利用含二乙炔的聚合物传感器分析细菌样品的方法

专利名称：利用含二乙炔的聚合物传感器分析细菌样品的方法
利用含二乙炔的聚合物传感器分析细菌样品的方法政府权利根据由国防部批准的合同No.DAAD-13-03-C-0047(项目No. 2640)的条款，美国政 府可享有本发明的某些权利。相关专利申请的交叉引用本申请要求于2007年11月20日提交的美国临时专利申请No. 60/989，298的优 先权，所述文献以引用方式并入本文中。
背景技术：
对常用抗生素具有耐药性的细菌的出现是影响感染者治疗的一个日益严重的问 题。因此，早期确定这种细菌的存在并且利用相对迅速的方式来较好地控制这种细菌就变 得越来越重要。这也适用于多种其他微生物。一种受到广泛关注的上述微生物为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus), (“S. aureus”)。这是一种病原体，可引起广谱感染，包括表面损伤，例如小面积的皮肤脓 肿和伤口感染；系统的和危及生命的病症，例如心内膜炎、肺炎和败血病；以及诸如食物中 毒和中毒性休克综合征之类的中毒症。一些菌株(如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)能够 耐受除少数选定的抗生素外的几乎所有抗生素。用于检测微生物(尤其是耐受抗生素的微生物)的现有技术一般是耗时的并且 通常涉及培养纯态的细菌。一种用于识别与急性感染相关的病原体葡萄球菌(即，人和 动物中的金黄色葡萄球菌以及动物体内的中间葡萄球菌(S. intermedius)和猪葡萄球菌 (S. hyicus))的此类技术是基于微生物使血浆凝固的能力。已描述了至少两种不同的凝固 酶试验用于游离凝固酶的试管试验以及用于“细胞结合性凝固酶”或凝聚因子的载玻片 试验。试管凝固酶试验通常包括将培养物在脑心浸剂肉汤中与重组血浆混合过夜、将该混 合物孵育4小时并且通过缓慢地倾斜试管来观察用于血块形成的试管。对于金黄色葡萄球 菌，已推荐将其孵育过夜，因为少量的菌株可能需要超过4小时来完成血块形成。载玻片凝 固酶试验通常较快并且较经济；然而，金黄色葡萄球菌菌株中的10%至15%可产生阴性结 果，这需要通过试管试验进行重新检查来分离。尽管检测金黄色葡萄球菌以及其他微生物的方法在本领域中已有所描述，但改进 的检测方法将是有利的。

发明内容
本发明提供了用于分析所关注的细菌样品的方法。具体地讲，所述方法可用于检 测具有所关注细菌特性的一种或多种分析物，例如具有细菌(尤其是金黄色葡萄球菌)特 性的细胞壁组分。所述方法使用包括比色传感器的检测分析法，所述比色传感器通过检测由分析物 和/或探测剂的相互作用而产生的光谱变化来检测分析物的存在，其中所述相互作用方 式造成了比色传感器中含二乙炔的聚合物组分的构象变化。用于本发明的方法中的比色传感器(即，传感器组件)优选包括至少一种含二乙炔的聚合组合物；结合到所述聚合组合 物中形成转导物的受体；其中所述转导物与分析物和/或探测剂接触时显示颜色变化。检 测分析法通常还包括用于调节分析物和转导物之间的相互作用的缓冲组合物。在一个实施例中，提供了分析细菌样品的方法，所述方法包括提供疑为包括具有 特定细菌特性的一种或多种不同分析物的样品；提供一种或多种抗体，所述抗体对具有特 定细菌的特性的一种或多种不同分析物(分析物可为例如诸如蛋白A和凝聚因子之类的单 独分子或同一分子的两个不同表位)具有抗原特异性；提供固体载体材料；在能有效捕集 一种或多种具有特定细菌(如果存在的话)的特性的分析物的条件下，使样品、固体载体材 料以及一种或多种抗体接触；提供包括聚合组合物的比色传感器，所述聚合组合物包含含 二乙炔的聚合物和受体，其中所述受体结合到所述聚合组合物中以形成转导物，该转导物 在与一种或多种探测剂和/或分析物结合时提供颜色变化；任选地从固体载体材料处移除 一种或多种分析物(如果存在的话)；以及在捕集和任选地移除一种或多种分析物之后，通 过比色传感器对所述一种或多种分析物(如果存在的话)进行直接或间接分析，从而分析 出特定细菌的存在与否(如，通过一种或多种分析物的存在或所有分析物的均不存在)。在某些实施例中，使一种或多种抗体附着到固体载体材料上从而形成分析物结合 材料，并且所述方法包括在能有效捕集一种或多种具有特定细菌(如果存在的话)的特性 的分析物的条件下，使样品与分析物结合材料接触。在某些实施例中，分析物结合材料包括两种或多种抗体，所述抗体对于具有特定 细菌的特性的两种或多种不同分析物具有抗原特异性。所述两种或多种抗体优选在其结合 特性方面相互协同。即，它们能够同时结合至靶分析物的不同区域或者可任选地是，据信它 们具有互补结合性，由此不同分析物的结合性通过另一种抗体的结合而得到增加。抗体可为单克隆的、多克隆的或它们的组合。在某些实施例中，抗体选自MAb-76、 MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的GxClf40，MAb 12_9、它们的片段以及它们的组
口 O在某些实施例中，固体载体材料包括颗粒材料。优选地是，颗粒材料包含磁性颗 粒。在某些实施例中，分析物结合材料包括含有至少两部分的颗粒材料，其中颗粒材 料的一部分具有对其上设置的一种分析物有特异性的一种抗体，并且第二部分具有对其上 设置的不同分析物有特异性的另一种抗体。颗粒材料的两部分可包含相同类型的颗粒。例 如，颗粒材料可包含至少两种不同类型的颗粒或者相同类型的颗粒，其中两种不同的抗体 附着到不同的颗粒上。优选地是，具有特定细菌的特性的一种或多种分析物存在于全细胞上。因此，本发 明的某些方法涉及培养全细菌细胞。使样品、固体载体材料以及一种或多种抗体接触可包括在样品、固体载体材料以 及一种或多种抗体之间进行同时和/或顺序(按任何所需的顺序)接触，优选为同时接触。在某些实施例中，特定细菌包括革兰氏阳性菌。某些特别关注的特定细菌包括金 黄色葡萄球菌。在一个实施例中，本发明提供了分析细菌样品的方法，所述方法包括提供包含全 细胞的样品，所述全细胞疑为包含一种或多种具有特定细菌的特性的不同分析物；提供包含磁性颗粒的分析物结合材料，其中所述磁性颗粒具有在其上设置的一种或多种抗体，所 述抗体对具有特定细菌的特性的一种或多种不同分析物具有抗原特异性；提供包括聚合组 合物的比色传感器，所述聚合组合物包含至少一种含二乙炔聚合物和受体，其中所述受体 结合到所述聚合组合物中以形成转导物，该转导物在与一种或多种探测剂和/或分析物结 合时提供颜色变化；在能有效捕集一种或多种具有特定细菌(如果存在于全细胞上)的特 性的分析物的条件下，使样品与分析物结合材料接触；任选地从分析物结合材料处移除一 种或多种分析物(如果存在的话)；及在捕集和任选地移除所述一种或多种分析物之后，通 过比色传感器对所述一种或多种分析物(如果存在的话)进行直接或间接分析，从而分析 出特定细菌的存在与否。在另一个实施例中，本发明提供了分析金黄色葡萄球菌细菌样品的方法，所述方 法包括提供包含全细胞的样品，所述全细胞疑为包含一种或多种具有金黄色葡萄球菌特 性的不同分析物；提供包含磁性颗粒的分析物结合材料，其中所述磁性颗粒具有在其上 设置的一种或多种抗体，所述抗体对具有金黄色葡萄球菌特性的一种或多种不同分析物 具有抗原特异性；其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的 GxClf40,MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合；提供包括聚合组合物的比色传感器，所述 聚合组合物包含至少一种含二乙炔聚合物和受体，其中所述受体结合到所述聚合组合物中 以形成转导物，该转导物在与一种或多种探测剂和/或分析物结合时提供颜色变化；在能 有效捕集一种或多种具有金黄色葡萄球菌细菌(如果存在于全细胞上)特性的分析物的条 件下，使样品与分析物结合材料接触；任选地从分析物结合材料处移除一种或多种分析物 (如果存在的话)；以及在捕集和任选地移除一种或多种分析物之后，通过比色传感器对所 述一种或多种分析物(如果存在的话)进行直接或间接分析，从而分析出金黄色葡萄球菌 的存在与否。在某些实施例中，所述方法包括直接分析并且通过比色传感器对一种或多种分析 物(如果存在的话)进行直接分析包括使所述一种或多种分析物与比色传感器接触。在某些实施例中，所述方法包括间接分析，其涉及使用一种或多种探测剂。优选地 是，这种方法还包括提供一种或多种探测剂；在捕集之前、捕集之后或者在任选地从固体 载体材料中移除之后，提供使探测剂有效结合至一种或多种分析物(如果存在的话)的条 件；以及使未结合探测剂和比色传感器接触以分析特定细菌的存在与否。“全细胞”是指在从其他生物材料处分离期间其结构保持完整的、但无须能够进行 生殖的生物活性细菌细胞。术语“分析物”和“抗原”可互换使用并且是指具有所关注微生物(即，细菌)的 特性的各种分子(如，蛋白A)或分子表位(如，蛋白A的不同结合位点)或者微生物的全 细胞或细胞片段。这些物质包括细胞壁的成分(如，细胞壁蛋白，例如蛋白A和凝聚因子， 所述凝聚因子为存在于金黄色葡萄球菌中的细胞壁相关的纤维蛋白原受体)、细胞外成分 (如，荚膜多糖和胞壁碳水化合物)等。“从分析物结合材料处移除一种或多种分析物”是指移除具有所关注微生物特性 的各种分子、分子表位、全细胞或细胞片段。“使未结合探测剂与比色传感器接触”是指在探测剂和比色传感器之间提供接触， 但无须在(例如)特定的分析物结合位点(如，分析物上的抗体的结合位点)和比色传感器之间进行直接接触。“使一种或多种分析物与比色传感器接触”是指在具有所关注微生物特性的各种 分子、分子表位、全细胞或细胞片段之间提供接触。这无须在例如特定的分析物结合位点 (如，分析物上的抗体的结合位点)和比色传感器之间进行直接接触。“磁性颗粒”是指由铁磁的、顺磁的、超顺磁颗粒构成的颗粒或颗粒团聚物，包括所 述颗粒在聚合物珠中的分散体。单词“优选的”和“优选地”指在某些情况下，可提供某些有益效果的本发明实施 例。然而，在相同的情况或其他情况下，也可以优选其他实施例。此外，对一个或多个优选 实施例的详述并不意味着不可使用其他实施例，而且并无意于将其他实施例排除在本发明 范围之外。出现在说明书和权利要求书中的术语“包含”及其变型不具有限制性含义。如本文所用，“一”、“一种”、“所述”、“至少一种”和“一种或多种”可互换使用。因 此，例如，包含“一种”抗体的分析物结合材料可被解释为指包含结合不同分析物的“一种或 多种”抗体的分析物结合材料。术语“或” 一般以包括“和/或”的意思使用，除非内容另外清楚指明。术语“和/或”意指所列要素的一个或全部，或所列要素的任何两个或更多个的组
I=I O另外在本文中，通过端点列举的数字范围的表述包括在所述范围内包含的所有数 字(例如，1 至 5 包括 1,1. 5、2、2· 75,3,3. 80、4、5 等)。本发明的以上发明内容并不旨在描述本发明的每个公开的实施例或每种具体实 施方式。以下说明更具体地举例说明示例性的实施例。在本申请全文中的若干处通过列举 实例提供指导，可以使用这些实例的不同组合。在每种情况下，所列举的例子只是作为代表 性的组类，不应解释为排他性的列表。


图1示出了位于测定室的溶液中的传感器的实施例。图2示出了位于基底上的传感器层或部分的实施例。图3示出了具有传感器层或部分以及流通隔膜的检测设备，其中该设备的主体是 由多层构造形成的。
具体实施例方式本发明涉及基于对具有所关注细菌特性的一种或多种分析物的分析来分析所关 注细菌样品的各种方法。本发明的方法可不仅涉及检测具有所关注细菌特性的分析物的存 在，而且优选涉及识别这种分析物，这可导致识别出该分析物所代表的细菌。在某些实施例 中，分析样品包括量化具有所关注细菌特性的分析物。本发明提供了检测特定分析物的方法，检测方式为将捕集所关注靶分析物的样品 制剂体系与使用比色传感器的检测分析法进行组合。样品制剂体系包含专门用于捕集一种 或多种所关注分析物的材料，所述分析物在被捕集时可存在于(例如)一种或多种全细胞 上。
9
优选地是，本发明的方法涉及初始捕集法，其包括使用对一种或多种并且优选两 种或多种具有特定细菌的特性的不同分析物具有抗原特异性的一种或多种并且优先两种 或多种抗体。如果使用两种或多种抗体，那么它们优选在其结合特性方面相互协同。即，它 们能够同时结合至靶分析物的不同区域或者最佳地，发现它们具有互补结合性，由此不同 分析物的结合性通过另一种抗体的结合而得到增加。在特定细菌的初始捕集之后，本发明的方法中的分析技术涉及比色技术，尤其是 使用包括聚二乙炔(PDA)材料的比色传感器。更具体地讲，比色传感器包括聚合组合物，所 述聚合组合物包含受体和含二乙炔的聚合物材料(聚二乙烯组分)，其中所述受体结合到 所述聚合组合物中以形成转导物，该转导物在与一种或多种探测剂和/或分析物结合时能 够提供颜色变化；用于检测一种或多种具有特定细菌特性的靶分析物的初始步骤涉及包括分析物 捕集剂的样品制剂。这优选涉及使分析物结合材料与疑为包含所关注细菌(即，靶细菌)的 样品接触，从而使得分析物结合材料来捕集具有靶细菌特性的分析物(即，靶分析物)。作 为另外一种选择，可使所关注样品与分析物结合材料的单独成分(如，抗体和磁性颗粒)同 时结合。通常的样品可包括可变量的干扰物。干扰物为可妨碍检测分析法感测靶分析物的 能力的其他生物成分和化合物。通常的样品也可从样品采集设备例如拭子中洗脱出来，并 且由此可从该样品采集设备中提取在由该采集设备收集的原始样品中不存在的干扰物。尤其优选的样品制剂体系为包含分析物结合材料和洗脱缓冲液的体系，其中当降 低(并且优选地，消除)样品内的潜在干扰物的捕集(非特异性捕集)时，所述洗脱缓冲液 优先地捕集靶分析物。优选的分析物结合材料包括磁性固体载体材料，尤其是磁性颗粒。 在利用这种磁性颗粒完成捕集步骤之后，通常使用磁体来收集和聚集其上附着有分析物 (即，捕集分析物)的颗粒，这样使得包含潜在干扰物的样品的其余得到移除。然后若需要 的话将带有捕集分析物的颗粒(即，颗粒-分析物复合体)重新悬浮于清洁的缓冲液中，以 便洗涤弱结合污染物的颗粒_分析物复合体。若需要可重复此洗涤过程若干次。在分析物被捕集之后，所述分析法涉及使用比色传感器进行分析。优选地是，所述 分析法涉及使比色传感器与带有捕集分析物的分析物结合材料(如，颗粒-分析物复合体) 接触。作为另外一种选择，可在分析物结合材料与比色传感器接触之前从该分析物结合材 料中移除捕集分析物。比色传感器可用于溶液中或者可被涂覆至基底上。一般而言，如图1所示，传感器 (即，传感器组件)100处于传感器室122内的溶液120中。如图所示，室122可设置在位于 第一流体通道部分124和第二流体通道部分126之间的流体通道内。使疑为包含所关注分 析物的试验样品流入室122内以便与溶液120混合。在混合时，所关注分析物(如果试验 样品中存在的话)与传感器组件100的受体结合，从而产生可察觉的变化。图2示出了其中传感器组件100是由位于基底132 (例如，薄膜隔膜、多孔隔膜或 其他基底)上的传感器层或部分130形成的示例性实施例。在一个实例中，传感器层或部 分130包括沉积在薄膜隔膜或其他基底上的聚二乙炔脂质体。在溶液中，传感器可用于直接或间接(竞争)分析中。在溶液内的直接分析中，可使带有捕集分析物的分析物结合材料(例如悬浮在合适的缓冲液中的颗粒_分析物复合体)或者已被捕集并且然后从分析物结合材料中移出的 分析物直接结合至比色传感器，以产生颜色变化。在溶液内的间接分析中，首先使一种或多种探测剂与其上附着有捕集分析物的分 析物结合材料或者与已被捕集并且随后从分析物结合材料中移出的分析物相互作用，然后 使未结合的探测剂结合至比色传感器，以产生颜色变化。