专利名称：设有能够均匀引入少量样本的样本引入通道的电化学生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种设有样本引入通道的电化学生物传感器，其中利用绝缘体均勻准 确地引入少量样本，并且调节工作电极的面积，从而保证准确定量地分析样本。
背景技术：
为了诊断和预防糖尿病，日益强调对血糖水平进行周期性监测的重要性。目前，设 计用于在手持读取装置中使用的条带型生物传感器通常基于比色法或电化学法，并允许个 人容易地监测血液中的葡萄糖水平。大量商用化的生物传感器使用电化学技术来分析血液葡萄糖水平。电化学技术可 由以下反应式I解释，特征在于使用电子转移介体(M)。[反应式I]葡萄糖+GOx-FAD —葡萄糖酸 +GOx-FADH2G0x-FADH2+M。x — G0x-FAD+Mred其中，GOx表示葡萄糖氧化酶；GOx-FAD和GOx-FADH2分别表示与葡萄糖相关的 FAD (黄素腺嘌呤二核苷酸)的氧化态和还原态，葡萄糖相关的FAD是葡萄糖氧化酶的催化 作用所需的辅因子；M。x和Mral分别表示电子转移介体的氧化态和还原态。电化学生物传感器使用的电子转移介体的例子包括二茂铁和其衍生物；奎宁和 其衍生物；包含过渡金属的有机或无机化合物，如六亚甲基四胺合钌、含锇的聚合物、铁氰 化钾等；有机导电盐；和紫精类化合物。在生物传感器中，基于以下原理来测量血糖水平。葡萄糖氧化酶的催化作用将血液中的葡萄糖氧化为葡萄糖酸，辅因子FAD同时被 还原为FADH2。然后，还原的辅因子FADH2将电子转移至介体，使得FADH2返回其氧化态；即， FAD和介体被还原。还原的介体扩散至电极的表面。施加在工作电极处的阳极电位驱动这 一系列反应循环，测量出与葡萄糖水平成比例的氧化还原电流。与基于比色法的生物传感 器相比，电化学生物传感器(即，基于电化学的)具有以下优点不受氧的影响，并允许使用 甚至是混浊的样本，而无需进行预处理。 传统生物传感器的样本弓I入通道大致分成“ i ”型和“-”型。典型地，“i”型样本引入通道构造成在平直采样通道的端部具有开口，从而引起 毛细现象。然而，这种“i”型样本引入通道的问题在于取决于样本的粘度，引入平直采样 通道的样本可能溢出或者可能未能到达位于平直通道端部的开口，从而引起样本量的不均 勻。典型地，“_”型样本引入通道构造成具有从传感器的一侧延伸至另一侧的通道。由 于该通道位于一侧并具有“_”型结构，因而使用者通过该样本引入通道引入样本是不方便 的。另外，样本引入时会产生涡流或漩涡，从而导致不能以恒量引入样本。为了克服这些问题，已经提出了一种化验装置，其中通过时间闸(timegate)对仅在样本进入之后端口变窄的试剂室和疏水区中的流动进行控制，从而防止涡流或漩涡(us 6，156，270)。然而，这种化验装置不适用于微升规模的样本，这是因为反应诱导性试剂在检 测区域之前与样本混合，并且疏水区较宽且具有波形。也就是说，这种化验装置不适于试剂 与样本混合并且检测反应必须在很窄的单元内进行的情况。 在传统的生物传感器中，样本引入通道被构造在工作电极、辅助电极或参考电极 上方的双面带或膜中，并且填充酶反应溶液。然而，该样本引入通道的缺点在于样本引入 通道极易受双面带或层叠膜的切割图案的影响，使得酶反应溶液不能均勻填充，或者引入 的样本量不恒定，从而导致测量误差。为了做出本发明，本发明人对将恒量的样本引入电化学生物传感器以进行准确分 析进行了深入透彻的研究，结果发现，具有与中板的毛细管图案一致的结构图案的绝缘体 能够有效地控制涡流或漩涡，因而能够将样本均勻地引入生物传感器，并能够提高分析准 确性。
