专利名称：蛋白质光电转换器和锡取代的细胞色素c的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质光电转换器和锡取代的细胞色素C，并涉及例如锡取代的马心细胞色素C、锡取代的牛心细胞色素c等以及使用其的蛋白质光电转换器。
背景技术：
蛋白质尽管尺寸非常小Qnm至lOnm)但是发挥复杂的功能；因此，蛋白质是有希望的下一代功能元件以代替半导体元件。在相关技术中，作为使用蛋白质的光电转换器，提出了使用通过将锌取代的马心细胞色素C (马心细胞色素C，其具有取代铁作为马心细胞色素C的辅基血红素的中心金属的锌)固定在金电极上而形成的蛋白质固定电极的光电转换器(参考专利文献1)。然后， 报导了，通过蛋白质固定电极获得了光电流。[现有技术文献][专利文献][专利文献1]日本未审查专利申请公开第2007-220445号[专利文献2]日本未审查专利申请公开第2009-21501号[非专利文献][非专利文献 1 JMcLendon, G.和 Smith, Μ. J. Biol. Chem. 253,4004(1978)[非专利文献 2]Moza，B.和 2 个其他人，Biochim. Biophys. Acta 1646,49(2003)[非专利文献 3] Vanderkooi, J. M.和 2 个其他人，Eur. J. Biochem. 64, 381-387(1976)[非专利文献 ^iTokita, Y.和 4 个其他人，J. Am. Chem. Soc. 130,5302(2008)[非专利文献5]GoutermanM.，卟啉类及相关环的光谱和电子结构(Optical spectra and electronic structure of porphyrins and related rings)，在“口卜H|木类 (The Porphyrins) ” 中，第 3 卷，由 Dolphin, D.编辑，第 1-156 页，学术出版社(Academic Press) (1978)
发明内容
然而，根据本发明的发明人和其他人的研究已经发现，作为在专利文献1中提出的光电转换器中使用的锌取代的马心细胞色素c中的辅基的锌卟啉对光不稳定，且因光照射而快速分解。图39示出了在锌取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱中，由光照射造成的随时间变化的测量结果。在该测量中，将ImL的4μ M锌取代的马心细胞色素c溶液(溶解在IOmM磷酸钠缓冲溶液(ρΗ7. 0)中)放在比色皿中，并在室温下在暗室中用具有 420nm波长(1630 μ W强度)的光进行照射。每隔30分钟测量MOnm至700nm的波长范围中的紫外可见吸收光谱。图39中的箭头指示光谱变化方向。根据图39很明显的是，锌取代的马心细胞色素c随时间推移而快速进行光分解。此时的光分解速度常数(photolysis rate constant) k为ΙΗΜ—Υ1。尽管未给出具体描述，但是锌取代的牛心细胞色素c也因光照射而快速分解。为了防止光分解，考虑隔绝其中存在锌取代的马心细胞色素c和锌取代的牛心细胞色素c的环境中的氧，或者添加自由基捕捉剂；然而，这种手段仅使得可将光分解降低至约1/3。更具体地，图40示出了在氩气氛中在锌取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱中，由光照射造成的随时间变化的测量结果。测量方法与上述方法相同。然而，用螺丝帽将包含锌取代的马心细胞色素c溶液的比色皿密封，将脱氧的氩气供应至比色皿中持续15 分钟。此时的光分解速度常数k为37. δΜ—Υ1，这仅是在未隔绝氧的情况中的约1/3。而且， 图41示出了在添加自由基捕捉剂的情况下，在锌取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱中，由光照射造成的随时间变化的测量结果。测量方法与上述方法相同。然而，作为自由基捕捉剂，向包含锌取代的马心细胞色素c溶液的比色皿中添加IOmM抗坏血酸钠(ρΗ7. 0)， 并不将比色皿密封。此时的光分解速度常数k为39. βΜ—1^，这仅是在未隔绝氧的情况中的约 1/3。因此，本发明要实现的目的是提供一种新型蛋白质，所述蛋白质对于光照射具有极高的稳定性且能够长时间保持光电转换功能；以及使用所述蛋白质且能够长时间稳定使用的蛋白质光电转换器。通过为了实现上述目的进行的广泛研究，本发明人和其他人首先成功地合成了新型蛋白质，所述蛋白质对于光照射具有极高的稳定性且能够长时间保持光电转换功能。更具体地，合成了通过分别用锡取代作为马心细胞色素c和牛心细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成的锡取代的马心细胞色素C和锡取代的牛心细胞色素C，且确认了锡取代的马心细胞色素C和锡取代的牛心细胞色素C的对于光照射的稳定性和光电转换功能的长期保持性。