在涉及间接分析的优选方法中，颗粒-分析物复合体悬浮于合适的缓冲液中，使 一种或多种探测剂与这种复合体在能有效形成颗粒_分析物_探测剂复合体的条件下进行 结合，使所述颗粒_分析物_探测剂复合体从该液相中分离出来(如，当颗粒具有磁性时通 过施加磁场的方式)，并且在如下条件下将比色传感器引入该液相中，所述条件允许未结合 的探测剂结合至比色传感器，以产生颜色变化。在此间接方式中，可使用未结合探测剂的浓 度来确定原始存在的捕集分析物的浓度。尽管在使未结合的探测剂结合至比色传感器之前 移除颗粒_分析物_探测剂复合体是理想的，但这不是必须的，因为颗粒_分析物_探测剂 复合体不会通过与未结合探测剂相同的效能来与比色传感器反应。在溶液中进行分析所导致的颜色变化可在视觉上检测到。作为另外一种选择，如 果需要较高的敏感性，则可使用合适的流体系统将比色传感器材料聚集到固相上，从而增 强颜色变化。对于涂覆到基底上的比色传感器，也可以使用比色直接和间接分析法。在这 些分析法中，并非将比色传感器材料放置在溶液中，而是通过合适的流体系统使涂覆的 比色传感器暴露于此溶液相，正如提交于2007年11月20日的、名称为“检测设备和方 法”(DETECTION DEVICES AND METHODS)的申请人的受让人的共同待审的美国专利申请序 列No. 60/989，291中所公开的。这种流体系统尤其优选的实施例在本文示于为实例32-34 和图3中，该图示出了具有传感器层或部分以及流通隔膜的检测设备，其中该设备的主体 是由多层构造形成的。明显地是，这种特定细菌或具有其特性的分析物的初始捕集允许使用“通用的”传 感器系统进行检测。其还允许使用如下系统进行检测，所述系统能够在无须进行修改以将 其定制到所关注靶的条件下来检测多种细菌。例如，单个转导物(聚二乙炔/受体结合体) 可适用于通过如下方式来检测多种特定细菌，所述方式为使其与对给定的靶细菌具有特异 性的样品制剂进行结合。有利地是，本发明的方法相对其他的重点照护试验(例如侧流免疫分析法)可具 有改善的灵敏性和特异性。如在本文所示的实例中进一步所述，金黄色葡萄球菌在IXlO5 菌落形成单位(“cfu”)/毫升、lX104cfu/mL以及lX103cfu/mL的浓度下可被检测到。因 此，本领域的普通技术人员应当理解，可使用本发明的方法来检测浓度低至1 X IO3CfuAiL 的靶分析物。也可检测较高含量的靶分析物，例如，范围高达5X107cfu/mL。有利地是，本发明的方法相对诸如侧流免疫分析法之类的其他重点照护试验以及 相对培养方法而言，可具有改善的总体检测时间。即，本发明的方法可在相对较短的时间段 内检测一种或多种分析物。例如，此前所述的任何浓度的金黄色葡萄球菌的检测时间可低 于60分钟(如，60分钟、30分钟、15分钟、10分钟或5分钟)。利用本发明的方法，捕集时间可相对较短。例如，捕集时间可低于30分钟、低于15 分钟、低于5分钟、低于60秒或甚至短至30秒。这些组合物还可包括缓冲液，例如任选具有PLURONIC L-64表面活性剂的磷酸盐缓冲溶液(PBS)、乙二胺四乙酸(EDTA)、牛血清白蛋 白(BSA)或它们的组合。尽管可对大颗粒(如，平均粒度为1微米(公丝或ym)和小颗粒 (如，平均粒径为200纳米(nm))使用物理搅拌(或混合)，但小颗粒可在不进行混合的情 况下使用。利用本发明的方法，检测时间可相对较短。例如，检测时间可低于30分钟、低于15 分钟、低于10分钟、低于5分钟或甚至低至1分钟。可使用具有相对较小体积的试验样品。尽管可使用高达1-2毫升(mL)的试验样 品体积，但有利地是，接近10微升(μ 的试验样品足以用于本发明的方法中，并且对某些 实施例而言优选最高为200 μ L0分析物结合材料反应物分子使样品与合适的反应物分子接触以用于分析物的结合(如，包含细菌识别试剂的 分析物结合材料)。这种反应物分子包括例如抗体。可将这种抗体附着到颗粒材料、隔膜 或其他固体载体材料上。尤其优选的反应物分子为那些能够与靶全细胞直接相互作用的分 子，特别是全细胞表面抗原的抗体以及已知与全细胞表面相互作用的其他蛋白(例如蛋白 Α)。在本发明的方法中可用于捕集靶分析物(如，靶全细胞)的分析物结合材料一般 包括通过偶联(非共价地或共价地)衍生的固体载体材料，以承载结合靶分析物的反应物 分子。优选地是，使包含靶分析物(如，靶全细胞)的样品与分析物结合材料接触以便结合 靶分析物，并且将未结合的剩余混合物从载体中移除。可从载体中移除(如，洗脱)结合的分析物从而获得纯化的靶分析物，或者可在结 合的分析物附着到分析物结合材料上时进行处理。这可通过例如使用洗涤缓冲液以及改变 PH值和/或离子强度来实现。例如，可利用诸如2-咪唑生物素之类的生物素的某些衍生 物，其以PH敏感的方式结合至抗生物素蛋白。在9和11之间的ρΗ下孵育样品和微珠，在 此PH下抗生物素蛋白与2-咪唑生物素发生强烈的相互作用。在捕集之后，通过将ρΗ改变 至6或更高或者通过添加抗生物素蛋白(降低生物素和抗生物素蛋白之间的相互作用)来 从微珠中洗脱出靶。如上所述，全细胞上的靶分析物可通过反应物分子(如，金黄色葡萄球菌反应物 分子或金黄色葡萄球菌的细菌识别试剂)进行检测。在一些实施例中，将一种或多种抗体 (例如，金黄色葡萄球菌抗体)用作金黄色葡萄球菌反应物。“金黄色葡萄球菌抗体”是指 具有特异性结合给定抗原(包括其抗原结合片段)的能力的免疫球蛋白。术语“抗体”旨在包括具有多种同种型(IgG、IgA、IgM、IgE等)的所有抗体及其得 自脊椎动物(如，哺乳类动物)的片段，其也可与外源化合物(如，蛋白)进行特异性反应。抗体可为单克隆的、多克隆的或它们的组合。可使用常规的技术将抗体分成片段， 并且可筛选这些片段以按照与全细胞抗体相同的方式进行使用。因此，该术语包括能够与 某种蛋白选择性反应的抗体分子的蛋白裂解或重组制备部分的片段。这种蛋白分解和/或 重组的片段包括Fab、F(ab’)2、Fv以及包含通过肽连接物连接的VL和/或VH结构域的单 链抗体(scFv)。scFv可进行共价或非共价地连接以形成具有两个或多个结合位点的抗体。 可利用本领域技术人员已知的多种可检测部分来标记抗体。在一些方面，结合到希望进行 测量的分析物上的抗体(一抗)不被标记，但作为替代，其可通过特异性结合至该一抗的经
12标记二抗或其他试剂来进行间接地检测。各种金黄色葡萄球菌抗体为本领域已知的。例如，金黄色葡萄球菌抗体可从西戈 玛-艾尔德里奇(Sigma-Aldrich)和精细化学(Accurate Chemical)公司商购获得。另外， 其他的金黄色葡萄球菌抗体，例如单克隆抗体Mab 12-9，描述于美国专利No. 6，979，446 中。在某些优选实施例中，抗体选自本文所述的那些(如，选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化 的RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAbl2-9、它们的片段以及它们的组合)。这些抗体还公开 于名称均为“具有蛋白A选择性的抗体”(“ANTIBODY WITH PROTEIN A SELECTIVITY”)的美 国专利申请公开No. 2008-0118937和PCT申请No. US2007/084, 736中以及名称均为“具有 蛋白A选择性的抗体”("ANTIBODY WITH PROTEIN A SELECTIVITY”)的美国专利申请序列 No. 11/562，747 (提交于2006年11月22日)和PCT申请系列No. US2007/084, 739中以及提 交于2006年11月22日的美国专利申请系列No. 60/867，089和提交于2007年11月20日 的美国专利申请系列No. 11/943，168中，后两者的名称均为“通过选择性洗脱条件的特异 性抗体的选择，，(“SPECIFIC ANTIBODY SELECTION BY SELECTIVE ELUTI ON CONDITIONS”)。优选的抗体为单克隆抗体。尤其优选的抗体为结合至金黄色葡萄球菌(本文中也 称为“S. aureus”或“Staph Α”)的蛋白A的单克隆抗体。更具体地讲，在一个实施例中，合适的单克隆抗体及其抗原结合片段为可证明由 杂交瘤细胞系358A76. 1产生的单克隆抗体76的免疫结合特性的那些。鼠单克隆抗体76 为鼠IgG2A，即从利用蛋白A免疫的鼠内分离的κ抗体。根据布达佩斯条约，将产生单克 隆抗体76的杂交瘤358A76. 1于2006年10月18日保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC) 仓库(10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)中，并且给定专利保藏名 PTA-7938(本文中也称为登录号PTA-7938)。杂交瘤358A76. 1产生了在本文中称作“Mab 76”的抗体。Mab 76在本文中也称作“Mab76”、“Mab-76”、“MAb_76”、“单克隆76”、“单克 隆抗体76”、“76”、“M76”或“M 76”，并且所有的名称在本文中可互换使用以用来表示由在 2006年10月18日保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC)的并且指定登录号为PTA-7938的 杂交瘤细胞系358A76. 1产生的免疫球蛋白。在另一个实施例中，合适的单克隆抗体及其抗原结合片段为可证明由杂交瘤细 胞系358A107. 2产生的单克隆抗体107的免疫结合特性的那些。鼠单克隆抗体107为鼠 IgG2A，即从利用蛋白A免疫的鼠内分离的κ抗体。根据布达佩斯条约，将产生单克隆抗 体107的杂交瘤358A107. 2于2006年10月18日保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC) 仓库(10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209)中，并且给定专利保藏名 PTA-7937 (本文中也称为登录号PTA-7937)。杂交瘤358A107. 2产生了在本文中称作“Mab 107” 的抗体。Mab 107 在本文中也称作 “Mabl07”、“Mab-107”、“MAb-107”、“单克隆 107”、 “单克隆抗体107”、“107”、“M107”或“M 107”，并且所有的名称在本文中可互换使用以用来 表示由在2006年10月18日保藏在美国模式培养物保藏所(ATCC)的并且给定登录号为 PTA-7937的杂交瘤细胞系产生的免疫球蛋白。合适的单克隆抗体也可为能抑制单克隆抗体MAb-76结合至金黄色葡萄球菌的蛋 白A的那些。本发明可使用可结合至由单克隆抗体MAb-76识别的金黄色葡萄球菌的蛋白A 的同一表位的单克隆抗体。用于确定单克隆抗体是否抑制单克隆抗体MAb-76结合至金黄 色葡萄球菌的蛋白A以及确定单克隆抗体是否结合至由单克隆抗体MAb-76识别的金黄色葡萄球菌的蛋白A的同一表位的方法是免疫领域的技术人员所熟知的。合适的单克隆抗体也可为能抑制单克隆抗体MAb-107结合至金黄色葡萄球菌的 蛋白A的那些。本发明可使用可结合至由单克隆抗体MAb-107识别的金黄色葡萄球菌的蛋 白A的同一表位的单克隆抗体。用于确定单克隆抗体是否抑制单克隆抗体MAb-107结合至 金黄色葡萄球菌的蛋白A以及确定单克隆抗体是否结合至由单克隆抗体MAb-107识别的金 黄色葡萄球菌的蛋白A的同一表位的方法是免疫领域的技术人员所熟知的。合适的单克隆抗体为由这种杂交瘤的子代或衍生物产生的那些抗体以及由相同 的或相似的杂交瘤产生的单克隆抗体。另外适用于本发明的抗体包括各种抗体片段，也称作抗原结合片段，其仅包括完 整抗体的一部分，并且通常包括完整抗体的抗原结合位点，从而保留了结合抗原的能力。抗 体片段的实例包括例如通过蛋白水解消化和/或还原二硫键产生的Fab、Fab’、Fd、Fd’、Fv、 dAB和F(ab’)2片段以及从Fab表达库中产生的片段。可通过本领域中熟知的技术来产生 这些抗体片段。可用于本发明中的单克隆抗体包括但不限于人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、单 IjlFvs(scFv)、二硫键键合的 FvS(SdFv)、Fab 片段、F(ab')片段、F(ab' )2 片段、Fv 片段、 双抗体、通过Fab表达库产生的直链抗体片段、包括VL或VH结构域的片段、细胞内制备的 抗体(即，细胞内抗体)以及它们的抗原结合抗体片段。适用于本发明中的单克隆抗体可具有多种同种型。适用于本发明中的单克隆抗体 可为例如鼠的IgM, IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、IgA、IgD或IgE0适用于本发明中的单克隆 抗体可为例如人的IgM, IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE0在一些实施例中， 单克隆抗体可为鼠的IgG2a、IgGl或IgG3。利用本发明，可使给定的重链与具有k或λ形 式的轻链进行配对。适用于本发明中的单克隆抗体可通过动物(包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、 仓鼠、山羊、马、小鸡或火鸡)产生、化学合成或者进行重组表达。适用于本发明中的单克隆 抗体可通过本领域中已知的用于纯化免疫球蛋白分子的多种方法(例如，通过色谱法(如， 离子交换法、亲和力法以及施胶柱色谱法)、离心法、微分溶解度法)或通过用于纯化蛋白 的多种其他标准技术进行纯化。合适的抗体还包括高亲和力的抗金黄色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗体制 剂，其可检测浓度优选为至少1皮克/毫升(pg/mL)并且更优选高达100pg/mL的金黄色葡 萄球菌的重组凝聚因子(rClf40)蛋白。合适的抗体还包括高亲和力的抗金黄色葡萄球菌 凝聚因子蛋白的多克隆抗体制剂，据证明其检测灵敏度与金黄色葡萄球菌凝聚因子蛋白的 抗血清相比增加了至少4倍。在某些实施例中，高亲和力的抗金黄色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗体制剂 是可用的，其中所述高亲和力的抗金黄色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗体制剂是通过 下述方法制备的，所述方法包括从利用金黄色葡萄球菌的重组凝聚因子(rClf40)蛋白免 疫的动物中获取所述抗血清；使所述抗血清结合至金黄色葡萄球菌凝聚因子(Clf40)蛋白 的亲和柱；利用含有0. 5M盐并且pH为4的洗涤缓冲液来洗涤该柱；并利用pH为2的洗脱 缓冲液从该柱洗脱高亲和力的抗金黄色葡萄球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗体制剂。在本文 中，得自兔子和山羊的高亲和力的抗金黄色葡萄球菌凝聚因子的多克隆抗体制剂分别称为亲和纯化的RxClf40以及亲和纯化的GxClf40。在一些实施例中，高亲和力的抗金黄色葡萄 球菌凝聚因子蛋白的多克隆抗体制剂可通过下述方法获得，所述方法还包括在使抗血清结 合至金黄色葡萄球菌凝聚因子(Clf40)蛋白的亲和柱之前浓缩用于IgG类抗体的抗血清。 这种浓缩可从制剂中消除非免疫球蛋白并且/或者可浓缩样品内的IgG类抗体。