发明内容
技术问题本发明的目的是提供一种设有能够将样本均勻准确地引入生物传感器中的样本 引入通道的生物传感器。技术方案为了实现上述目的，本发明提供了一种电化学生物传感器，其包括下板，在其上 构造有参考电极和用含有电子转移介体和氧化还原酶的试剂层涂布的工作电极；中板，其 具有由样本入口、样本通道和气孔构成的样本引入通道的预切割图案；和上板或盖子，用于 形成样本单元结构，其中在所述下板和所述中板之间设有由绝缘体形成的疏水性样本收集 挡板。有益效果由于在样本入口处设置了样本收集挡板，因此，形成在下板和中板之间的绝缘体 能够控制血样流入生物传感器，并且通过丝网印刷能够容易地制备，从而调节与样本反应 的工作电极的面积。因此，具有样本引入通道的生物传感器能够以高再现性和可靠性定量 地分析血样，并且由于制造简单而能够大规模生产。
图1是示出根据本发明实施例的电化学生物传感器的样本引入通道的分解立体 图；图2是示出根据本发明实施例的电化学生物传感器的样本引入通道的立体图；图3是示出根据本发明另一实施例的电化学生物传感器的样本引入通道的分解 立体图；图4是示出根据本发明又一实施例的电化学生物传感器的样本引入通道的分解 立体图；以及图5是示出设有根据本发明实施例的样本引入通道的电化学生物传感器的分解 立体图。
<附图标记的简要说明>100:样本引入通道101:样本入口102 样本通道103 样本气孔104:空隙空间105:工作电极106:参考电极107:电极连接部108:流动性感测电极200:中板300 上板400 下板500 下绝缘体501 样本收集挡板600 上绝缘体
具体实施例方式参照附图进行说明，在不同附图中相同的附图标记用于表示相同或相似的部件。参照图1和图2，分别以分解立体图和装配立体图示出根据本发明实施例的电化 学生物传感器的样本引入通道。如图1所示，根据本发明的生物传感器的样本引入通道包括依次层叠的下板 400、绝缘体500、设有样本引入通道100的中板200和上板(或者盖子)300。样本引入通道主要由样本入口 101、样本通道102和气孔103构成。 这里所使用的术语“样本入口 ”是指将样本弓丨入生物传感器的入口。术语“样本通 道”是指样本通过其流入生物传感器从而与工作电极反应的通道。术语“气孔”是指被构造 成允许空气通过的通道。当样本通过样本入口并被弓I入样本通道中时，存在于通道中的空 气通过气孔103排出，该气孔允许通过毛细现象引入样本。在根据本发明的生物传感器中，样本入口 101优选构造成朝向样本通道变窄，用 来收集样本流体。当样本通过样本入口流入样本通道中时，样本入口可以将样本流体导入 样本通道而不会引起涡流或漩涡，这是因为样本入口朝向样本通道变窄。此外，如图1所示，在绝缘体500中，在对应于中板200的样本入口端部的位置处 设有样本收集挡板501。当从样本入口将血样引入样本通道时，样本收集挡板501用于收集足量的血样以 产生有效的信号，使得血样能够在样本通道中均勻地分布。从图1可以看出，使用绝缘体 500可以形成样本收集挡板501。为了发挥其作用，样本收集挡板501优选1-ΙΟμπι高。样 本收集挡板降低了因样本不均勻引入所引起的不准确性，从而允许准确分析。在根据本发明的生物传感器中，样本通道102优选与气孔103交叉。这里使用的术语“交叉”是指样本通道102和气孔103不是线性设置的，而是在预 定点彼此相交。为了将样本快速引入生物传感器中，样本通道102与气孔103之间的宽度之比不 超过1 2，并且优选1 5 1 2。