除了马心细胞色素C和牛心细胞色素C以外的任何哺乳动物细胞色素C都可以获得类似的优异性能。而且，具有通过在马心细胞色素C、牛心细胞色素C或哺乳动物细胞色素C的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡的蛋白质可获得类似的优异性能。而且，即使在将除了锡和锌以外的金属代替锡用作取代金属的情况下，只要荧光激发寿命在预定时间内，也可以获得具有类似优异性能的金属取代的细胞色素C或蛋白质。本发明基于通过本发明人和其他人的上述研究而实现。更具体地，为了实现上述目的，本发明提供了通过用锡取代作为马心细胞色素c 的血红素的中心金属的铁而形成的锡取代的马心细胞色素C。而且，本发明提供了通过用锡取代作为牛心细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成的锡取代的牛心细胞色素C。而且，本发明提供了具有通过在马心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡的蛋白质。而且，本发明提供了具有通过在牛心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡的蛋白质。而且，本发明提供了通过用锡取代作为哺乳动物细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成的锡取代的细胞色素C。而且，本发明提供了具有通过在哺乳动物细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡的蛋白质。
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而且，本发明提供了包含锡取代的马心细胞色素c的蛋白质光电转换器。而且，本发明提供了包含锡取代的牛心细胞色素c的蛋白质光电转换器。而且，本发明提供了包含蛋白质的蛋白质光电转换器，所述蛋白质具有通过在马心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡。而且，本发明提供了包含蛋白质的蛋白质光电转换器，所述蛋白质具有通过在牛心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡。而且，本发明提供了包含锡取代的细胞色素c的蛋白质光电转换器，所述锡取代的细胞色素C通过用锡取代作为哺乳动物细胞色素C的血红素的中心金属的铁而形成。而且，本发明提供了包含蛋白质的蛋白质光电转换器，所述蛋白质具有通过在哺乳动物细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡。而且，本发明提供了一种金属取代的马心细胞色素C，所述金属取代的马心细胞色素C通过用除了锌和锡以外的金属取代作为马心细胞色素C的血红素的中心金属的铁而形成，并且具有5. OX IO-11SC τ彡8. OX IO-ltlS的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种金属取代的牛心细胞色素c，所述金属取代的牛心细胞色素c通过用除了锌和锡以外的金属取代作为牛心细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成，并且具有5. OX IO-11SC τ彡8. OX ΙΟ—1、的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质具有通过在马心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列，包含除了锌和锡以外的金属，并且具有5. OXKT11sC τ彡8.0X10_1(ls的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质具有通过在牛心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列，包含除了锌和锡以外的金属，并且具有5. OXKT11sC τ彡8.0X10_1(ls的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种金属取代的细胞色素C，所述金属取代的细胞色素c通过用除了锌和锡以外的金属取代作为哺乳动物细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成， 并且具有5. OX KT11S < τ彡8. OX