如本文所用，抗血清是指得自经免疫的宿主动物的血液，其中凝血蛋白和红血细 胞(RBC)已被移除。靶抗原的抗血清可通过免疫多种宿主动物来获得。可使用多种免疫方 案。抗体亲和力是多克隆抗体制剂的功能性亲和力的一种度量。亲和力为多种抗体/ 抗原相互作用的复合亲和力。即，亲和力为抗原/抗体结合的表观亲和力，而不是真实的亲 和力。尽管大多数抗血清中的亲和力为异质性的，但是可通过定义平均亲和力(KO)来表征 这种总体亲和力。分析物结合材料固体载体材料固体载体材料可包括颗粒材料、隔膜、凝胶(如，琼脂糖)或其他的固体载体材料， 例如管或板的表面。示例性的固体载体材料可包括下述材料，例如硝化纤维、聚苯乙烯、聚 丙烯、尼龙、铁磁材料、金溶胶、聚碳酸酯、聚乙烯、纤维素、多糖、聚乙烯醇或它们的组合。对 于某些实施例，颗粒材料和隔膜是优选的。对于某些实施例，优选地是，分析物结合材料的固体载体材料包含官能化的颗粒 材料(如，平均粒度低于2微米并且优选在0. 05微米至1微米的范围内的磁珠)。例如，利 用诸如羧基、胺基和甲苯磺酰基之类的基团进行官能化的磁珠可从Invitrogen(Carlsbad， CA)和Ademtech(Pessac，France)商购获得。经链霉抗生物素涂覆的颗粒也可得自 诸 如 Invitrogen (Carlsbad, CA)、Ademtech(Pessac, France)禾口 Miltenyi Biotec GmbH(Bergisch Gladbach, Germany)之类的若干来源。分析物结合材料包括固体载体材料，优选为颗粒材料，且所述固体载体材料上设 置有一种或多种抗体。在某些实施例中，颗粒材料中的每个颗粒具有结合其上设置的不 同分析物的至少两种抗体。例如，在某些实施例中，分析物结合材料包括其上设置有抗体 MAb-76和GxClfa(优选地是，比率为1 1)的固体载体材料(优选为颗粒材料)。在某些实施例中，分析物结合材料包括含有至少两部分的颗粒材料，其中颗粒材 料的一部分具有对其上设置的一种分析物有特异性的一种抗体，并且第二部分具有对其上 设置的另一种分析物有特异性的不同抗体。颗粒材料的两部分可包含相同类型的颗粒。颗 粒材料可包含至少两种不同类型的颗粒或者相同类型的颗粒，且至少两种不同的抗体附着 到不同的颗粒上。抗体可通过共价附着或非共价附着而附着到载体材料优选颗粒载体材料上。抗体非共价附着到固体载体材料上包括通过例如离子相互作用或氢键进行附着。 包括在本发明中的非共价附着的一个实例为熟知的生物素-抗生物素蛋白系统。已发现基 于生物素_抗生物素蛋白亲和力的技术在许多生物和生物技术领域都具有广泛的应用性。 抗生物素蛋白和生物素之间的亲和力常数非常高(解离常数Kd为大约10_15M，参见Green 的Biochem. J.，89，599 (1963年))并且当生物素偶联到多种生物分子上时并未显著减小。 据发现，用于将生物分子偶联至生物素的许多化学方法对于生物分子的活性或其他所需特 性具有极少的或甚至忽略不计的损耗。生物素-抗生物素蛋白技术的综述可见于Bayer
15等人的“抗生物素蛋白-生物素技术在基于亲和力的分离中的应用(Applications of Avidin-Biotin Technology to Affinity-Based Separation)"(J. of Chromatography,第 3-11 页(1990 年))。链霉抗生物素及其功能性的同源抗生物素蛋白为具有四个相同的亚亚基的四聚 体蛋白。链霉抗生物素是由放线杆菌分泌的链霉亲生物素蛋白(Sti^ptomyces avidinii) 0 链霉抗生物素或抗生物素蛋白的单体包含一个高亲和力的结合位点，以用于使水溶性维生 素生物素和链霉抗生物素或抗生物素蛋白四聚体结合四个生物素分子。生物素，也被称为维生素H或顺-六氢-2-氧-IH-噻吩_[3_，4]-咪唑_4_戊酸， 是包括细菌和酵母在内的大多数有机体所必需的基础维生素。生物素的分子量为约244道 尔顿，这大大低于其结合配对物抗生物素蛋白和链霉抗生物素。生物素也为一起羧化多种 物质的丙酮酸羧化酶、转羧酶、乙酰辅酶A羧化酶和β-基巴豆酰辅酶A羧化酶的酶辅因 子。链霉抗生物素和抗生物素蛋白对于生物素具有极其紧密的以及高度特异性的结 合，这种结合为蛋白和配体之间已知的最强的非共价相互作用中的一种，其摩尔解离常数 为 1(Γ15 摩尔(M) (Green, Advances in Protein Chemistry，第 29 卷，第 85-133 页(1975 年))，且配体解离的 tl/2 为 89 天(Green, Advances in Protein Chemistry，第 29 卷，第 85-133页(1975年))。抗生物素蛋白-生物素的结合在血清以及在循环中是稳定的(Wei 等人，Experientia，第27卷，第366-368页，(1970年))。一旦形成后，抗生物素蛋白-生 物素复合体不会受到PH的最大极限、有机溶剂和变性条件的影响。使链霉抗生物素从生物 素分离需要诸如8M胍、pH为1.5或在121°C下高压灭菌10分钟(min)之类的条件。可通过多种已知的方法将抗体进行生物素化。例如，可使用诸如N-羟基琥珀酰亚 胺生物素(NHS-生物素)(可从Pierce Chemical公司(Rockford，IL)商购获得并且需要 在抗体上存在伯胺基)之类的活化生物素类似物将抗体进行化学生物素化。在本发明的一个优选方法中，磁性颗粒可被链霉抗生物素涂覆并且可与生物素化 的抗体接触。然后可使用这种颗粒进行细菌捕集。具有两种或多种抗体时，可进行同时或 顺序捕集。正如本领域的技术人员将会理解的那样，顺序捕集可涉及多种多样的试剂添加 顺序。在另一种方法中，可首先将生物素化的抗体与样品进行混合以捕集细菌，随后则 可将生物素化的抗体_细菌复合体非共价结合至经链霉抗生物素涂覆的微珠上。对于某些 实施例，可优化生物素与抗体的比率以避免某些颗粒的聚集。对于某些实施例，可优化生物素分子数与抗体数的比率以避免某些颗粒的聚集。 例如，对于Ademtech的200nm的经链霉抗生物素涂覆的颗粒，优选大约2 1的比率。已 显示较高的比率，尤其是大于7 1的比率，对这些颗粒具有聚集问题。用于将抗体共价附着至颗粒载体材料的代表性方法包括利用载体材料中通过活 化化合物(例如戊二醛、碳二亚胺、溴化氰)活化的官能团(例如羧基、胺、羟基、马来酰亚 胺、酰胼)与抗体中的另一种反应性基团(例如，羟基、氨基或巯基基团)进行反应。这种键 合可为例如二硫键、硫酯键、酰胺键、硫醚键等。抗体也可直接附着到利用下述基团(例如 甲苯磺酰基、氯甲基)官能化的载体材料上，所述基团可直接与抗体上的官能团(例如胺) 进行反应。
16
可通过本领域中已知的多种方法将抗体共价键合至颗粒载体材料上。例如，用羧 基衍生化的微珠为市售的。然后可通过在抗体上的伯胺与微珠表面上的羧基之间形成酰胺 键以将抗体偶联至这种微珠上。偶联反应是通过借助碳二亚胺的活化介导的。一般来讲，优化所关注体系的颗粒浓度以及抗体与颗粒的比率以实现迅速捕集。 一般来讲，这取决于颗粒。例如，对于Dynal的1-微米(μ m)颗粒，颗粒浓度优选大于0. 04 毫克/毫升(mg/mL)、更优选大于0. lmg/mL、并且甚至更优选大于0. 16mg/mL。对于相同的 颗粒，抗体与颗粒的比率优选大于1 μ g抗体/Img颗粒、更优选大于10 μ g/mg、并且甚至更 优选大于40yg/mg颗粒。在本发明的方法中的捕集步骤的另一个实施例中，当使用亚微米尺寸的颗粒 (如，捕集微珠)时，颗粒浓度优选大于0. 04mg/mL、更优选大于0. lmg/mL、并且甚至更优选 大于0. 16mg/mL。在本发明的方法中的捕集步骤的另一个实施例中，当使用亚微米尺寸的颗 粒时，抗体与颗粒的比率优选大于0. 01 μ g抗体/Img颗粒、更优选大于0. 1 μ g抗体/Img 颗粒、并且甚至更优选大于10 μ g抗体/Img颗粒，但通常不超过10 μ g抗体/Img颗粒。合适的颗粒可进行封闭或可不进行封闭以阻止非特异性结合。这种封闭可在抗体 附着之前或之后进行。例如，购买的某些磁性微珠(如，Dynal Tl MyOne链霉抗生物素微 珠)是利用牛血清白蛋白(BSA)封闭的。正如本领域所熟知的那样，可将其他合适的封闭 剂用于非特异性结合。另外，可使用封闭剂(如，多粘菌素)来阻止探测剂(如，多粘菌素) 在比色传感器中进行非特性结合。可通过沉淀、离心或过滤从样品中分离颗粒。优选地，使用磁性颗粒并且使用磁场 来分离它们。这种分离的颗粒(优选其上具有全细胞)可利用各种缓冲液进行洗涤，所述 缓冲液包括例如含有PLUR0NICL-64的PBS或含有或不含有BSA的TWEEN 20等。明显地，使用本发明的方法，优选捕集靶全细胞的至少20%，更优选捕集靶全细胞 的至少50%，并且甚至更优选捕集靶全细胞的至少80%。比饩传感器聚二乙炔组分适用于本发明的方法中的比色传感器包括聚合组合物，其包含受体和含二乙炔的 聚合物材料(聚二乙炔组分)，其中所述受体结合到所述聚合组合物上以形成转导物，该传 导物在与一种或多种探测剂和/或分析物结合时能够提供颜色变化。这种比色传感器可用 作分子识别事件的比色检测的基础。可用于比色传感器中的合适二乙炔化合物在溶液中进行自组合，从而形成有序组 分，所述组分可使用诸如(例如)电磁波谱的紫外光或可见光范围内的电磁辐射之类的光 化辐射进行聚合。二乙炔化合物的聚合化会产生聚合反应产物，该聚合反应产物在低于570 纳米(nm)、570nm和600nm之间或高于600nm的可见光谱内具有颜色，而这取决于它们的构 象以及所暴露的外部因素。一般来讲，本文所公开的二乙炔化合物的聚合化会产生包括聚 二乙炔主链的亚稳态蓝相聚合物网。这种亚稳态蓝相聚合物网在暴露于诸如热、溶剂或抗 衡离子的变化(如果可得到的话)或者(例如)物理应力之类的外部因素时会发生从淡蓝 色到红橙色的颜色变化。本文所公开的二乙炔化合物及其聚合产物在暴露于物理应力时能发生可见的颜 色变化，这种能力使得它们有资格进行制备用于检测分析物的感测设备。利用所公开的二 乙炔化合物形成的聚二乙炔组分可用作生物感测应用中的转导物。
对于给定的感测应用，二乙炔分子的结构要求通常具有应用特异性。诸如总链长、 溶解度、极性、结晶性以及存在用于其它分子改性的官能团之类的特征一起协同来确定二 乙炔分子可用作有用感测材料的能力。例如，就在水性介质中进行分析物的生物检测而言，二乙炔化合物的结构应能够 在水中形成稳定的分散体、有效地聚合以形成带色材料、结合合适的受体化学物以用于结 合至分析物以及通过颜色变化来转换结合作用。这些能力取决于二乙炔化合物的结构特 征。本发明的二乙炔化合物具有上述能力并且可容易地和有效地聚合成能发生所需 颜色变化的聚二乙炔组分。另外，二乙炔化合物允许结合大量多余的不可聚合材料，例如下 文所述的受体，而仍能形成稳定的、可聚合的溶液。本发明所公开的二乙炔化合物可以快速的高产率方式进行合成，包括高通量的合 成方法。在二乙炔化合物的主链中存在诸如例如杂原子之类的官能团提供了易于进行结构 建立的可能性，以便满足给定感测应用的需求。可通过以下方式将二乙炔化合物聚合成包 含所需聚二乙炔主链的网络，所述方式为将二乙炔添加到诸如例如水之类的合适溶剂中、 对该混合物进行超声处理、然后利用紫外光(通常在254nm的波长下)照射该溶液。聚合 时，该溶液发生淡蓝色到紫色的颜色变化。可用于本发明中的二乙炔通常包含平均长度为8且具有至少一个诸如羧基、伯 胺基和叔胺基、羧基甲酯等之类的官能团的碳链。合适的二乙炔包括描述于美国专利 No. 5，491，097 (Ribi 等人)；PCT 公开 No. WO 02/00920 ；美国专利 No. 6，306, 598 和 PCT 公开 WO 01/71317中的那些。在一个优选实施例中，聚二乙炔组分为具有化学式 的聚合化合物其中R1为 烷基、 R2 为 R3、R8、R13、R21、R24、R31 和 R33 独立地为烷基；R4、R5、R7、R14、R16、R19、R20、R22、R25 和 R32 独立地为亚烷基；R6、R15、R18和R26独立地为亚烷基、亚烯基或亚芳基；R9为亚烷基或-NR34-； R10> R12、R27和R29独立地为亚烷基或亚烷基-亚芳基；R11和R28独立地为炔基；R17为酯活化 基团；R23为亚芳基；R3tl为亚烷基或-NR36- ；R34和R36独立地为H或C1-C4烷基；ρ为1-5 ；并且 η为1-20 ；并且其中R1和R2并不相同。示例性的化合物还描述于美国专利No. 6，963，007 以及美国专利申请公开No. 04-0126897-Α1和04-0132217-Α1中。在一个优选实施例中，R1 为 其中R7为亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基 或九亚甲基，并且R6为亚乙基、三亚甲基、亚乙烯基或亚苯基；并且其中R2为
其中R2q为亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基 或九亚甲基，并且R21为十一烷基、十三烷基、十五烷基、十七烷基；并且其中P为1。本发明包括本文所述的化合物，包括异构体(例如结构异构体和几何异构体)、 盐、溶剂化物、同质异像体等。可按照方案1所概述的来制备由化学式XXIII表示的二乙炔，其中η通常为1至 4并且m通常为10至14。 方案1由化学式XXIII表示的化合物的制备方式可为使由化学式XXII表示的化合物在 诸如(例如)DMF之类的合适溶剂中与合适的氧化剂进行氧化反应。合适的氧化剂包括例 如琼斯(Jones)试剂和二铬酸吡啶鐺。通常上述反应在0°C至40°C、一般为0°C至25°C的 温度下进行1小时至48小时、一般为8小时的时间间期。由化学式XXII表示的化合物可通过由化学式XXI表示的化合物与合适的酰基氯 反应来制备合适的酰基氯包括能提供所需产物的酰基氯，例如(如)月桂酰氯、1-十二烷酰 基氯、1-十四烷酰基氯、1-十六烷酰基氯和1-十八烷酰基氯。合适的溶剂包括例如醚、四 氢呋喃、二氯甲烷和氯仿。在存在诸如三烷基胺或吡啶碱之类的碱的情况下，通常上述反应 在0°C至40°C、一般为0°C至25°C的温度下进行1小时至24小时、一般为3小时的时间间 期。由化学式XXI表示的化合物为市售的(如，其中η为1至4)并且可利用由化学式 XVIII表示的化合物通过化合物XIX和XX制得，制备方式如(例如)方案1中所概述的以及 Abrams 等人的 Org. Synth. (66，127—31 (1988 年))禾口 Brandsma 的 Pi^parative Acetylenic Chemistry (Elsevier Pub.公司，纽约，1971年)中所公开的。本文所公开的二乙炔化合物也可通过在存在诸如甲苯之类的合适溶剂的情况下， 使具有化学式XXII的化合物与诸如琥珀酸酐、戊二酸酐或邻苯二甲酸酐之类的酸酐进行 反应而制得。通常上述反应在50°c至125°C、一般为100°C至125°C的温度下进行1小时至 24小时、一般为15小时的时间间期。包括聚二乙炔组分的传感器可在其被转移至合适的载体上之前利用常规的 LB(Langmuir-Blodgett)方法来获得，而无须形成薄膜。作为另外一种选择，可按A Ulman的 An Introduction to Ultrathin Organic Films (Academic Press,纽约，第 101-219 页 (1991年))中所述利用已知的LB方法在基底上形成聚二乙炔组分。比饩传感器警体比色传感器包括由结合在溶液中的聚二乙炔组分内的受体形成的转导物。