低于1 2的比例确保样本入口中保持精确量的样 本，并允许样本高速进入气孔。在图1中，样本通道102与气孔103之间的交叉角(φ)显示 为90°。但是，该角度可以在约45° 135°的范围内变化，优选在约60° 105°的范围 内变化，最优选在约75° 105°的范围内变化。样本通道102优选具有保持0.1 3. 0μ 1样本的容量。更优选地，其容量为0. 1 1. O μ 1，最优选0. 3 0. 7 μ 1。小于0. 1 μ 1的样本体积太小而不能在生物传感器的误差 范围内进行准确测量。相反，大于3. Ομ 的样本体积对于采样来说太多。在本发明实施例 中，即使小至0. 2 μ 1的量也足以保证准确的测量。空隙空间104可以设在样本通道与气孔之间的交叉处。由于在样本通道与气孔交 叉或相交的位置处设置额外的空间，因而空隙空间104用于防止形成气囊，气囊经常会在 样本通道与气孔之间的交点处形成。在交叉(或相交)点处，流过样本通道的样本与电极 接触。气囊的形成可能会导致不准确的测量。如图1所示，空隙空间104可以形成作为样 本通道的外延，但不限于此。例如，空隙空间可以按照与样本通道102和气孔103之间的角 度相同的角度形成。
如图1所示，在根据本发明的生物传感器中，形成在绝缘体500中的样本通道和气 孔优选具有与形成在中板200中的那些相同的结构。绝缘体丝网印刷在下板上，使得形成在绝缘体中的样本通道与中板的样本通道对 齐。因此，与使用双面带或层叠膜而没有绝缘体的样本通道相比，能够对经由样本通道露出 的工作电极105的露出区域进行更准确地调节。另外，可以在将中板与下板结合之前，分配 酶反应试剂。在传统的生物传感器中，随着试剂的干燥，试剂可能与双面带或层叠膜发生不 想要的化学反应。因此，在结合之前应用酶反应试剂可以防止不准确的测量。也就是说，在 工作电极上方均勻应用试剂促使准确的反应，从而提高分析的准确性。在样本引入通道100中，按如下方法将样本引入生物传感器中。当样本与样本入 口 101接触时，毛细现象使得样本通过样本入口 101进入样本通道中。此时，样本收集挡板 501用于在样本入口处挡住样本。当收集足够量时，样本通过样本入口流入样本通道。在样 本通道102填满之后，样本被导向气孔103。此外，为了防止在样本通道和气孔的相交处形 成气囊，进一步设置空隙空间104。在根据本发明的生物传感器的样本引入通道中，样本引入通道不限于形成在中板 200中的样本通道和气孔，而是可以形成为不同的图案。此外，可用绝缘体来控制弓I入至样本通道中的样本量。具体地，通过将样本通道的 长度调节为期望的长度能够控制血样量。由于空气不受绝缘体的影响而可将其排出到外 部，但是亲水性的血样在遇到绝缘体时则不能进一步向前移动。然而，在这种情况下，血样 沿着没有绝缘体的上板流动，从而引起诸如气囊的形成等不期望的结果。因此，如图3和图 4所示，上绝缘体600优选设在中板的样本通道的上方。图3和图4示出了根据本发明其他实施例的生物传感器的样本引入通道的分解立 体图。具体地，图3的样本引入通道包括下板400，在其上构造有用含有电子转移介体和 氧化还原酶的试剂层涂布的工作电极；丝网印刷在所述下板上的绝缘体500，其设有样本 收集挡板501，并且其中具有样本通道图案；中板200，其设有由样本通道102、气孔103和 样本入口 101的预切割图案构成的样本引入通道100，其中所述样本通道与所述气孔交叉， 并且在相交处留有空隙空间104，样本入口 101具有朝向样本通道变窄的对角线形状；绝缘 体600，用于防止样本从形成在中板和绝缘体中的样本通道移动到中板的气孔中；和上板 (或盖子)300，用于覆盖除了样本入口之外的样本引入通道，上述所有板依次层叠。在上板 和下板上方分别设有各自绝缘体的情况下，即使样本没有填满气孔也能够限定期望的样本 量，这样能够构造在中板中没有空隙空间的样本引入通道结构，如图4所示。