ΙΟ—1、的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种蛋白质，所述蛋白质具有通过在哺乳动物细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列，包含除了锌和锡以外的金属，并且具有5. OXKT11sC τ彡8.0X10_1(ls的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种包含金属取代的马心细胞色素c的蛋白质光电转换器， 所述金属取代的马心细胞色素c通过用除了锌和锡以外的金属取代作为马心细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成且具有5. 0X10_"S < τ <8.0X10_1(ls的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供一种包含金属取代的牛心细胞色素c的蛋白质光电转换器，所述金属取代的牛心细胞色素c通过用除了锌和锡以外的金属取代作为牛心细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成且具有5. OX 10_"S < τ ( 8. OX 10_1Qs的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种包含蛋白质的蛋白质光电转换器，所述蛋白质具有通过在马心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列，包含除了锌和锡以外的金属，并且具有5.0X10_"s< τ彡8.0X10_1(ls的荧光激发寿命 τ ο而且，本发明提供了一种包含蛋白质的蛋白质光电转换器，所述蛋白质具有通过在牛心细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列，包含除了锌和锡以外的金属，并且具有5.0X10_"S< τ彡8.0X10_1(ls的荧光激发寿命 τ ο而且，本发明提供了一种包含金属取代的细胞色素c的蛋白质光电转换器，所述金属取代的细胞色素c通过用除了锌和锡以外的金属取代作为哺乳动物细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成且具有5. 0X10_"S < τ <8.0X10_1(ls的荧光激发寿命τ。而且，本发明提供了一种包含蛋白质的蛋白质光电转换器，所述蛋白质具有通过在哺乳动物细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列，包含除了锌和锡以外的金属，并且具有5.(^1(^8( τ彡8.0X10_1(ls的荧光激发寿命τ。在上述蛋白质光电转换器中，上述锡取代的马心细胞色素C、上述锡取代的牛心细胞色素C、上述蛋白质、上述锡取代的细胞色素C、上述金属取代的马心细胞色素C、上述金属取代的牛心细胞色素C和上述金属取代的细胞色素C典型地固定在电极上。作为电极的材料，可以使用无机材料或有机材料，且根据需要选择材料。除了其上固定了上述锡取代的马心细胞色素C、上述锡取代的牛心细胞色素C、上述蛋白质、上述锡取代的细胞色素C、上述金属取代的马心细胞色素C、上述金属取代的牛心细胞色素C或上述金属取代的细胞色素C的电极之外，这些蛋白质光电转换器各自还包含对电极。所述对电极被设置为面对所述电极。在如上所述构造的本发明中，上述锡取代的马心细胞色素C、上述锡取代的牛心细胞色素C、上述蛋白质、上述锡取代的细胞色素C、上述金属取代的马心细胞色素C、上述金属取代的牛心细胞色素C和上述金属取代的细胞色素C几乎不因光照射而导致光分解且能够长时间保持光电转换功能。根据本发明，上述锡取代的马心细胞色素C、上述锡取代的牛心细胞色素C、上述蛋白质、上述锡取代的细胞色素C、上述金属取代的马心细胞色素C、上述金属取代的牛心细胞色素C和上述金属取代的细胞色素C对于光照射具有极高的稳定性。因此，利用它们中的任一种可以实现能够长时间稳定使用的蛋白质光电转换器。
图1是示出根据本发明第一实施方式的锡取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱的测量结果的示意图。图2是示出根据本发明第一实施方式的锡取代的牛心细胞色素c的紫外可见吸收光谱的测量结果的示意图。图3是示出锌取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱的测量结果的示意图。图4是示出锌取代的牛心细胞色素c的紫外可见吸收光谱的测量结果的示意图。图5是示出在根据本发明第一实施方式的锡取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱中随时间变化的测量结果的示意图。