可通过 在聚合之前或之后将受体添加到二乙炔单体中来制备传感器。受体能够通过多种方式使聚 二乙炔组分官能化，所述方式包括物理混合、共价结合以及非共价相互作用(例如静电相 互作用、极性相互作用等)。聚合时或者聚合之后，受体与聚合物网有效结合，使得受体与分析物或探测剂的 相互作用由于干扰连接的烯_炔聚合物主链而导致可见的颜色变化。受体与聚二乙炔组分的结合提供了结构形状，所述结构形状能够响应与一种或多 种探测剂和/或分析物的相互作用或结合而变形。尤其可用的受体为通常具有杆状分子 结构的两亲性分子组分，其特征可为定义如下的排列参数v/(a(ll。)(Israelachvili等人， Q. Rev. Biophys.，13，121 (1980年))，其中ν为分子中的烃成分(例如，磷脂或脂肪酸的烃 链)占据的体积，％为极性首基(例如，磷脂的磷酸首基或脂肪酸的羧酸首基)占据的有效 面积，并且1。为所谓的临界长度，并且通常描述分子在其环境温度下的长度。用于受体的 优选两亲性分子为排列参数ν/(%1。)值在1/3和1之间的那些分子。可用受体的实例包括但不限于类脂、表面膜蛋白、酶、凝集素、抗体、重组蛋白等； 合成蛋白；核酸；C甙；碳水化合物；神经节苷脂；以及螯合剂。在大多数实施例中，受体为 磷脂。合适的磷脂包括磷酸胆碱(如，1，2-二肉豆蔻酰-Sn-甘油-3-磷酸胆碱)；磷酸 乙醇胺；和磷脂酰乙醇胺；磷脂酰丝氨酸；以及磷脂酰甘油类，例如描述于Silver的The Physical Chemistry of Membranes (第 1 章，第 1-24 页(1985 年))中的那些。在一个实施例中，将受体在聚二乙炔中进行物理混合并且分散以形成结构体，其 中所述结构体本身对所关注的探测剂和/或分析物具有结合亲和力。结构体包括但不限于 脂质体、胶束和菌褶。在一个优选实施例中，结构体为脂质体。尽管不希望受到理论的约 束，但据信当聚二乙炔组分允许将脂质体发生的物理化学变化转化成可见的颜色变化时磷 脂等效于细胞膜。制备的脂质体具有良好限定的形状、尺寸分布以及其他物理特性，例如良 好限定的表面电势。脂质体中受体相与二乙炔化合物的比率可根据所选择的材料以及所需的色度 反应改变。在大多数实施例中，磷脂与二乙炔化合物的比率将为至少25 75，并且更 优选至少40 60。在一个优选实施例中，脂质体是由二乙炔化合物H0(0)C(CH2)2C(O) O(CH2)4C = C-C = C (CH2)4O (O)C (CH2)12CH3 [琥珀酸单-(12-十四酰氧基-十二-5，7-二炔 基)酯]以及两性离子磷脂1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱[DMPC]以6 4的 混合比率组成的。可通过将悬浮于缓冲溶液(称为制备缓冲液)中的材料混合物进行探头超声处理 来制备脂质体。例如，制备缓冲液可为低离子强度(5mM)的N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙磺 酸[HEPES]缓冲液(pH = 7. 2)。另一种可用的制备缓冲液为低离子强度(2mM)的三羟甲基 氨基乙烷[TRIS]缓冲液(pH = 8. 5)。比饩传感器探测剂可利用一种或多种探测剂与包含受体(例如磷脂)和聚二乙炔的脂质体的相互作用方式来优选地设计本发明的比色传感器。脂质体可被认作生物膜模型并且它们与探测剂 (例如，蛋白)的相互作用可描述于Oellerich等人的J. Phys. Chem B (108，3871-3878 (2004 年))；和 Zuckermann 等人的 Biophysi. J. (81，2458-2472 (2001))中。利用类脂(分配于脂质体相中)与蛋白的浓度比来描述蛋白与脂质体的相互作用 是方便的。在类脂与蛋白具有高浓度比的情况下，蛋白将主要通过静电相互作用吸附至脂 质体表面。随着蛋白浓度的增加以及类脂与蛋白的浓度比的降低，蛋白继续静电吸附至脂 质体表面，直至它们完全饱和或包封脂质体。随着该过程的继续进行，脂质体和蛋白均可发 生形态和构象变化，直至覆盖脂质体表面的蛋白的疏水性链段可与脂质体结构的疏水性内 部开始相互作用。此时，蛋白可变成疏水性结合并且穿透脂质体结构，从而导致脂质体结构 内的显著形态变化，且脂质体的尺寸和渗透性发生极大的变化。最后，吸附蛋白层可通过脂 质体的絮凝而导致其悬浮稳定性的丧失并且最终导致类脂相的沉淀。这些静电相互作用的存在不仅高度依赖于存在的蛋白和类脂的类型，而且也依赖 于它们的环境。尽管不希望受到理论的约束，但据信给定缓冲组合物的离子强度将有助于 建立脂质体以及带电蛋白的表面电势，并且因此有助于它们进行显著的静电相互作用的能 力。例如，在pH为中性的低离子强度(2_5mM)的缓冲组合物(如，HEPES、TRIS)中，带 电探测剂可静电吸附至聚二乙炔脂质体。尽管初始吸附本身可能不触发脂质体的尺寸和 形态的显著变化，并因而可能不触发初始较小的或忽略不计的色度反应，但如果存在的探 测剂相对类脂是过量的，那么探测剂将可能最终疏水性结合至脂质体并且穿透其内部膜结 构。此时，可以预期，通过探测剂结合到脂质体结构内部所赋予的大量机械应力将显著改变 聚二乙炔的构象，从而导致极易观察到的伴随色度反应。作为另外一种选择，如果探测剂在中性pH下带负电，那么其与聚二乙炔脂质体进 行静电相互作用的能力会受到严重妨碍，并且由探测剂和包含受体的聚二乙炔脂质体之间 的疏水性相互作用产生色度反应的能力可能受损。在这种情况下，使用PH为中性的高离子 强度缓冲液(大于100毫摩尔(mM))(如，磷酸盐缓冲液PBS、咪唑缓冲液)将提供一种方法 以降低脂质体的表面电势(通过屏蔽脂质体的表面电荷)、促使非带电探测剂与脂质体进 行直接的疏水性相互作用并且从而导致蛋白结合到脂质体结构内部。因此在这种情况下， 此缓冲组合物有助于产生显著的色度反应，而这在其他情况下将不会发生。尽管较高离子 强度的缓冲组合物可由于其对脂质体的表面电势的影响而使得在不存在探测剂的情况下 引入明显的色度反应，但我们测得，当存在探测剂时，由于蛋白-脂质体的疏水性相互作用 而使色度反应得到显著增强。此结果具有非常有用的实践价值给定检测极限的检测时间 可显著缩短，反之，对于固定的分析时间，检测极限可显著降低。基于此现象，可根据下述能力来选择探测剂，所述能力为其与给定的分析物靶以 及聚二乙炔脂质体进行特异性相互作用从而触发色度反应的能力。含聚二乙炔的脂质体的 色度反应与探测剂或探测剂_分析物复合体的浓度成正比。对于特定应用，探测剂的选择将部分地取决于探测剂的尺寸、形状、电荷、疏水性 以及对分子的亲和力。探测剂可依据环境的PH而为带正电的、带负电的或两性离子的。在 低于探测剂的等电点的PH下，探测剂为带正电的，并且高于此点时，其为带负电的。如本文 所用，术语“等电点”是指探测剂的静电荷为零的PH。
为了利用聚二乙炔/磷脂体系设计生化分析法，已知受体(或探测剂)的等电点 将影响缓冲液组合的选择。具有较低等电点的探测剂可需要较高离子强度的缓冲液，以便 获得脂质体的形态变化。较高等电点的蛋白可用于低离子强度的缓冲液例如HEPES缓冲液 中以产生颜色变化。探测剂可为对靶分析物和受体均具有亲和力的分子。可用于本发明中的可能 探测剂包括膜分裂肽，例如阿拉霉素、马加宁、短杆菌肽、硫酸多粘菌素B和蜂毒肽；纤 维蛋白原；链霉抗生物素；抗体；凝集素；以及它们的组合。参见如美国专利申请公开 No. 2004/132217。诸如硫酸多粘菌素B之类的多粘菌素尤其可用于检测革兰氏阳性菌。抗体以及抗体片段也可用作探测剂。其包括能够与某种蛋白进行选择性反应的抗 体分子的蛋白分解或重组制备部分的片段。这种蛋白分解和/或重组片段的非限制性实 例包括F(ab’)、F(ab)2、Fv以及包含通过肽连接物连接的VL和/或VH结构域的单链抗体 (scFv)。scFv可进行共价或非共价地连接以形成具有两个或多个结合位点的抗体。scFv 可进行共价或非共价地连接以形成具有两个或多个结合位点的抗体。可利用本领域技术人 员已知的多种可检测部分来标记抗体。在一些方面，结合到希望进行测量的分析物上的抗 体(一抗)不进行标记，但作为替代，其可通过特异性结合至一抗的经标记二抗或其他试剂 来进行间接地检测。各种金黄色葡萄球菌抗体是本领域已知的，如以上在分析物结合材料的上下文中 所述。检测分析缓冲组合物检测分析法通常还包括用于调节分析物和转导物之间的相互作用的缓冲组合物。 缓冲组合物提供了能够在存在其他组分(包括共轭酸碱对，其中质子接受体相对质子给予 体的比率接近1)的情况下抵抗PH变化的体系。另外，本发明的缓冲组合物调节分析物与 比色传感器的组分之间的物理或化学相互作用。例如，正确选择缓冲组合物可有利于蛋白 探测剂与二乙炔脂质体之间的相互作用，同时抑制可存在于样品中的其他可能的干扰蛋白 的相互作用。可尤其适用的缓冲组合物包括HEPES缓冲液、咪唑缓冲液和PBS缓冲液。例如，在仅包含pH为7. 2的HEPES缓冲液的体系中，硫酸多粘菌素B (等电点为 7. 7)具有正电荷并且易于附着到磷脂的带负电极性首基上，并且可在比色传感器中引起从 蓝到红的颜色变化。参见如美国专利申请公开No. 2006/134796。此外，伤口渗出液中的富 集蛋白人血清白蛋白的等电点通常在4. 5至5. 5的范围内，其在相同的HEPES缓冲组合物 中具有负电荷，从而使得与磷脂的带负电极性首基的吸附或静电相互作用降到最小并且降 低了干扰该分析的可能性。作为另外一种选择，在存在较高离子强度的缓冲液(例如咪唑或PBS)的情况下， 所述离子强度将脂质体(或其他的转导物结构)的形态改变成暴露出疏水性部分，从而允 许与蛋白的疏水性部分进行直接作用以引起颜色变化。最后，可按照类似的方式将表面活性剂组分引入到缓冲组合物中，所述缓冲组合 物可有助于探测剂与比色传感器的疏水性相互作用。可尤其适用于本发明的表面活性剂包 括非离子表面活性剂。多烷氧基化的非离子表面活性剂，并且具体地讲，多乙氧基化的非离 子表面活性剂可相当好地稳定溶液中的本发明组分。可使用的非离子型表面活性剂包括
1.聚氧化乙烯伸展的山梨糖醇单烷基酯(即，聚山梨酸酯)。具体地讲，以NIKKOL TL-10(得自Barret Products)商购获得的聚山梨酸酯20是非常有效的。2.多烷氧基化的链烯醇。HLB为至少约14的表面活性剂，例如以商品名BRIJ从 ICI Specialty Chemicals (Wilmington，DE)商购获得的那些，已证明是适用的。具体地 讲，BRIJ 78和BRIJ 700，分别为具有20和100摩尔聚氧化乙烯的硬脂醇乙氧基化物，已证 明是非常适用的。以商品名 PLURAFAC A-39 从 BASF Corp. ,Performance Chemicals Div. (Mt. Olive, NJ)商购获得的鲸蜡硬脂基聚氧乙烯醚55也是可用的。3.多烷氧基化的烷基酚。此类型的表面活性剂包括HLB值为至少约14的多乙氧 基化的辛基或壬基酚，其可分别以商品名IC0N0L和TRITON从BASF Corp.，Performance Chemicals Div. (Mt. Olive, NJ)和 Union Carbide 公司(Danbury，CT)商购获得。实例包 括TRITON XlOO (具有15摩尔得自Union Carbide公司(Danbury，CT)的氧化乙烯的辛 基酚)以及IC0N0L NP70和NP40 (分别具有40和70摩尔得自BASF Corp.，Performance Chemicals Div. (Mt. Olive, NJ)的氧化乙烯单元的壬基酚)。这些表面活性剂的硫酸化和 磷酸化衍生物也是可用的。这些衍生物的实例包括壬基苯酚聚醚-4-硫酸铵，其可以商品 名 RH0DAPEX C0-436 从 Rhodia(Dayton，NJ)商购获得。4.泊洛沙姆。据显示，基于氧化乙烯(EO)和氧化丙烯(PO)的嵌段共聚物的表 面活性剂可有效用于稳定本发明的成膜聚合物并且提供良好的润湿性。Ε0-Ρ0-Ε0嵌段和 Ρ0-Ε0-Ρ0嵌段预期为奏效的，前提条件是HLB为至少约14，优选为至少约16。这种表面活 性剂可以商品名 PLUR0NIC 和 TETR0NIC 从 BASF Corp. , Performance Chemicals Div. (Mt. Olive, NJ)商购获得。应当指出，得自BASF的PLUR0NIC表面活性剂所报告的HLB值的计 算方法不同于上述方法。在这种情况下，应当使用由BASF报告的HLB值。例如，优选的 PLUR0NIC表面活性剂为L-64和F-127，其分别具有15和22的HLB。尽管PLUR0NIC表面活 性剂对于稳定本发明的组合物是非常有效的并且利用碘作为活性剂是非常有效的，但它们 使用聚维酮碘作为活性剂时可降低组合物的抗微生物活性。5.多烷氧基化的酯。多烷氧基化的二醇，例如乙二醇、丙二醇、甘油等，可进行部分 地或完全地酯化，即，可利用(C8-C22)烷基羧酸酯化一种或多种醇。这种HLB为至少约14 并且优选至少约16的多乙氧基化的酯适用于本发明的组合物中。6.烷基多聚葡萄糖苷。烷基多聚葡萄糖苷，例如美国专利No.5，951，993(SCholZ 等人)中从第9列、第44行开始描述的那些，与本发明的成膜聚合物是相容的并且可有助 于聚合物的稳定性。实例包括葡萄糖苷425，其具有(C8-C16)的烷基链长度，且具有10. 3 碳原子的平均链长度以及1-4个葡萄糖单元。样品和分析物所关注的细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。特别相关的生物体包括肠杆菌 禾斗(Enterobacteriaceae)或微球菌禾斗(Micrococcaceae)或葡萄球菌属(Staphylococcus spp)·、链球菌属(Streptococcus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、肠球菌属 (Enterococcus spp.)、沙门菌属(Salmonella spp.)、军团菌属(Legionellaspp.)、志贺 菌属(Shigella spp·)、耳口尔森菌属(Yersinia spp·)、肠杆菌属(Enterobacter spp·)、 ±矣希氏菌属(Escherichia spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、李其jf特菌属(Listeria spp·)、弧菌属(Vibrio spp·)、棒状菌属(Corynebacteria spp.)以及疱疹病毒、曲霉菌