样本引入通道的结构可以应用于各种类型的生物传感器，包括例如在同一板上形 成工作电极、辅助电极和参考电极的扁平型生物传感器；形成在上板上的工作电极105面 对工作电极的倒置型生物传感器；或者以差动方式操作扁平型生物传感器和倒置型生物传 感器的差动型生物传感器。参照图5，示出了设有根据本发明优选实施例的上述结构的样本引入通道的扁平 型生物传感器的分解立体图。该扁平型生物传感器包括下板400，其上设置有包括电子转 移介体/氧化酶固定工作电极105和参考电极106的电极单元；丝网印刷在所述下板上的 疏水绝缘下板500，其设有样本收集挡板501，并且其中具有样本通道图案；中板200，其设 有由锥形样本入口 101、样本通道102和气孔103的预切割图案构成的样本引入通道100， 其中所述样本通道与所述气孔交叉，并且在相交处留有空隙空间104 ；绝缘体600，用于防 止样本从形成在中板和绝缘体中的样本通道移动到中板的气孔中；和上板(或盖子)300， 用于覆盖除了样本入口之 外的样本引入通道，上述所有板依次层叠。优选地，在样本引入通 道100中，样本通道与气孔交叉，并且样本入口沿着朝向样本通道的方向逐渐变窄。然而， 如上所述，可以改变样本引入通道的结构。此外，各种构形都可适用于上绝缘体和下绝缘体 的图案。电化学生物传感器的制备如下。首先，沿下板400的条带的长度方向使用碳或金 属印制或沉积倒置型电极(工作电极105和参考电极106)。在下板400上，通过丝网印刷 沉积绝缘体600，其图案使得工作电极的与样本反应的那部分露出。然后，将电子转移介体 和氧化酶分散并固定在工作电极的露出部分上。然后，将几百微米高度的设有样本引入通 道100的图案的中板200结合在层叠于下板上的绝缘体上，仅有电连接部露出。使用粘合 剂或双面胶带，可将下板400和中板200连接在一起。之后，使用粘合剂或双面胶带将其上 印制有绝缘体的上板(或盖子)300按压在中板200上。生物传感器的下板和上板可由陶瓷、玻璃板或聚合物制成，优选诸如聚酯、聚氯乙 烯和聚碳酸酯等有机聚合物。绝缘体的材料示例包括聚氨酯和聚丙烯酸酯。就包括参考电极、工作电极和参考电极的电极而言，它们的材料不受具体限制，只 要是导电的。适于电极的电气材料示例包括银环氧树脂、钯、铜、金、钼、铱、银/氯化银、碳 和用特定氧化还原对或其他添加剂改性的碳。参考电极、辅助电极和工作电极能够通过导 电材料的丝网印刷、物理气相沉积和蚀刻形成或者通过结合导电带形成。在电化学生物传感器中，通过毛细现象将血样吸到样本引入通道中。由于在样本 入口和样本通道之间存在锥形的样本入口和样本收集挡板，因而可将足量的血样均勻地引 入生物传感器中。另外，能够以预定图案将下绝缘体丝网印刷在设有电极单元的下板上，这 便于大量生产。此外，通过丝网印刷可对与样本反应的工作电极的露出区域进行准确调节， 从而提高测量的准确性、再现性和可靠性。存在于样本通道下侧和上侧的绝缘体允许样本 将样本通道填充至期望的位置，从而提高样本弓I入的再现性和可靠性。作为电子转移介体，可以使用二茂铁或其衍生物、醌或其衍生物、有机导电盐或紫 精类化合物。