图6是示出在根据本发明第一实施方式的锡取代的牛心细胞色素c的紫外可见吸收光谱中随时间变化的测量结果的示意图。图7是示出在锌取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱中随时间变化的测量结果的示意图。图8是示出在锌取代的牛心细胞色素c的紫外可见吸收光谱中随时间变化的测量结果的示意图。图9是示出根据本发明第一实施方式的锡取代的马心细胞色素c和锡取代的牛心细胞色素c的光分解反应的二次反应方程(二阶反应方程)的拟合实例的示意图。图10是示出锌取代的马心细胞色素c和锌取代的牛心细胞色素c的光分解反应的二次反应方程的拟合实例的示意图。图11是示出在本发明的第一实施方式中在金属取代的细胞色素c上的光电流产生实验中使用的蛋白质固定电极的平面图。图12是示出图11中所示出的蛋白质固定电极的光电流作用光谱的测量结果的示意图。图13是示出图11中所示出的蛋白质固定电极的平均索雷谱带(Soret-band)光电流值的示意图。图14是示出各种类型的金属取代的细胞色素c的紫外可见吸收光谱的测量结果的示意图。图15是示出各种类型的金属取代的细胞色素c的荧光光谱的测量结果的示意图。图16是示出锡取代的马心细胞色素c和锌取代的马心细胞色素c相对于在409nm波长处的吸光度的累积荧光强度(积分荧光强度，integrated fluorescence intensities)的不意图。图17是示出锡取代的牛心细胞色素C、锌取代的牛心细胞色素c和锌取代的马心细胞色素c相对于在409nm波长处的吸光度的累积荧光强度的示意图。图18是示出根据本发明第二实施方式的蛋白质光电转换器的示意图。图19是示出根据本发明第二实施方式的蛋白质光电转换器的使用方式的第一实例的示意图。图20是示出根据本发明第二实施方式的蛋白质光电转换器的使用方式的第二实例的示意图。图21是示出根据本发明第二实施方式的蛋白质光电转换器的使用方式的第三实例的示意图。图22是示出根据本发明第三实施方式的非接触液体全固态蛋白质光电转换器 (liquid-uncontacting all-solid-state protein photoelectric transducer)白勺截0 图。图23是示出图22中所示的非接触液体全固态蛋白质光电转换器的主要部分的放大截面图。图M是用于描述根据本发明第三实施方式的非接触液体全固态蛋白质光电转换器的运行的示意图。图25是用于描述根据本发明实施例的非接触液体全固态蛋白质光电转换器的制造方法的平面图。图沈是用于描述根据本发明实施例的非接触液体全固态蛋白质光电转换器的制造方法的平面图。图27是示出根据本发明实施例的非接触液体全固态蛋白质光电转换器的截面图。图观是示出非接触液体全固态蛋白质光电转换器的光电流作用光谱的测量结果的示意图。图四是示出非接触液体全固态蛋白质光电转换器的背景电流-电压特性的测量结果的示意图。图30是示出非接触液体全固态蛋白质光电转换器的电流-电压特性的测量结果的示意图。图31是示出非接触液体全固态蛋白质光电转换器和液体蛋白质光电转换器的光电流作用光谱的测量结果的示意图。图32是示出非接触液体全固态蛋白质光电转换器和液体蛋白质光电转换器的光电流作用光谱的测量结果的示意图，其中将所述光谱标准化用于使光电流的峰值为1。图33是非接触液体全固态蛋白质光电转换器和液体蛋白质光电转换器的光劣化曲线的测量结果的示意图。图34是示出非接触液体全固态蛋白质光电转换器和液体蛋白质光电转换器的光劣化曲线的测量结果的示意图，其中将所述曲线标准化用于使在照射开始时光电流的峰值为1。图35是示出液体蛋白质光电转换器的频率响应的测量结果的示意图。图36是示出非接触液体全固态蛋白质光电转换器的频率响应的测量结果的示意图。图37是示出根据本发明实施例的非接触液体全固态蛋白质光电转换器的光电流作用光谱的测量结果的示意图。图38是示出根据本发明实施例的非接触液体全固态蛋白质光电转换器的光劣化曲线的测量结果的示意图。图39是示出锌取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱的测量结果的示意图。图40是示出在氩气氛中锌取代的马心细胞色素c的紫外可见吸收光谱的测量结果的示意图。图41是示出在添加自由基捕捉剂的情况下锌取代的马心细胞色素c的吸收光谱的测量结果的示意图。
具体实施例方式下面将描述用于实施本发明的最佳方式(在下文中称作“实施方式”)。应当注意， 以下列顺序给出描述。1.第一实施方式(锡取代的细胞色素C)2.第二实施方式(蛋白质光电转换器)3.第三实施方式(非接触液体全固态蛋白质光电转换器)