24属(Aspergillus spp·)、键刀菌属(Fusarium spp.)禾口念珠菌属(Candida spp.)的成 员。特别有毒性的生物体包括金黄色葡萄球菌(包括诸如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)之类的抗性株)、表皮葡萄球菌、肺炎链球菌(Str印tococcus pneumoniae)、无乳链 球菌(S. agalactiae)、化脓性链球菌(S. pyogenes)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis) > 抗万古霉素肠球菌(VRE)、抗万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)、抗万古霉素中间体-金黄 色葡萄球菌(VISA)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、黑曲霉菌(Aspergillus niger)、烟曲霉 群(A. fumigatus)、棒曲霉菌(A. clavatus)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani)、尖孢镰刀菌 (F. oxysporum)、厚孢镰刀菌(F. chlamydosporum)、单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绵羊李其jf 特杆菌(Listeria ivanovii)、霍舌匕弧菌(Vibrio cholera)、 」 溶血性弧菌(V. parahemolyticus)、猪霍乱沙门菌(Salmonella cholerasuis)、伤寒沙门菌 (S. typhi)、鼠伤寒沙门菌(S. typhimurium)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌 (C. glabrata)、克鲁斯念珠菌(C. krusei)、坂崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、结肠杆 菌(E. coli)0157以及多种抗药性革兰氏阴性杆菌(MDR)。受到特别关注的是革兰氏阳性菌，例如金黄色葡萄球菌。一般来讲，这种细菌的检 测方式可为检测具有该细菌特性的细胞壁组分例如细胞壁蛋白的存在。另外，受到特别关 注的是耐抗生素的微生物，包括MRSA、VRSA、VISA、VRE和MDR。一般来讲，这种细菌的检测 方式可为检测产生抗生素耐药性的内部细胞成分(例如，膜蛋白、运输蛋白、酶等)的存在。所关注菌种可在试验样品中进行分析，所述试验样品可得自多种源，例如生理液 体如，血液、唾液、眼晶体液体、滑液、脑脊髓液、脓液、汗液、渗出液、尿液、粘液；粘膜组织 如，口腔、口腔、鼻腔、眼、气管、支气管、胃肠、直肠、尿道、输尿管、阴道、宫颈以及子宫粘膜； 泌乳等。此外，试验样品可得自身体部位，如，伤口、皮肤、鼻孔、鼻咽腔、鼻腔、鼻前庭、指甲、 外耳、中耳、口、直肠、阴道或其他相似的部位。除了生理液体之外，其他的试验样品可包括 其他的液体以及溶于液体介质中的固体。所关注样品可包括加工料流、水、污垢、植物或其 他草木、空气、(如，污染的)表面等。本领域描述了用于检测细菌例如金黄色葡萄球菌的各种患者采样技术。这些采样 技术同样适用于本发明的方法。例如，通常利用擦拭患者的鼻孔来获得样品，如，通过无菌 拭子或采样设备擦洗患者的鼻前孔。例如，使用一个拭子来对每个对象采样，即，一个拭子 用于两个鼻孔。可通过(例如)以下方式进行采样将干燥的或者利用合适的溶液预润湿 的拭子插入到受试者鼻孔的前端并且将该拭子沿鼻孔的粘膜表面旋转两个完整周期。多种拭子以及其他的样品采集设备可例如以商品名PURE-WRAPSAWPuritan Medical Products Co. LLC (Guilford,ME)或者以商品名微流变尼龙絮凝拭子和ESwab采集 和传输系统从Copan Diagnostics公司(Murrietta，CA)商购获得。若需要的话也可使用 例如美国专利No. 5，879，635 (Nason)中公开的那些样品采集装置。拭子可具有多种材料， 包括棉布、人造丝、海藻酸钙、涤纶、聚酯、尼龙、聚氨酯等。在某些实施例中，通常利用缓冲溶液(例如(如)水、生理盐水、pH缓冲溶液或 任何其他的溶液或者将分析物或样品从样品采集设备中洗脱出来的溶液的组合)将样品 材料从样品采集设备中洗脱(或者“释放”或“洗涤”)出来。洗脱缓冲液的实例包括例 如磷酸盐缓冲溶液(PBS)，其可与例如TWEEN 20(聚氧乙烯山梨糖醇一月桂酸酯，可得自Sigma-Aldrich公司)或PLURONIC L64(聚(氧乙烯-共-氧丙烯)嵌段共聚物，可得自 BASF公司)组合使用。其他的萃取溶液用于在从样品采集位置到样品分析位置的运送期间 保持样本的稳定性。这种类型的萃取溶液的实例包括艾米斯和斯图尔特运送培养基。可使试验样品(如，液体)经受前处理，例如粘性流体的稀释。在将试验样品(如， 液体)注入到样品口之前，可使其经受其他的处理方法，例如浓缩、过滤、蒸馏、透析、稀释、 天然成分的灭活、加入试剂、化学处理等。S卩，可利用本领域的技术人员熟知的各种方法来制备试验样品。例如，可裂解样品 以使具有所关注特定细菌的特性的分析物可利用物理方法(如，超声处理、压力、煮沸或其 他的加热方法、利用玻璃珠涡旋等)进行分析。作为另外一种选择，可裂解样品以使具有所 关注的特定微生物的特性的分析物可利用各种化学试剂(可包含一种或多种成分)进行分 析。本发明的方法可用于分析单独分子的样品(如，诸如蛋白A之类的分子以及用于 分析金黄色葡萄球菌的凝聚因子)或同一分子(如，蛋白)的两个不同表位。这种分析物 包括例如诸如蛋白A之类的细胞壁蛋白以及识别黏附间质分子(MSCRAMM)的微生物表面组 分，例如纤维蛋白原结合蛋白(如，凝聚因子)、纤粘蛋白结合蛋白、胶原结合蛋白、肝素相 关的多糖结合蛋白等。蛋白A和凝聚因子(例如纤维蛋白原结合因子以及凝聚因子A、B和 Efb)也尤其可用于检测金黄色葡萄球菌存在与否的方法中。其他所关注的细胞壁组分包括 荚膜多糖和细胞壁碳水化合物(如，磷壁酸和脂磷壁酸)。如果需要，本发明的方法还可包括分析以内部细胞组分作为所关注分析物的样 品，所述内部细胞组分与细胞膜可相关或可不相关。内部细胞组分尤其可用于分析耐抗生 素的微生物，例如MRSA、VRSA、VISA、VRE和MDR。可具有这种微生物的特性的内部细胞组分 包括膜蛋白。这种膜蛋白的实例包括胞质膜蛋白、外膜蛋白和细胞膜蛋白。诸如青霉素结 合蛋白(PBP)(如，PBP2’或PBP2a)之类的胞质膜蛋白尤其可具有耐抗生素的微生物的特 性。例如，胞质膜蛋白PBP2，具有MRSA的特性。因此，尽管优选使用本发明的方法对全细胞进行分析，但在某些实施例中，本发明 的方法包括裂解试验样品中的细胞。在本发明的方法中，裂解可包括使细胞与裂解剂接触 或物理裂解细胞。可在常规条件下进行裂解，例如(如)在5°C至42°C (可能高达50°C) 的温度下，优选在15°C至25°C的温度下。裂解可发生在物理裂解细胞时。物理裂解可发生于如下情况中利用玻璃珠涡旋 试验样品、超声处理、压力、加热和煮沸或者使试验样品经受高压，例如(如)发生于使用弗 细胞压碎器(French press)时。也可使用裂解剂进行裂解。合适的裂解剂包括例如酶(如，蛋白酶、糖苷酶、核酸 酶)。示例性的酶包括溶葡萄球菌酶、胃蛋白酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶、溶菌酶、无色肽酶、 内肽酶、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰氨酶、内-β -N-乙酰氨基葡糖苷酶、ALE-I、脱氧核糖 核酸酶和核糖核酸酶。如果需要，可采用酶的各种组合。溶葡萄球菌酶尤其可用于检测金 黄色葡萄球菌存在与否的方法中。其他的裂解剂包括盐(如，离液盐)、增溶剂(如，洗涤剂)、还原剂(如，巯基 乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫丁四醇(DTE)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP ；Pierce Chemical公司(Rockford, IL))、半胱氨酸、η-乙酰半胱氨酸)、酸(如，HCl)以及碱(如，解剂可更适用于某些生物体，例如，相对于革兰氏阳性菌 而言，它们更适用于革兰氏阴性菌。如果需要，可采用这些裂解剂的各种组合。裂解方法还论述于美国专利申请公开No. 2005/0153370中。具体地讲，这种裂解 方法涉及检测具有所关注细菌的特性的细胞壁的一种或多种组分，以及也具有所关注菌种 (如，耐抗生素的关注微生物)的特性的任选的一种或多种内部细胞组分。据信，进行分析 的细胞壁片段为细胞壁的固体片。即，据信它们在裂解时没有溶解；相反，细胞壁仅碎裂成 片。此外，进行分析的细胞壁组分仍为细胞壁片段的部分(即，在其内或其上)。即，它们在 裂解时没有溶解。明显地是，相对于未经裂解的细胞内的相同组分而言，这增强了细胞壁组 分的信号。一个实例为如果存在金黄色葡萄球菌，那么试验样品中的裂解细胞可进行进行蛋 白A分析(蛋白A是金黄色葡萄球菌的特性)并且可利用固定在生物传感器表面上的蛋白 A的特异性抗体进行检测。另外，裂解细胞(例如金黄色葡萄球菌)从细胞的内部(相对于 细胞的细胞壁部分)释放蛋白标志物。这些蛋白标志物可被探测剂(例如，抗体)检测到。另外，如果需要且样品为含粘液样品，则其可在裂解之前或之后利用可包含溶粘 蛋白剂的至少一种试剂进行进一步地处理。利用溶粘蛋白剂处理含粘液样品可减少在分析 期间由于粘液的存在所产生的干扰。溶粘蛋白剂的实例包括酶(如，胃蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、葡糖苷 酶、半乳糖苷酶、糖苷酶)、盐(如，离液盐)、增溶剂(如，表面活性剂、洗涤剂)、还原剂(如， β-巯基乙醇(BME)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫丁四醇(DTE)、半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦盐 酸盐(TCEP ；Pierce Chemical 公司(Rockford，IL))η-乙酰半胱氨酸)以及酸(如，HCl)。 如果需要，可采用这些溶粘蛋白剂的各种组合。本领域的技术人员将会理解，裂解剂和溶粘 蛋白剂之间可存在重叠；但例如并非所有的裂解剂都为溶粘蛋白剂。在某些实施例中，如果样品为含粘液样品并且溶粘蛋白剂为还原剂，那么该还原 剂可被酸化(如，具有低于3的ρΗ值)。可利用诸如无机酸(如，HCl)或有机酸(如，乳 酸、柠檬酸)之类的多种酸来酸化还原剂。作为另外一种选择，如果以足够高的浓度使用， 那么还原剂的PH不必利用酸进行调整。此外，作为另外一种选择，可将酸(如，HCl)单独 用作溶粘蛋白剂。在某些实施例中，将粘膜样品和酶裂解剂孵育足够的时间，以便允许细胞裂解以 及细胞的至少一些抗原组分释放；随后，将样品和酶裂解剂与不同于酶裂解剂的溶粘蛋白 剂混合。一般来讲，但可任选地，加入还原剂之后，样品的制备涉及灭活组合物中的还原 剂。术语“失活”、“灭活”或“钝化”是指抑制试剂的活性或者抑制反应，这可(例如)通过 多种机制来进行，包括例如封闭、稀释、抑制、变性、竞争等。例如，可通过提供竞争性底物(例如，用于η-乙酰半胱氨酸的牛血清白蛋白)来 完成灭活。用于灭活还原剂的其他试剂实例包括含有中和缓冲液的稀释剂。中和缓冲液的 代表性成分可包括例如缓冲剂(如，磷酸盐)、盐(如，NaCl)、蛋白稳定剂(如，BSA、酪蛋白、 血清)聚合物、糖和/或洗涤剂或表面活性剂(如，通过商品名和常见供应源列出的下述试 剂中的一种或多种ΝΙΝΑΤΕ 411(烷基苯磺酸盐胺，可得自St印an公司(Northf ield，IL))、
27ZONYL FSN 100 (具有聚乙二醇的调聚物B单醚，可得自Ε. I. DuPont de Nemours公司)、 Aerosol OT 100 % (二辛基磺基琥珀酸钠，可得自 American Cyanamide 公司)、GER0P0N T-77 (N-油酰基-N-甲基牛磺酸钠，可得自Rhodia Novacare)、BIO-TERGE AS-40 (烯烃 (C14-C16)磺酸钠，可得自St印an公司)、STANDAPOL ES-I (聚氧乙烯(1)月桂基硫酸钠，可 得自Cognis公司(Ambler, PA))、TETR0NIC 1307 (乙二胺烷氧基嵌段共聚物，可得自BASF 公司)、SURFYN0L 465、485 和 104 PG-50 (均得自 Air Products and Chemicals 公司)、 IGEPAL CA210(辛基酚乙氧化物，可得自St印an公司)、TRIT0N X-45、X_100和X-305 (辛基 苯氧基聚乙氧基乙醇，均得自The Dow Chemical公司)、SILffET L-7600 (聚二甲基硅氧烷 甲基乙氧化物，可得自 Momentive Performance Materials 公司(Wilton，CT))、RH0DASURF 0N-870(多乙氧基化的(2)油醇，可得自Rhodia Novacare)、CREM0PH0R EL(多乙氧基化的 蓖麻油，可得自BASF公司)、TWEEN 20和TWEEN 80 (聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯和一 油酸酯，二者均可得自Sigma-Aldrich公司)、BRIJ 35 (聚氧乙烯(23)十二烷基醚，可得自 Sigma-Aldrich 公司)、CHEMAL LA_9(聚氧乙烯(9)月桂醇，可得自 PCC Chemax (Piedmont, SC))、PLUR0NIC L64(聚(氧乙烯-共-氧丙烯)嵌段共聚物，可得自BASF公司)、 SURFACTANT10G(对壬基苯氧基聚(缩水甘油)，可得自Arch Chemicals公司(Norwalk， CT))、SPAN 60 (脱水山梨醇单硬脂酸酯，可得自Sigma-Aldrich公司)、CREM0PH0R EL (多 乙氧基化的蓖麻油，可得自Sigma-Aldrich公司))。如果需要，还可使用中和缓冲液来调整 样品的PH值。除了还原剂或作为还原剂的替代形式，含粘液样品的样品制剂包括使用一种或多 种表面活性剂或洗涤剂(如，将样品和酶裂解剂与溶粘蛋白剂混合之后或与其同时进行)。 合适的表面活性剂可为非离子的、阴离子的、阳离子的或两性离子的。合适的实例包括十二 烷硫酸钠(SDS)和月桂基硫酸钠(SLS)。如果需要，可采用表面活性剂的各种组合。可任选地是，样品制备方法可包括随后灭活表面活性剂。这可(例如)通过提供 竞争性底物来完成。灭活表面活性剂的其他实例包括使用试剂中和缓冲液，例如足以将溶 粘蛋白试验样品和表面活性剂的PH调整到至少为5的缓冲液。优选地是，该缓冲液足以将 PH调整至不大于8。此外，如果样品制备试剂中的一种或多种是酸性的，那么优选将包含所关注分析 物的后续组合物中和到7至7. 5或接近7. 2的pH。这可例如通过提供缓冲液和/或稀释液
来完成。受到特别关注的其他样品类型包括伤口渗出液、尿液以及培养血液。通常可利用 拭子或设计类似的样品采集设备与已用盐水洗液清洗过的伤口接触来采集伤口渗出液样 品。可将拭子样品在萃取溶液中进行洗脱。这种萃取(即，洗脱)溶液通常包含水并且可 任选地包含缓冲液和至少一种表面活性剂。洗脱缓冲液的实例包括例如含有TWEEN20或含 有PLUR0NIC L-64的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。其他的萃取溶液用于在从样品采集位置到样 品分析位置的运送期间保持样本的稳定性。这些类型的萃取溶液的实例包括艾米斯和斯图 尔特运送培养基。可将洗脱的渗出液试验样品在测试之前进行过滤，以便移除尺寸大于Iym的细 胞和其他非细菌组分(即，红细胞和白细胞、皮肤细胞、宏观碎片)。此时样品可迅速用于进 行本文所述的分析。制备洗脱的伤口渗出液试验样品的其他方法包括在将细菌保持于悬浮