优选地，电子转移介体是能够形成氧化还原对的混合价化合物，包括氯化六胺 合钌(III)、铁氰化钾、亚铁氰化钾、DMF( 二甲基二茂铁)、二茂铁盐、FC00H( —元羧酸二茂 铁)、TCNQ(7，7，8，8-四氰基对苯二醌二甲烷)、TTF (四硫富瓦烯)、Nc( 二茂镍)、NMA+(N-甲基二吖啶盐)、TTT(四硫并四苯)、ΝΜΡ+(Ν-甲基吩嗪盐)、氢醌、MBTHDMAB(3-二甲基氨基苯 甲酸)、3_甲基-2-苯并噻唑啉酮腙、2-甲氧基-4-烯丙基苯酚、AAP (4-氨基安替比林)、二 甲苯胺、4-氨基安替嵌二萘(4-_1110￡111衍？71^1^)、4-甲氧基萘酚31^(3，3' ,5,5'-四甲 基联苯胺)，2，2-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)、邻联茴香胺、邻甲苯胺、2，4- 二 氯苯酚、4-氨基比林、联苯胺和普鲁士蓝。在这些材料中，优选氯化六胺合钌(III)，这是因 为它在水溶液中的氧化还原态是稳定和可逆的，相对于PH值不灵敏，并且它的克式量电位 (formal potential)足够低(约-0. 2 0. 2V)，从而可以将诸如抗坏血酸、对乙酰氨基酚 和尿酸等各种干扰组分的影响减到最小。这里，应注意的是，尽管描述了将本发明应用于生物传感器来分析血糖水平，但 本发明可以向电极系统引入适当的酶和电子转移介体，从而可以对包括生物材料、环保材 料、农业和工业材料以及食品材料的各种样本进行定量分析，上述生物材料例如是代谢物， 如胆固醇、乳酸酯、肌酸酐、蛋白质、氢过氧化物、醇类、氨基酸类和酶类，上述酶类例如是 GPT (谷氨酸丙酮酸转氨酶)和GOT (谷氨酸草酰乙酸转氨酶)。也就是说，只要选择与电子 转移介体相适应的适当酶，就可以分析多种代谢物的水平。例如，象用于葡萄糖水平的定量 分析的葡萄糖氧化酶那样，乳酸氧化酶可以应用于乳酸酯，胆固醇氧化酶应用于胆固醇，谷 氨酸氧化酶应用于谷氨酸酯，辣根过氧化酶应用于氢过氧化物，醇氧化酶应用于醇类。参照下面的示例可以更好地理解本发明，这些示例仅用于说明，并不对本发明构成限制。本发明的实施方式<实施例 > 生物传感器的制造通过丝网印刷碳膏构造与图5所示相同的工作电极和电连接部，随后在1400C下 热处理5分钟。然后，将银膏丝网印刷到电连接部的一端上，至与中板的电连接部相同的厚 度，从而完成电路连接。对于上板的电极，在与下板的电极相同的条件下，丝网印刷碳膏并 进行热处理，从而提供兼用作辅助电极的参考电极。在该参考电极的一端，利用银膏形成电 路连接，从而完成上板电极的构造。将一条聚酯基双面带压塑成具有与图5的中板所示相同的样本引入通道，其由样 本入口、样本通道、气孔和空隙空间构成。此时，样本通道和气孔被调节成具有4 1的宽 度比。样本引入通道的总容积为0.2 μ 1。使用丝网印刷法将设有与图5所示相同的样本收集挡板的绝缘体部设置于其上 构造电极的下板上方。接着，将每Iml含有0.015mg氯化六胺合钌(III)、0. 015mg分散剂 (羧甲基纤维素CMC)、0.01mg表面活性剂(商品名=Triton X-100)和40mg葡萄糖氧化酶 的混合溶液滴落到样本通道上的露出电极上，之后在45°C下热处理30分钟。在酶混合物 完全干燥之后，按压中板使其装配到下板上，并用上板覆盖，使得上板的电极与电路连接对 齐。〈比较例〉除了未设置具有样本收集挡板的疏水性下板之外，按照与上述实施例相同的方式 制造倒置型生物传感器。