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4.第四实施方式(金属取代的细胞色素C)5.第五实施方式(蛋白质光电转换器)(1.第一实施方式)[锡取代的细胞色素C]表1示出了马心细胞色素c(由CYC_H0RSE表示)和牛心细胞色素c (由CYC_B0VIN 表示)的氨基酸序列(一个字母代码)。如表1中所示，在牛心细胞色素c和马心细胞色素 c之间在所有104个氨基酸残基中仅3个氨基酸残基是不同的。牛心细胞色素c包含氨基酸残基kr48、Gly61和Gly90而分别代替马心细胞色素c的Thr48、Lys61和Thr90。[表 1]sp :CYC_H0RSE 001 MGDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTGsp :CYC_B0VIN_001 MGDVEKGKKIFVQKCAQCHTVEKGGKHKTG48sp :CYC_H0RSE_031 PNLHGLFGRKTGQAPGFTYTDANKNKGITffsp :CYC_B0VIN_031 PNLHGLFGRKTGQAPGFSYTDANKNKGITff6190sp :CYC_H0RSE_061 KEETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKTsp :CYC_B0VIN_061 GEETLMEYLENPKKYIPGTKMIFAGIKKKGsp :CYC_H0RSE_091 EREDLIAYLKKATNE 104sp :CYC_B0VIN_091 EREDLIAYLKKATNE 104已知的是，与马心细胞色素c相比，在牛心细胞色素c中，蛋白质部分相对于心脏和变性剂(胍盐酸盐)具有更高的稳定性(参考非专利文献1和幻。表2示出了马心细胞色素c和牛心细胞色素c的变性中点温度T1/2和变性中点浓度KMn-HCl]1/2。变性中点温度T1/2是变性的蛋白质构成体系中所有蛋白质的一半(1/2)的温度。而且，变性中点浓度 KMn-HCl]1/2是变性的蛋白质构成体系中所有蛋白质的一半(1/2)的胍盐酸盐(Gdn-HCl) 的浓度。T1/2和[Gdn-HCl]1/2的值越高，稳定性越高。[表 2]
权利要求
1.一种蛋白质光电转换器，包含锡取代的细胞色素C，所述锡取代的细胞色素C通过用锡取代作为哺乳动物细胞色素C 的血红素的中心金属的铁而形成；或者蛋白质，所述蛋白质具有通过在哺乳动物细胞色素 C的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列且包含锡。
2.根据权利要求1所述的蛋白质光电转换器，其中，所述哺乳动物细胞色素c是马心细胞色素C。
3.根据权利要求1所述的蛋白质光电转换器，其中，所述哺乳动物细胞色素c是牛心细胞色素C。
4.一种锡取代的细胞色素c，所述锡取代的细胞色素c通过用锡取代作为哺乳动物细胞色素c的血红素的中心金属的铁而形成。
5.根据权利要求4所述的锡取代的细胞色素c，其中，所述哺乳动物细胞色素C是马心细胞色素C。
6.根据权利要求4所述的锡取代的细胞色素c，其中，所述哺乳动物细胞色素C是牛心细胞色素C。
7.一种蛋白质光电转换器，包含金属取代的细胞色素C，所述金属取代的细胞色素C通过用除了锌和锡以外的金属取代作为哺乳动物细胞色素C的血红素的中心金属的铁而形成，并且具有5. OX 10_"S < τ <8. OX ΙΟ—、的荧光激发寿命τ ；或者蛋白质，所述蛋白质具有通过在哺乳动物细胞色素c的氨基酸序列中删除、取代或添加一个或多个氨基酸而形成的氨基酸序列，包含除了锌和锡以外的金属，并且具有5. OXKT11sC τ彡8.0X10_1(ls的荧光激发寿命τ。
8.根据权利要求7所述的蛋白质光电转换器，其中，所述哺乳动物细胞色素c是马心细胞色素C。
9.根据权利要求7所述的蛋白质光电转换器，其中，所述哺乳动物细胞色素c是牛心细胞色素C。
10.根据权利要求7所述的蛋白质光电转换器，其中，所述除了锌和锡以外的金属是铍、锶、铌、钡、镥、铪、钽、镉、锑、钍或铅。
全文摘要
公开了一种新型蛋白质，所述蛋白质对于用光照射具有极高的稳定性且具有长寿命的光电转换功能；以及包含所述蛋白质且能够长时间稳定使用的蛋白质光电转换器。用锡取代作为位于马心细胞色素c的血红素的中心的金属的铁而产生了锡取代的马心细胞色素c。用锡取代作为位于牛心细胞色素c的血红素的中心的金属的铁而产生了锡取代的牛心细胞色素c。将包含锡取代的马心细胞色素c或锡取代的牛心细胞色素c的蛋白质(22)固定在电极(21)上以产生蛋白质固定电极。利用所述蛋白质固定电极形成了蛋白质光电转换器。
文档编号H01M14/00GK102484205SQ201080037189
公开日2012年5月30日 申请日期2010年8月9日 优先权日2009年8月28日
发明者后藤义夫, 山田齐尔, 户木田裕一, 罗玮 申请人:索尼公司