6—蛋白G固定化量(Mg/腿一bead)IgG结合容量(Mg/迈g—bead)蛋白G固定化量("g/mg—bead)IgG结合容量(Mg/呢一bead)7.0161.52.8由表1~4所示可以确认，以含有连续3个碱性氨基酸的序列的标签序列制作蛋白质来制备标签蛋白质，将该标签蛋白质固定于固定化用支持体上，由此可以使蛋白质在固定化用支持体上的固定化量增大。表l表示每lmg含有羧基的粒子A的蛋白质固定化量。根据表l，无论4吏用何种蛋白质，关于向固定化用支持体(含有氣基的粒子)的固定化量，与不具有标签序列(扭s标签)的蛋白质相比，具有标签序列(扭s标签)的蛋白质的固定化量更多。表2表示每lmg含有环氧基的粒子B的蛋白质固定化量。根据表2，无论使用何种蛋白质，与不具有标签序列(His标签)的蛋白质相比，具有标签序列(His标签)的蛋白质的固定化量更多。表3表示每lmg含有甲^Mtit^的粒子C的蛋白质固定化量。根据表3，无论使用何种蛋白质，关于向固定化用支持体(含有甲^t醃基的粒子)的固定化量，与不具有标签序列(His标签)的蛋白质相比，具有标签序列(His标签)的蛋白质的固定化量更多。表4表示每lmg含有羧基的粒子的蛋白G及Lys6-蛋白G固定化量、以;^AlgG结合容量。根据表4，蛋白G向固定化用支持体(含有g的粒子)的固定化量，通过使用将蛋白G与Lys6标签融合而得到的标签蛋白质而得到提高。另外，将标签蛋白质(Lys6-蛋白G)固定化的粒子的IgG结合容量，大于将不具有Lys6标签的蛋白质(蛋白G)固定化的粒子的IgG结合容量，由此明确，通过使用将蛋白质(蛋白G)与标签序列(Lys6标签)融合而得到的标签蛋白质(Lys6-蛋白G)，能够提高蛋白质固定化支持体的性能。另外，由表4所示可以确认，在使用蛋白G作为蛋白质的情况下，固定化量增大，其结果，可以提高由IgG结合容量表示的蛋白质固定化支持体的性能。权利要求1.一种蛋白质固定化支持体的制造方法，其特征在于，包含在支持体上将具有标签序列的蛋白质固定化的工序，所述的标签序列含有碱性氨基酸为连续三个以上的序列。2.根据权利要求l所述的蛋白质固定化支持体的制造方法，其中，所述碱性^J^^i赖氨酸、精氨酸、及组氨酸中的任意一种。3.根据权利要求1或2所述的蛋白质固定化支持体的制造方法，其中，所述标签序列是组氨酸标签'4.根据权利要求1~3中任意一项所述的蛋白质固定化支持体的制造方法，其中，所述固定化用支持体是磁性粒子。5.根据权利要求1~4中任意一项所述的蛋白质固定化支持体的制造方法，其中，所述固定化用支持体具有选自氛基、环氧基、及曱^tSL^中的至少一种官能团。6.—种蛋白质固定化支持体，其特征在于，是通过权利要求1~5中任意一项所述的蛋白质固定化支持体的制造方法而获得的。全文摘要本发明提供一种蛋白质固定化支持体的制造方法，包含在支持体上将具有标签序列的蛋白质固定化的工序，所述的标签序列含有碱性氨基酸为连续三个以上的序列。文档编号G01N33/543GK101632019SQ200880008020公开日2010年1月20日申请日期2008年3月4日优先权日2007年3月28日发明者村田充弘,片寄聪,福田哲夫申请人:Jsr株式会社