<实验例 > 样本入口处的样本收集挡板对生物传感器的准确分析的影响下面试验设在生物传感器的样本入口处的样本收集挡板对生物传感器的准确分析的影响。使用医院常用的测量装置(YSI 2300 stat plus)来测量三个血样的葡萄糖水平 (mg/dl)，并将测量得到的葡萄糖水平设为参考值。分别地，将各血样应用到实施例和比较 例中制造的倒置型生物传感器中，以量化葡萄糖水平。将这种量化重复五次，计算出平均 值、变异系数和标准偏差，并列于下表1中。 如表1所示，与使用没有样本收集挡板的生物传感器相比(比较例)(CV 2. 5-4. 2，标准偏差2. 3-17. 0)，当使用根据本发明的设有样本收集挡板的生物传感器对血 样进行分析时，可以发现其平均值更接近于参考值，CV (变异系数)为0. 8 1. 3，STDEV (标 准偏差)为1. 2 3. 9，这表明样本收集挡板能够提高分析准确性。工业实用性由于在样本入口处设置了样本收集挡板，因此，根据本发明的生物传感器能够以 较高的准确性引入样本，并且能够以较高的再现性和可靠性进行分析。尽管为了说明目的已经公开了本发明的优选实施例，但是本领域技术人员可以认 识到，在不背离所附权利要求书中公开的本发明的范围和精神的前提下，可以进行各种修 改、添加和替换。
权利要求
一种电化学生物传感器，其包括下板，在其上构造有参考电极和用含有电子转移介体和氧化还原酶的试剂层涂布的工作电极；中板，其具有由样本入口、样本通道和气孔构成的样本引入通道的预切割图案；和上板或盖子，用于形成样本单元结构，其中在所述下板和所述中板之间设有由绝缘体形成的疏水性样本收集挡板。
2.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其中所述样本引入通道具有所述样本通 道与所述气孔交叉的预切割图案，并且所述样本入口具有朝向所述样本通道变窄的对角线 形状。
3.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其中所述绝缘体具有使得所述样本收集 挡板以预定高度设在所述样本入口处并且能够准确控制所述工作电极面积的预切割图案。
4.根据权利要求3所述的电化学生物传感器，其中所述绝缘体的预切割图案被丝网印 刷在所述下板上，使得所述绝缘体的图案与所述包括样本入口、样本通道和气孔的中板的 图案一致，从而准确地调节所述工作电极的面积。
5.根据权利要求4所述的电化学生物传感器，其中所述绝缘体形成在所述气孔的上方。
6.根据权利要求5所述的电化学生物传感器，还包括在对应于所述气孔位置处的位于 所述上板与所述中板之间的绝缘体。
7.根据权利要求1所述的电化学生物传感器，其中在限制所述样本通道长度的位置 处，在所述下板与所述中板之间以及在所述中板与所述上板之间设置各绝缘体，从而将样 本引入到所述样本通道的期望位置。
8.根据权利要求1 7中任一项所述的电化学生物传感器，其中所述绝缘体由聚氨酯 或聚丙烯酸酯制成。
全文摘要
本发明公开了一种具有样本引入通道的电化学生物传感器，其中利用绝缘体均匀准确地引入少量样本，并且调节工作电极的面积，从而保证准确定量地分析样本。由于在样本入口处设置了样本收集挡板，因此，该生物传感器允许以较高的准确性引入样本，并且能够以较高的再现性和可靠性进行分析。
文档编号G01N33/48GK101842702SQ200880113622
公开日2010年9月22日 申请日期2008年10月24日 优先权日2007年10月29日
发明者俞在炫, 南学铉, 崔刚, 车根植, 金周勇, 金文焕, 金槿起 申请人:爱-森斯株式会社