28液中的同时加入絮凝剂以促进干扰蛋白沉淀。另一种样品处理的可能方法包括使用差别裂 解剂，其将会在不影响细菌细胞的情况下裂解真核细胞。利用这种试剂进行裂解可允许利 用孔尺寸小于1 μ m的膜进行过滤，以便在冲洗裂解组分废物的同时捕集和分离细菌细胞。 然后可利用洗脱缓冲液将在过滤器上捕集的细菌细胞从该过滤器上洗脱掉，所述洗脱缓冲 液与用于从拭子处洗脱原始样品的缓冲液相类似。也可使用物理方法来制备伤口渗出液样品。例如，可使用离心法以在将靶细菌保 持于悬浮液中的同时分离尺寸大于微生物的干扰样品组分。这些样品处理方法是本领域的 技术人员已知的。尿液样品可利用略有不同的方式进行处理。首先，可利用液体处理系统而非拭子 来采集样品、由此将不必需要对拭子样品所述的洗脱。然而，后续的样品处理包括过滤、絮 凝、差别裂解以及离心，正如上文可用于从所关注细菌大致分离干扰样品组分的部分所述。培养血液样品的处理方式可与尿液样品相类似。例如，离心法为将红血细胞和白 血细胞从血浆中分离出来的通用方法，所述血浆在细菌内容物的检测中为所关注组分。检测方法根据本发明的用于分析一种或多种分析物的方法包括直接方法和间接方法。优选 的方法涉及间接检测。在一个实施例中，上述比色传感器的使用提供了直接的吸附测量或者允许利用肉 眼进行视觉观察以检测比色传感器中的颜色变化。在一些情况下，探测剂可与分析物形成 复合体，所述分析物能够和传感器直接相互作用，从而允许进行直接分析，其中色度反应与 分析物的浓度成正比。在一个可供选择的实施例中，本发明提供了通过选择探测剂来进行间接检测分析 物的方法，所述探测剂具有与分析物以及结合到聚二乙炔组分中的受体均可结合的亲和 力。选定的探测剂将证明与分析物的竞争亲和力。当存在所关注分析物时，探测剂将结合 到分析物上而不是聚二乙炔主链的受体上，从而产生与分析物浓度成反比的颜色变化。如 果不存在分析物，探测剂将结合到受体上，而所述受体结合在聚二乙炔主链上。探测剂可在 分析物接触传感器之后与传感器接触，或者可与分析物进行混合，而这在该混合物与传感 器接触之前进行。在间接检测分析法的一个实施例中，使探测剂和靶分析物在缓冲溶液中相互作 用，随后设置该缓冲溶液与传感器接触。缓冲液中游离探测剂的浓度取决于存在的分析物 靶的量分析物浓度越高，探测剂的剩余浓度就越低。由于传感器的色度反应与游离探测剂 的可用量成正比，因此所述色度反应与分析物浓度成反比。在间接分析法的一个尤其优选的实施例中，传感器组件包括聚二乙炔脂质体，所 述聚二乙炔脂质体被构造用于与硫酸多粘菌素B探测剂或其他试剂结合以检测革兰氏阴 性菌或革兰氏阳性菌。将硫酸多粘菌素B探测剂在轻微搅拌下与试验样品进行混合以便结 合至细菌。使用聚二乙炔脂质体来检测未结合的多粘菌素，从而间接地检测试验样品中的 细菌量。当未结合的多粘菌素与聚二乙炔脂质体结合时，聚二乙炔传感器组件发生颜色变 化，其中颜色变化与试验样品中的细菌浓度成反比。在一个实施例中，本发明的方法包括在缓冲组合物中提供包含分析物的试验样 品、在缓冲组合物中提供探测剂、将试验样品与探测剂进行混合(其中与受体相比，所述探测剂对分析物具有较大的结合亲和力)以及利用生物传感器检测变化。在一些分析法中，可通过将分析物靶分成片段或者说是裂解以就地产生探测剂。 探测剂也可认为是存在于生物体的细胞壁上的外部蛋白或者蛋白片段，所述生物体可用于 直接与传感器相互作用。探测剂和分析物之间的相互作用可有效替代与脂质体的相互作 用。作为另外一种选择，探测剂可与分析物相互作用以形成复合体，且所得的复合体与脂质 体发生相互作用。可使探测剂与溶液中的或涂覆至基底上的传感器相接触。因此，可按照多种合适的方式来混合试验样品和探测剂。在一个方面，作为单独的 部分以任何顺序将探测剂提供至传感器并且将试验样品提供至比色传感器。例如，表面可 利用含多粘菌素的溶液进行涂覆并且可任选地进行干燥。在另一方面，将试验样品和探测 剂混合成混合物并且将该混合物提供至比色传感器。在一个优选实施例中，探测剂在接触 比色传感器之前与包含分析物的试验样品相互作用。利用间接检测方法，可以根据所用探测剂的浓度实现低浓度检测的高灵敏度。针 对检测策略，可选择对应于检测的所需浓度水平的探测剂浓度。利用探测剂进行间接检测 的方法允许以探测剂的类型和浓度为基础来设计系统，以便在给定应用中具有所需的灵敏 度。这使得转导物对多种所关注的分析物是通用的。例如，可根据探测剂对分析物的亲和 力来改变与转导物接触的探测剂，从而使得单个转导物(聚二乙炔/受体结合体)可用于 检测多种分析物。在某些实施例中，可将比色传感器提供在单个小瓶系统内的溶液或悬浮液中，其 中可将分析物直接加入到含有溶液的小瓶中，该溶液具有对所关注分析物特异性的转导 物」。作为另外一种选择，所述系统可包括套盒内的多个小瓶，且每个小瓶含有具有下述聚 二乙炔组分的转导物，所述聚二乙炔组分结合有对不同分析物具有特异性的受体。对于其中不能将分析物直接加入到聚二乙炔转导物上的那些应用，可使用两部分 的小瓶系统。小瓶的一个隔室可含有用于分析物样品制备的试剂，其与含有由聚二乙炔组 分形成的转导物的第二隔室物理隔开。一旦样品制备完成后，就将分隔各个隔室的物理屏 障移除，使得分析物与转导物混合以用于检测。作为另外一种选择，套盒还可包括小瓶以用于试剂存储以及在分析物接触涂覆在 二维基底上的比色传感器之前对其进行混合。在一个实施例中，套盒可包括用于试剂存储 和分析物制备的小瓶，且具有包含本发明的涂覆在基底上的转导物的顶盖系统。然后可通过以下方式将比色传感器的溶液或悬浮液涂覆至固体基底上对基底点 样并且使液体载体(如，水)蒸发。合适的基底可包括高度平坦的基底，例如原子级平坦硅 (111)晶片上的蒸镀金、原子级平坦硅(111)晶片或浮法玻璃，这些基底是裸露的并且可利 用自组装单层(SAM)进行修饰以通过系统方式来改变它们的表面能；或者具有高度纹理化 的表面特征的基底，包括纸基底、聚合物型吸墨涂层、结构化的聚合物膜、微孔膜以及隔膜 材料。作为另外一种选择，可将比色传感器的溶液或悬浮液通过具有合适孔尺寸的隔膜 挤出，以捕集聚二乙炔组分并且产生涂覆隔膜，随后允许将其干燥。合适的隔膜通常为具有 200nm或更小的孔尺寸的那些膜，包括诸如聚碳酸酯、尼龙、PTFE、聚乙烯(也可列出其他材 料)之类的材料。可利用二乙炔组分的聚合悬浮液来涂覆这些基底，或者悬浮液可以未聚合形式进行涂覆并且随后在涂覆态中进行聚合。传感器的涂层重量通常影响传感器的灵敏度。理想 的是，应当设计涂层重量以使其在合理的时间段内与分析物结合并且产生可察觉的变化。 涂层重量还应优选在整个基底上是均一的，以将例如试验样品均勻地暴露给传感器组件。可使用比色传感器的各种形式，包括例如条带或标签形式。参见如美国专利申请 公开 No. 2004/132217。在某些实施例中，可将本发明的比色传感器与其他已知的诊断方法进行配对使 用，以提供细菌或其他分析物存在与否的多元化确定方法。鍾本发明不应被认为仅限于下文所述的具体实例，相反，应被理解为覆盖所附权利 要求书中所明确提出的本发明的各个方面。对于本发明所涉及的领域的技术人员来说，一 旦阅读本说明书后，本发明适用的多种修改形式、等同工艺和多种结构将是显而易见的。除 非另外指明，否则本说明书的实例和其余部分的所有份数、百分数、比率等均按摩尔计。所 有未指明供应商的溶剂和试剂均购自Aldrich Chemical (Milwaukee，WI)。使用电阻率为 18. 2M 欧姆 / 厘米的 U-V Milli-Q 纯水器(Millipore (Bedford, MA))来纯化水。通过测量色彩角(h° )来表征得自聚二乙炔指示剂的色度反应。h°值在0°至 360°的范围内，其大致测量给定颜色的RGB(红、率、蓝)值。纯红对应于0°的h°值，纯 绿对应于120°的h°值，并且纯蓝对应于240°的h°值。色环为连续的，因此从360° 到0° (这两个值均对应于纯红)之间不存在间断。优选的聚二乙炔指示剂的平均动态 范围涵盖了从大约260° (蓝色相)至大约360° (红色相)的色彩角区间。h°值的测 定方式为利用商用的分光光度计(得自Wilkens-anderson公司(Chicago，ILAvantes)的 AvaSpec-2048-SPU2-SD256)直接测量颜色。缩写表
缩写或商品名说明ATCC公司美国模式培养物保藏所DMPC1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC，式量(F. W.)为678，可得 自 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)HEPESN-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸，可得自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)PBS缓冲液通过将得自 EMD Biosciences (San Diego, CA)的 IOxPBS 浓缩液稀释 10 倍制备的磷酸盐缓冲(PBS)溶液PBS L64缓冲液通过获取PBS缓冲溶液并且加入0.2% (w/v)的PLURONIC L64制得PLURONIC L64得自BASF公司(Mount Olive, NJ)的表面活性剂的商品名制备实例1-经抗体官能化的磁珠的制备鼠抗蛋白A单克隆抗体MAb-107描述于2006年11月22日提交的美国专利申请
31序列No. 11/562，747中以及PCT申请No. US2007/084, 739中，这两者的名称均为“具有蛋白 A 选择性的抗体” ("ANTIBODY WITH PROTEIN A SELECTIVITY”)。用于炭疽芽孢杆菌(目录号J-260800-01批号0016N2B-8和001I60FQ-兔 抗-炭疽芽抱杆菌)的抗体得自 Edgewood Chemical and Biological Center (Edgewood, Maryland)。所有的抗体制剂均利用得自Pierce的EZ-Link NHS-PE04-生物素(产品号 21330)根据厂商的说明进行生物素化。经链霉抗生物素涂覆的磁性颗粒(Iym的Dynal Tl)得自Invitrogen公司(Carlsbad，CA)。除非另外指明，否在所有的反应和洗涤均在PBS L-64缓冲液(含有0.2% w/vPLURONIC L64的磷酸盐缓冲溶液)中进行。除非另外指明， 否则洗涤步骤包括三次连续的洗涤。洗涤过程包括将磁铁放置在试管附近以将颗粒吸引至 试管中靠近磁铁的一侧、利用邻近的磁铁从试管中移除液体、并且加入等体积的新鲜缓冲 液以代替移除的液体。移除磁体以允许再悬浮并且混合颗粒。将浓度为2. 5毫克/毫升(mg/mL)的经链霉抗生物素涂覆的磁性颗粒与生物素化 的抗体制剂在500微升(yL)的PBS L-64缓冲液中混合。抗体相对结合颗粒的质量比为 4(^8抗体/!^颗粒。将所得的混合物在37°C下孵育1小时(hr)。然后，在PBS L-64缓冲 液中洗涤颗粒以移除未结合的抗体。完成最终洗涤之后，将颗粒进行再悬浮以达到2. 5mg/ mL的颗粒浓度。狐糊2- IimtfHMijMmiI金黄色葡萄球菌可以商品名ATCC 25923得自美国模式培养物保藏所 (Rockville, MD)。使该细菌在肉汤培养物中生长过夜(在37 °C下17-22小时)，所 述肉汤培养物是通过接种具有细菌的5-10毫升制备的、无菌的胰酶大豆肉汤(Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA))来制备的。通过离心(在 Eppendorf 的型号 5804R 的离 心机(Brinkman Instruments (ffestbury, NY))中以 8，000-10，OOOrpm 离心 15 分钟)来洗 涤培养物，将其再悬浮于PBS L64缓冲液中，并且利用此溶液通过离心作用洗涤另外的3个 循环。ffeH^^M 3- ^^giHiMMff^a^TfeH^表皮葡萄球菌可以商品名ATCC 12228得自美国模式培养物保藏所(Rockville， MD) 0使该细菌在肉汤培养物中生长过夜(在37°C下17-22小时)，所述肉汤培养物是通 过接种具有细菌的5-10毫升制备的、无菌的胰酶大豆肉汤(Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA))来制备的。通过离心(在Eppendorf的型号5804R的离心机(Brinkman Instruments (ffestbury, NY))中以8，000-10, OOOrpm离心15分钟)来洗涤培养物，将其再 悬浮于PBS L64缓冲液中，并且利用此溶液通过离心作用洗涤另外的3个循环。ffeH^^M 4-苏芸金芽朐,杆Ifffl子;i:浮液的泡丨备苏芸金芽胞杆菌生物体可以商品名ATCC 10792得自美国模式培养物保藏所 (Rockville, MD)。生物体最初的培养通过在营养琼脂平面上进行划线接种并且在37°C下 孵育过夜来培养。为了生成孢子，将IOmL的Shaeffer孢子形成培养基接种，该培养基得自 约3至5个分离的菌落边缘的材料。使用涡旋将细胞完全悬浮。将该悬浮液在37°C以及搅 拌条件下孵育18小时。当细胞的大部分含有孢子时并且在大量细胞已出现裂解之前，收集 生物体。通过在15，OOOXg和4°C下离心(Eppendorf型号5804R离心机，可得自BrinkmanInstruments (ffestbury, NY)) 30分钟来采集孢子，并且将其悬浮于35mL的冷(4°C )蒸馏 H2O中。然后将孢子在6，OOOXg和4°C下离心10分钟，并且在冷(4°C )蒸馏H2O中洗涤四 次。利用冷蒸馏水洗涤之后，将孢子在6，OOOXg和4°C再次离心10分钟，并且将其悬浮于 在IOmL的冷(4°C ) IM KHPO4缓冲液(pH为7. 1)中。然后将IM KHPO4缓冲液(pH为7. 1) 内的孢子转移至12mL的冷(4°C)聚乙二醇(PEG)中，以便在1，500 X g和4°C下通过离心2 分钟来移除营养细胞以及碎片。移除上部PEG层内的孢子并且利用5mLPEG进行额外的萃 取，共进行7次萃取。通过在12，OOOXg和4°C下离心15分钟来采集PEG纯化的孢子并且 将其利用35mL的冷(4°C )蒸馏水洗涤7次。将纯化的孢子制剂保藏在4°C的HPLC级H2O 中。制备实例5-HEPES缓冲液的制备通过将1.30 克(g) HEPES 钠盐(F. W. (260. 29)，可得自 Aldrich Chemical (Milwaukee，WI))溶于IL水中来制备N_2_羟乙基哌嗪-N，-2-乙磺酸(HEPES) 缓冲液。这产生了 5mM的缓冲液盐浓度。然后通过逐滴加入盐酸或乙酸(二者均可得自 Aldricemical (Milwaukee, WI))将缓冲溶液滴定至 pH = 7. 2。制各实例6-含有PLURONIC L64 _冲液的磷酸盐_冲液(PBS-L64 _冲液)的制 备通过将IOxPBS浓缩物液(可从EMD Biosciences (San Diego, CA)商购获得)稀 释10倍来制备磷酸盐缓冲液(PBS)溶液。这产生了含有下述盐组成的PBS缓冲溶液10mM 磷酸钠、137mM氯化钠、2.7mM氯化钾。此PBS缓冲溶液在25°C下具有7. 5的pH。为了制备 含有PLURONIC L64溶液的磷酸盐缓冲液(PBS-L64缓冲溶液)，将0. 2% (w/v)的PLUR0NIC L64表面活性剂(可得自BASF公司(Mount Olive,NJ))加入到PBS缓冲溶液中。此PBS-L64 缓冲溶液在25°C下具有7. 5的pH。吿彻丨7-mmmmm β溶液的吿m硫酸多粘菌素B(PmB，式量(F. W.)为 1385，可得自 Sigma-Aldrich (St. Louis,MO)) 母液的制备方式为在搅拌条件下将7. 2Img的PmB加入到IOmL的HEPES缓冲液(按照制备 实例5进行制备)中，直至肽实现完全溶解。这产生了 520纳摩尔/毫升的最终硫酸多粘 菌素B溶液浓度。制备实例8-聚二乙炔脂质体悬浮液的制备二乙炔，HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C = C-C = C (CH2) 40 (0) C (CH2) 12CH3，是按美国专 利申请公开No. 2004/0132217的实例6制备的。基本工序包括使5，7-十二烷二炔-1，12-二 醇(HO(CH2)4C ε c-c Ξ c(CH2)4OH)与十四碳酰氯反应并且随后使该产物与琥珀酐反应以产 生白色固体二乙炔，HO(O)C(CH2)2C(O)O(CH2)4C = C-C = C(CH2)4O(O)C(CH2)12CH30将二 乙炔化合物的(6 4)混合物HO (O)C (CH2)2C(O) O(CH2)4C = C-C = C (CH2)4O (O)C (CH2)12CH3 (琥珀酸单-(12-十四酰氧基-十二-5，7-二炔 基)酯)以及两性离子的磷脂1，2_ 二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC，式量(F. W.) 为678，可得自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO))，称重并放入玻璃小瓶中并且使其悬浮于水 (pH为5. 8)中以产生ImM的溶液。然后将此溶液利用Misonix XL202探头超声波破碎仪 (可从Misonix公司(FarmingtomNY)商购获得)进行探头超声处理2分钟，并且在4°C的 冰箱中放置约20小时。此过程导致稳定脂质体悬浮液的形成。
制备实例9- 二乙炔脂质体悬浮液的聚合通过下述方式聚合在制备实例8中制备的悬浮液首先在水中1 10稀释，然后 利用Fusion UV系统(Gaithersburg，MD)的高功率(250兆焦耳)的UV工位对稀释样品进 行UV照射(在254nm的波长下以50英尺/分钟(0. 254米/秒)通过3次)。作为另外 一种选择，可通过下述方式聚合在制备实例6中制备的悬浮液在水中1 10稀释并且在 254nm 的 UV 灯(可从 VWR Scientific Products (West Chester, PA)商购获得)下 3cm 距 离处照射稀释样品35分钟。这两种方法均导致可观察到蓝色(蓝色相)，且色彩角通常在 260°至270°的范围内。此处通常使用IOmL体积的稀释脂质体悬浮液来进行聚合反应。制备实例10-流体系统的制备在本分析法中使用的流体系统基本为流通系统。该系统包括空白的96-孔3M Empore过滤板(No. 6060，过滤器PPT小体积96-孔的提取板，可得自3M Filtration Products (St. Paul, MN))，其中每个孔填充有1_厘米(cm)直径的HT Tuffryn 450隔膜 盘(亲水性聚砜450nm隔膜，可得自Pall公司(Ann Arbor, MI))，这种隔膜盘是从较大的 隔膜片材中钻孔而得并且利用乙烯基胶带(Scotch Super 33 Plus乙烯基电气条带，可得 自3M公司(St. Paul，MN))进行掩蔽，以便精确限定8mm2。的过滤面积。使用聚丙烯套圈 (可得自3M Filtration Products (St. Paul, MN))将掩膜隔膜盘固定在96孔板中每个孔 的底部上.将制备的板与真空歧管(可得自3M Filtration Products (St. Paul, MN)) 一 起使用，以便调节真空来产生100和250 μ L/分钟之间的流速。利用此流体系统过滤得自 完全分析法的脂质体悬浮液，从而在孔底部的隔膜盘上形成涂层。利用配备有光纤探测 剂(置于96孔板的孔内)的商用分光光度计(AvantesAvaSpeC-2048-SPU2-SD256，可得自 Wilkens-anderson公司(Chicago，IL))直接测定脂质体涂层的色彩角。ffeH^^M 11- 二乙炔H旨JIH本;icff液涂布样品的泡丨备利用Biodot 涂层机(可得自 Biodot Corporation (Irvine, CA))将制备实例 8 中 制备的悬浮液以100 μ L/cm2的涂层重量涂覆至孔直径为200 (nm)的多孔聚碳酸酯隔膜(可 得自Avestin公司(Ottawa，Canada))上。将涂覆隔膜以涂覆层朝上的方式设置在载玻片上 并且将其在5°C的冰箱中放置至少3小时。然后将该样品在含有CaSO4的干燥器中干燥30 分钟并且利用 254 纳米(nm)的 UV 光(可从 VWR Scientific Products (West Chester, PA) 商购获得)照射30-90秒以聚合经涂覆的二乙炔脂质体。从此涂覆的、聚合的隔膜中钻出直 径为Icm的圆形样品并且利用双面胶带(可得自3M Stationary Products Division (St. Paul, MN))将其层合至聚碳酸酯24孔板(可得自VWR Scientific Products (West Chester, PA))的底部上。制备实例12-醋酸氯己定溶液的制备通过以下方式来制备醋酸氯己定母液(CHdiA，式量(F. W.)为625. 55，可得自 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO))将1. 564毫克CHdiA在搅拌条件下加入到100毫升的 HEPES缓冲液(如制备实例5中制备的)中，直至固体达到完全溶解。这产生了 25纳摩尔 /毫升的最终CHdiA溶液浓度。实例1-15-金黄饩葡萄球菌的检测用于检测金黄色葡萄球菌的分析法的如下进行(1)将利用MAb 107抗体(按照制备实例1进行制备)官能化的三十二(32) μ 1
34磁珠悬浮液加入到聚丙烯微量离心管(可得自VWRScientific (West Chester, PA))中。将 468 μ L给定浓度(记录于表1中)的处于PBS-L64缓冲液(按照制备实例2和6进行制 备)中的金黄色葡萄球菌悬浮液加入到同一微量离心管中。在利用Barnstead LabQuake 摇动器(可得自Barnstead International (Dubuque, ΙΑ))进行摇摆搅拌的条件下，将该混 合物在室温下孵育15分钟。(2)然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具(可得自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA))中放置至少5分钟来分离并且聚集微珠。在不干扰凝集微珠的情况下通 过微量吸管移除上清液。(3)然后通过将0. 5mL的HEPES缓冲液(如制备实例5中所述)加入到该管中并 且利用摇摆移动搅拌5分钟来洗涤微珠。然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具中放 置至少5分钟来再次分离并且聚集微珠。在不干扰凝集微珠的情况下通过微量吸管移除洗 涤溶液。将此洗涤步骤重复进行第二次。(4)将给定体积(记录于表1中)的多粘菌素B母液(按照制备实例7制备)加 入到洗涤的磁珠中。然后将此微量离心管涡旋10秒，并使其静置5分钟。接下来，将0. 5mL 的HEPES缓冲液加入到此管中并且将该溶液再搅动5分钟。(5)然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具中放置至少5分钟来再次分离并 且聚集微珠。然后将上清液微量吸移至新的微量离心管中，并且将给定体积(记录于表1 中)的PDA脂质体溶液(按照制备实例8和9制备)加入到此管中。将此管轻轻地摇动1 分钟。(6)将此溶液吸移到3M Empore 96孔板(按照制备实例10进行制备)的孔的至 少一个内并且在真空下进行过滤以捕集和浓缩PDA脂质体。一旦将样品溶液的整个体积都 过滤后，就使用AVENTIS仪器(按照制备实例10制备)来测定色彩角。将三次重复测定的 平均色彩角(h° )记录于表1中。另外由下述方程给出的色度反应也记录于表1中
CRh_ 色彩角(阴性对照)-色彩角(样品) —色彩角(阴性对照)-色彩角(阳性对照)，其中实例1用作所有其他试验的阳性对照(色彩角(阳性对照))，并且实例2-6 是对应的实例7-15 (色彩角(样品))的阴性对照(色彩角(阴性对照))。大的色度反应 表明细菌检测为阳性。色度反应记录值的1 σ标准偏差为士 10%。这些实例证明了对于试 剂(PmB)和PDA脂质体的不同组合检测一定浓度范围内的靶生物体的能力。表 1。
实例16-20-在存在表皮葡萄球菌的情况下检测金黄色葡萄球菌在存在表皮葡萄球菌的情况下检测金黄色葡萄球 菌的分析法是按照实例1-15中所述来进行的，并且将包含表皮葡萄球菌的样品(按照制备 实例3制备)混合到包含金黄色葡萄球菌的溶液中，以便证明在存在显著浓度的干扰生物 体(表皮葡萄球菌)的情况下(金黄色葡萄球菌)的检测。将三次重复测定的平均色彩角 (h° )以及对应的色度反应记录于表2中。色度反应记录值的1σ标准偏差为士 15%。表 2。
实例16-20-苏芸金芽胞杆菌的检测检测苏芸金芽胞杆菌的分析法是按照实例1-15所述来进行的，其利用 J-260800-01经抗体官能化的磁珠(按照制备实例1制备)以及作为靶生物体的苏芸金芽 胞杆菌(按照制备实例4制备)。这些实例证明了通过替换合适的样品制剂系统来检测不 同的靶生物体的能力。将三次重复测定的平均色彩角(h° )以及对应的色度反应记录于表 3中。色度反应记录值的1 σ标准偏差为士 10%。表 3。 割列28-31-利用代替PmB的CHG和经凃覆的PDA指示剂来检测丨金11色葡萄球菌用于检测金黄色葡萄球菌的分析法的如下进行(1)将利用MAb 107抗体(按照制备实例1进行制备)官能化的三十二(32) μ 1 磁珠悬浮液加入到聚丙烯微量离心管(可得自VWRScientific (West Chester, PA))中。将 468 μ L给定浓度(记录于表1中)的处于PBS-L64缓冲液(按照制备实例2和6进行制 备)中的金黄色葡萄球菌悬浮液加入到同一微量离心管中。在利用Barnstead LabQuake 摇动器(可得自Barnstead International (Dubuque, ΙΑ))进行摇摆搅拌的条件下，将该混 合物在室温下孵育15分钟。(2)然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具(可得自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA))中放置至少5分钟来分离并且聚集微珠。在不干扰凝集微珠的情况下通 过微量吸管移除上清液。(3)然后通过将0. 5mL的HEPES缓冲液(如制备实例5中所述)加入到此管中并且利用摇摆移动搅拌5分钟来洗涤微珠。然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具中放 置至少5分钟来再次分离并且聚集微珠。在不干扰凝集微珠的情况下通过微量吸管移除洗 涤溶液。将此洗涤步骤重复进行第二次。(4)将一(l)mL的CHG母液(按照制备实例12进行制备)加入到洗涤的磁珠中。 然后将此微量离心管涡旋10秒，并使其静置5分钟。然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具中放置至少5分钟来再次分离并且聚 集微珠。然后将上清液吸移到含有经涂覆的PDA指示剂的24孔板(按照制备实例11制 备)的孔的至少一个内。将此24孔板在Eberbach Model 6000摇动器(Eberbach公司(Ann Arbor,MI))上进行摇动。在60分钟时利用数字照相机拍摄图像。利用得自Adobe Systems Incorporated(商品名ADOBE PHOTOSHOP版本5. 0 (San Jose, CA))的软件分析该图像以提 取PDA指示剂的色彩角。将三次重复测定的平均色彩角(h° )以及对应的色度反应记录于 表4中。色度反应记录值的标准偏差为士 10%。这些实例证明了利用不同的试剂(利 用CHG代替PmB)以及经涂覆的指示剂(固体相对溶液相检测)来检测靶生物体的能力。表 4。 t仿I丨32-34-在用干重点照护应用的一次+牛检测丨设各Φ检测丨金H卢,葡萄球菌图3示出了具有传感器层或部分130以及流通隔膜460的检测设备450，其中该 设备的主体是由多层结构形成的。如图所示，此多层构造包括表面层或第一外层454、背衬 层或第二外层456以及一个或多个中间层。在示出的实施例中，传感器组件100支承在穿 过中间层458的开457附近。传感器层或部分130设置在隔膜460上，该隔膜连接到邻近 开口 457的中间层458处。中间层458为水不可渗透的。此多层结构还包括设置在表面层 454和中间层458之间的隔层462。将隔层462进行图案化以形成入口 464以及第一流体 通道部分。吸收层466设置在中间层458和背衬层456之间且邻近开口 457，从而促使流体 穿过传感器通道进行流动，所述传感器通道是通过开口 457内的流通隔膜460形成的。如上所述，第一流体通道部分是由沿表面层454和中间层458之间的多层结构长 度进行取向的通道形成的，以便提供沿第一方向的流动。此设备还包括横越第一流体通道 部分形成的第二流体通道部分，以便提供沿第二方向的流动，所述第二方向大致横越流通 隔膜460的第一方向。在示出的实施例中，表面层454是由透明的或可看透的薄膜形成的，使得传感器组件100是可见的以便观察分析物与传感器组件100反应时的可检测颜色 变化。作为另外一种选择，表面层454的一部分是透明的或可看透的以便观察传感器组件 100。在示出的实施例中，使流体流动跨过流通隔膜460且穿过吸收层466。可将层466 进行图案化以形成流通隔膜460下游的吸收区域，从而形成横向的流动通路或通道。尽管 图3示出了单独的背衬层或外层456，但在可供选择的实施例中，吸收层466可形成设备的 背衬层，并且本申请不限于所示的特定层。在示出的实例中的每一个中，将试验样品暴露给传感器组件100的时间或间期是 受限的，这取决于试验样品跨过传感器组件100的流速。一旦流体流过传感器组件100，就 不再将其暴露给传感器层或部分，从而限制将试验样品暴露给传感器组件100以便提供相 对稳定的试验结果，这样就不会显著改变试验的下述结论。对于这些实例，上述设备是利用以下材料进行构造的层456为乙烯基胶带 (Scotch Super 33Plus乙烯基电气胶带，可得自3M公司(St. Paul, MN))，层466为玻璃纤 维芯吸材料(Sterlitech GB 140玻璃纤维，可得自Sterlitech公司(Kent，WA))，层460为 450nm的多孔性聚醚砜隔膜(Pall Supor 450隔膜，可得自Pall公司(Ann Arbor, MI)), M 458为一侧具有压敏粘合剂的1/32英寸厚PVC背衬材料(Diagnostic Consulting Network Miba-010，可得自 Diagnostic Consulting Network (Irvine，CA))，层 462 为两侧均具有压 敏粘合剂的1/16英寸厚的3M聚乙烯吹塑泡沫(可得自3M Medical Division，3M公司(St. Paul, MN))，并且层454为3M的聚酯通用透明膜(可得自3M公司(St. Paul, MN))。为了构造检测设备，利用转动模具将薄膜层中的每一个冲切成其合适的形状和尺 寸。此组装开始于将流通过滤隔膜460设置在中间层458粘合剂侧的开口 457上。接下 来，将吸收层466设置在过滤隔膜上并且布置在中间层458粘合剂侧的开口 457上。然后 将此初始层合材料以吸收层466在下的方式布置在背衬层456的粘合剂侧，同时在边缘施 加压力以确保背衬层456在吸收层466周围粘附至中间层458，从而形成密封件。接下来， 将隔层462 —侧的衬片移除并且将隔层462的粘合剂侧层合至中间层458的非粘合剂侧。 最后，将隔层462另一侧的衬片移除并且将外层454层合至隔层462的粘合剂层。使用穿 刺针在样品室的顶部产生两个排放孔。为了测试检测设备，根据下述方案来进行检测金黄色葡萄球菌的分析法(1)将利用MAb 107抗体(按照制备实例1制备)官能化的三十二(32) μ 1磁 珠悬浮液加入到聚丙烯微量离心管(可得自VWR Scientific (West Chester, PA))中。将 484 μ L给定浓度(记录于表1中)的处于PBS-L64缓冲液(按照制备实例2和6制备)中 的金黄色葡萄球菌悬浮液加入到同一微量离心管中。在利用Barnstead LabQuake摇动器 (可得自Barnstead International (Dubuque, ΙΑ))进行摇摆搅拌的条件下，将该混合物在 室温下孵育15分钟。(2)然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具(可得自Invitrogen公司 (Carlsbad, CA))中放置至少5分钟来分离并且聚集微珠。在不干扰凝集微珠的情况下通 过微量吸管移除上清液。(3)然后通过将0. 5mL的HEPES缓冲液(如制备实例5中所述)加入到此管中并 且利用摇摆移动搅拌5分钟来洗涤微珠。然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具中放置至少5分钟来再次分离并且聚集微珠。在不干扰凝集微珠的情况下通过微量吸管移除洗 涤溶液。将此洗涤步骤重复进行第二次。(4)将给定体积(记录于表1中)的多粘菌素B母液(按照制备实例7制备)加 入到洗涤的磁珠中。然后将此微量离心管涡旋10秒，并使其静置5分钟。接下来，将0. 5mL 的HEPES缓冲液加入到此管中并且将该溶液再搅动5分钟。(5)然后通过将此微量离心管在Dynal磁力夹具中放置至少5分钟来再次分离并 且聚集微珠。然后将上清液微量吸移至新的微量离心管中，并且将给定体积(记录于表5 中)的PDA脂质体溶液(按照制备实例8和9制备)加入到此管中。将此管轻轻地摇动1 分钟。(6)将溶液吸移至检测设备的至少一个内。此时，该溶液开始穿过流通隔膜利用毛 细管作用进行过滤，并且在隔膜上采集和聚集PDA脂质体。一旦样品溶液的整个体积均被 过滤并且样品室已完全排放后，就使用Aventis 仪器(按照制备实例10制备)来测定色 彩角。将三次重复测定的平均色彩角(h° )记录于表5中。另外由下述方程给出的色度反 应也记录于表5中
eRh 二色彩角(阴性对照)-色彩角(样品) _色彩角(阴性对照)-色彩角(阳性对照)，其中实例32是所有其他试验的阳性对照(色彩角(阳性对照))，并且实例33是 对应的实例34(色彩角(样品))的阴性对照(色彩角(阴性对照))。大的色度反应表明 细菌检测为阳性。色度反应记录值的1 σ标准偏差为士 10%。这些实例证明了在检测设备 中检测靶生物体的能力。表 5。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物以及核酸和蛋白质数据库条款(包括(例 如)GenBank登录号)的完全公开内容全部以引用方式并入本文，如同每个都单独引入一 样。不脱离本发明的保护范围和精神的本发明的各种修改和更改对本领域内的技术人员将 变得显而易见，并且应当理解本发明并非不当地限制于本文提出的示例性实施例。
权利要求
一种分析细菌样品的方法，所述方法包括提供疑为包括具有特定细菌的特性的一种或多种不同分析物的样品；提供对具有所述特定细菌的特性的一种或多种不同分析物具有抗原特异性的一种或多种抗体；提供固体载体材料；在能有效捕集一种或多种具有特定细菌的特性的分析物，如果存在的话，的条件下使所述样品、所述固体载体材料和所述一种或多种抗体接触；提供包括聚合组合物的比色传感器，所述聚合组合物包含含二乙炔聚合物和受体，其中所述受体结合到所述聚合组合物中以形成转导物，所述转导物在与一种或多种探测剂和/或分析物结合时提供颜色变化；任选地，从所述固体载体材料中移除所述一种或多种分析物，如果存在的话；以及在捕集和任选地移除所述一种或多种分析物之后，通过所述比色传感器对所述一种或多种分析物，如果存在的话，进行直接或间接分析，以便分析出所述特定细菌的存在与否。
2.根据权利要求1所述的方法，其中使所述样品、所述固体载体材料和所述一种或多 种抗体接触包括使所述样品、所述固体载体材料和所述一种或多种抗体同时接触。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述一种或多种抗体附着至所述固 体载体材料形成分析物结合材料，并且所述方法包括在能有效捕集一种或多种具有特定细 菌的特性的分析物，如果存在的话，的条件下使所述样品和所述分析物结合材料接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分析物结合材料包含对具有所述特定细菌的 特性的两种或多种不同分析物具有抗原特异性的两种或多种抗体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗体为单克隆的、多克隆的或它们的组合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的 RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAbl2-9、它们的片段以及它们的组合。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述分析物结合材料包括具有至少 两部分的颗粒材料，其中颗粒材料的一部分具有对其上设置的一种分析物有特异性的一种 抗体，并且第二部分具有对其上设置的不同分析物有特异性的不同抗体。
8.根据权利要求3至6中任一项所述的方法，其中所述固体载体材料包括颗粒材料，其 中所述颗粒材料中的每个颗粒具有结合其上设置的不同分析物的至少两种抗体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述固体载体材料包括磁性颗粒。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中还包括提供介导所述分析物和所述 转导物之间的相互作用的缓冲组合物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中具有特定细菌的特性的所述一种 或多种分析物存在于全细胞上。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述特定细菌包括革兰氏阳性菌。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述特定细菌包括金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)0
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法包括通过所述比色传感器对 所述一种或多种分析物，如果存在的话，进行直接分析。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，所述方法还包括在间接分析法中使用一种或多种探测剂。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括 提供一种或多种探测剂；在捕集之前、捕集之后或者在从所述固体载体材料中任选地移除之后，提供使所述探 测剂有效结合至所述一种或多种分析物，如果存在的话，的条件；以及使所述未结合的探测剂与所述比色传感器接触以分析所述特定细菌的存在与否。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述一种或多种探测剂包括多粘菌素。
18.据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品为含粘液样品。
19.据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品包括尿液样品、伤口渗出液 或者培养血液。
20.一种分析细菌样品的方法，所述方法包括提供包含全细胞的样品，所述全细胞疑为包括一种或多种具有特定细菌的特性的不同 分析物；提供包含磁性颗粒的分析物结合材料，其中所述磁性颗粒具有在其上设置的一种或多 种抗体，所述一种或多种抗体对具有所述特定细菌的特性的一种或多种不同分析物具有抗 原特异性；提供包括聚合组合物的比色传感器，所述聚合组合物包含至少一种含二乙炔聚合物和 受体，其中所述受体结合到所述聚合组合物中以形成转导物，所述转导物在与一种或多种 探测剂和/或分析物结合时提供颜色变化；在能有效捕集一种或多种具有特定细菌的特性的分析物，如果存在于所述全细胞上的 话，的条件下使所述样品和所述分析物结合材料接触；任选地，从所述分析物结合材料中移除所述一种或多种分析物，如果存在的话；以及 在捕集和任选地移除所述一种或多种分析物之后，通过所述比色传感器对所述一种或 多种分析物，如果存在的话，进行直接或间接分析，以便分析出所述特定细菌的存在与否。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述抗体选自MAb-76、MAb_107、亲和纯化的 RxClf40、亲和纯化的GxClf40、MAb 12-9、它们的片段以及它们的组合。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的方法，其中所述特定细菌包括革兰氏阳性菌。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述特定细菌包括金黄色葡萄球菌。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其包括通过所述比色传感器对所述一 种或多种分析物，如果存在的话，进行直接分析。
25.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其还包括在间接分析法中使用一种或 多种探测剂。
26.根据权利要求25所述的方法，其还包括 提供一种或多种探测剂；在捕集之前、捕集之后或者在任选地从所述固体载体材料中移除之后，提供使所述探 测剂有效结合至所述一种或多种分析物，如果存在的话，的条件；以及使所述未结合的探测剂与所述比色传感器接触以分析所述特定细菌的存在与否。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种探测剂包括多粘菌素。
28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述磁性颗粒包括至少两部分， 其中磁性颗粒的一部分具有对其上设置的一种分析物有特异性的一种抗体，并且第二部分 具有对其上设置的不同分析物有特异性的不同抗体。
29.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述分析物结合材料中的每个磁 性颗粒具有结合其上设置的不同分析物的至少两种抗体。
30.根据权利要求20至29中任一项所述的方法，其中所述样品包括尿液样品、伤口渗 出液或者培养血液。
31.一种分析金黄色葡萄球菌样品的方法，所述方法包括提供包含全细胞的样品，所述全细胞疑为包括一种或多种具有金黄色葡萄球菌特性的 不同分析物；提供包含磁性颗粒的分析物结合材料，其中所述磁性颗粒具有在其上设置的一种或 多种抗体，所述一种或多种抗体对具有所述金黄色葡萄球菌特性的一种或多种不同分析物 具有抗原特异性；其中所述抗体选自MAb-76、MAb-107、亲和纯化的RxClf40、亲和纯化的 GxClf40、MAbl2-9、它们的片段以及它们的组合。提供包括聚合组合物的比色传感器，所述聚合组合物包含至少一种含二乙炔聚合物和 受体，其中所述受体结合到所述聚合组合物中以形成转导物，所述转导物在与一种或多种 探测剂和/或分析物结合时提供颜色变化；在能有效捕集一种或多种具有金黄色葡萄球菌特性的分析物，如果存在于所述全细胞 上的话，的条件下使所述样品和所述分析物结合材料接触；任选地，从所述分析物结合材料中移除所述一种或多种分析物，如果存在的话；并且在捕集和任选地移除所述一种或多种分析物之后，通过所述比色传感器对所述一种或 多种分析物，如果存在的话，进行直接或间接分析，以便分析出所述金黄色葡萄球菌的存在 与否。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述磁性颗粒包括至少两部分，其中磁性颗粒 的一部分具有对其上设置的一种分析物有特异性的一种抗体，并且第二部分具有对其上设 置的不同分析物有特异性的不同抗体。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述分析物结合材料中的每个磁性颗粒具有结 合其上设置的不同分析物的至少两种抗体。
34.根据权利要求31至33所述的方法，其中将所述磁性颗粒封闭以阻止所述比色传感 器中探测剂的非特异性结合。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述磁性颗粒是利用多粘菌素封闭的。
36.根据权利要求31至35所述的方法，所述方法还包括在所述分析物结合材料与所 述比色传感器接触之前将所述一种或多种具有金黄色葡萄球菌特性的分析物，如果存在的 话，从所述分析物结合材料中移除。
37.根据权利要求31至36所述的方法，所述方法包括通过所述比色传感器对所述一种 或多种分析物，如果存在的话，进行直接分析。
38.根据权利要求31至36所述的方法，所述方法还包括在间接分析法中使用一种或多 种探测剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述一种或多种探测剂包括多粘菌素。
40.根据权利要求31至39所述的方法，其中所述样品包括尿液样品、伤口渗出液或者培养血液。
全文摘要
本发明涉及分析所关注细菌样品的方法。具体地讲，本方法涉及包括使用一种或多种抗体的初始捕集过程，所述一种或多种抗体对具有所述特定细菌的特性的一种或多种不同分析物具有抗原特异性。在完成特定细菌的捕集之后，用于进行分析的技术涉及比色技术，具体地讲涉及使用包括聚二乙炔(PDA)材料的比色传感器。
文档编号G01N33/569GK101918842SQ200880125190
公开日2010年12月15日 申请日期2008年11月20日 优先权日2007年11月20日
发明者哲·M·卢, 小罗伯特·E·布雷南, 布林达·B·拉克希米, 希瑟·M·韦伯, 帕特里克·A·马赫, 斯里达尔·V·达萨拉塔, 玛拉·S·赖夫-温纳, 约瑟夫·J·斯托费尔, 约瑟夫·P·亨斯勒, 郭春梅, 马尔科·G·博马里托 申请人:3M创新有限公司